Name: assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues at JoVE.com

Vi vill tacka Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli och Sadegh Davoudi för att de bidragit till uppfinningen av myoTACTIC-kulturplattformen och fastställt de tillverknings- och analysmetoder som beskrivs häri. HL fick finansiering från ett naturvetenskapligt och tekniskt forskningsråd (NSERC) utbildningsprogram i Organ-on-a-Chip Engineering and Entrepreneurship Scholarship och ett University of Toronto Wildcat examensstipendier. PMG är Kanadas forskningsordförande i Endogen reparation och fick stöd för denna studie från Ontario Institute for Regenerative Medicine, Stem Cell Network, och från Medicine by Design, ett Canada First Research Excellence Program. Schematiska diagram skapades med BioRender.com.

1. PDMS MyoTACTIC platttillverkning
OBS: PDMS MyoTACTIC platttillverkning kräver en PU negativ mögel, som kan tillverkas som tidigarebeskrivits 30. Den datorstödda designen (CAD) SolidWorks-filen för MyoTACTIC-plåtdesignen har gjorts tillgänglig på GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).
<ol><li>Förbered ~ 110 g PDMS polymerlösning i en engångsplastkopp med förhållandet 1:15 mellan monomer och härdningsmedel med hjälp av ...

<ol>
	<li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+Muscle:+A+brief+review+of+structure+and+function.">Skeletal Muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li><li>McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy:+From+basic+mechanisms+to+gene+therapy.">Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).</li><li>Young, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoScreen,+a+high-throughput+phenotypic+screening+platform+enabling+muscle+drug+discovery.">MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).</li><li>DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+price+of+innovation:+New+estimates+of+drug+development+costs.">The price of innovation: New estimates of drug development costs.</a> Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture.">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle.">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drug+screening+with+contractile+muscle+tissue+engineered+from+dystrophic+myoblasts.">Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinted+human+skeletal+muscle+constructs+for+muscle+function+restoration.">3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).</li><li>Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+contractile+myofiber+sheets+as+a+platform+for+studies+of+skeletal+muscle+physiology.">Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Afshar Bakooshli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+culture+model+of+innervated+human+skeletal+muscle+enables+studies+of+the+adult+neuromuscular+junction.">A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction.</a> eLife. 8, 1-29 (2019).</li><li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs.">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).</li><li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale.">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).</li><li>Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D-printed+platform+for+modular+neuromuscular+motor+units.">A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).</li><li>Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+contractile+muscle+tissue+consisting+of+human+skeletal+myocyte+cell+line.">Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).</li><li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).</li><li>Gholobova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+skeletal+muscle:+a+novel+3D+in+vitro+model+for+drug+disposition+and+toxicity+after+intramuscular+injection.">Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).</li><li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue.">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li><li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li><li>Khodabukus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+increases+hypertrophy+and+metabolic+flux+in+tissue-engineered+human+skeletal+muscle.">Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle.</a> Biomaterials. 198, 259-269 (2019).</li><li>Nagashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+tissues+with+contractility+fabricated+by+immortalized+human+myogenic+cells.">In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells.</a> Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+skeletal+micro+muscle+platform+with+pacing+capabilities.">Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities.</a> Biomaterials. 198, 217-227 (2019).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+tissue+gauges+to+measure+and+manipulate+forces+from+3D+microtissues.">Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).</li><li>Pr&#252;ller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+delivered+in+their+niche+efficiently+generate+functional+myotubes+in+three-dimensional+cell+culture.">Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture.</a> PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).</li><li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators.">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+monitor+statin-induced+myopathy+in+individual+engineered+skeletal+muscle+myobundles.">A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).</li><li>Rajabian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+skeletal+muscle+as+a+model+of+muscle+aging+and+regeneration.">Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration.</a> Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).</li><li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength.">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).</li><li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+pathological+human+myoblasts:+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Bakooshli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+human+skeletal+muscle+innervated+with+stem+cell-derived+motor+neurons+enables+epsilon-subunit+targeted+myasthenic+syndrome+studies.">A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies.</a> BioRxiv. , 275545 (2018).</li><li>Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+highly+contractile+tissue-cultured+avian+skeletal+myotubes+in+collagen+gel.">Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.</a> Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle.">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li></ol>

Detta manuskript beskriver metoder för att fabricera och analysera en 3D hMMT-kulturmodell som kan tillämpas på studier av grundläggande muskelbiologi, sjukdomsmodellering eller för kandidatmolekyltestning. MyoTACTIC-plattformen är kostnadseffektiv, lätt att tillverka och kräver ett relativt litet antal celler för att producera skelettmuskelmikrotissuer. hMMTs som bildas inom MyoTACTIC-kulturplattformen består av justerade, multikärnor och strimmor myotuber och svarar på elektriska stimuli genom att initiera ...

Skelettmuskulaturen är en av de mest rikliga vävnaderna i människokroppen och stöder viktiga kroppsfunktioner som rörelse, värmehomeostas och metabolism1. Historiskt har djurmodeller och tvådimensionella (2D) cellodlingssystem använts för att studera biologiska processer och sjukdomspatogenes, liksom för att testa farmakologiska föreningar vid behandling av skelettmuskelsjukdomar2,3. Medan djurmodeller har avsevärt förbättrat vår kunskap om skelettmuskulatur i hälsa och vid sjukdom, har deras translationella inverkan hämmats av höga kostnader, etiska överväganden och interspecies skillnader2,4. När det gäller mänskliga cellbaserade system för att studera skelettmuskulatur är 2D-cellkultursystem gynnsamma på grund av deras enkelhet. Det finns dock en begränsning. Detta format misslyckas ofta med att rekapitulera cell-cell- och cell-extracellulära matrisinteraktioner som förekommer naturligt i kroppen5,6. Under de senaste åren har tredimensionella (3D) skelettmuskulaturmodeller dykt upp som ett kraftfullt alternativ till hela djurmodeller och konventionella 2D-odlingssystem genom att tillåta modellering av fysiologiskt och patologiskt relevanta processer ex vivo7,8. Faktum är att en mängd studier har rapporterat strategier för att modellera mänskliga skelettmuskler i ett bioartificialt 3D-kulturformat1. En begränsning för många av dessa studier är att aktiv kraft kvantifieras efter avlägsnandet av muskelvävnaderna från odlingsplattformarna och fastsättning vid en kraftgivare, som är destruktiv och därmed begränsad till att fungera som slutpunktsanalys9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Andra har utformat odlingssystem som möjliggör icke-invasiva metoder för att mäta aktiv kraft, men inte alla är mottagliga för molekyltestapplikationer med högt innehåll7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Detta protokoll beskriver en detaljerad metod för att tillverka mänskliga muskelmikrotissuer (hMMT) i skelettmuskeln (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) plattform; en 96 brunnsplatta enhet som stöder bulkproduktionen av 3D skelettmuskelmikrotissues30. MyoTACTIC platttillverkningsmetod möjliggör generering av en 96 väl polydimethylsiloxan (PDMS) odlingsplatta och alla motsvarande brunnsfunktioner i ett enda gjutsteg, varigenom varje brunn kräver ett relativt litet antal celler för microtissue-bildning. Mikrotissues som bildas inom MyoTACTIC innehåller justerade, strimmiga och multinukleära myotuber som är reproducerbara från brunn till brunn av enheten, och vid mognad, kan svara på kemiska och elektriska stimuli in situ30. Häri tekniken för att tillverka en PDMS MyoTACTIC kulturplatta enhet från en polyuretan (PU) replika, en optimerad metod för att genomföra odödliga mänskliga myogena stamceller för att tillverka hMMTs, och den funktionella bedömningen av konstruerade hMMT kraftgenerering och kalcium hantering egenskaper beskrivs och diskuteras.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Saline Solution, Sterile</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>1010</td>
			<td>10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2548-CABD305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Aminocaproic Acid, &#8805;99% (titration), Powder</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td>A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.35 mm ID Tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60985-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB1167 Myoblast Cell Line</td>
			<td>Institut de Myologie (Paris, France)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>Rigol</td>
			<td>DG1022Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Extract (Geltrex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14132-02</td>
			<td>Stored as aliquots of 50 &#181;L or 100 &#181;L at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vacuum Chamber</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D2672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC to Aligator Clip Cable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Plastics</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td>Includes culture plates, serological pipettes, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8418-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from Bovine Plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>F8630-5G</td>
			<td>Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 &#181;L of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Dimension</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Oven</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope - Camera Mount</td>
			<td>Labcam</td>
			<td>Labcam for iPhone</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 1cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2606-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 50cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2612-309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127, Powder, BioReagent</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane Negative Mold</td>
			<td>In House</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Release Agent</td>
			<td>Mann Release Technologies</td>
			<td>200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Vane Vacuum Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65401906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Almedic, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2586-M36-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Basal Medium</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23260</td>
			<td>30 mL aliquotes are generated and at stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23060</td>
			<td>42 mL aliquots are generated and stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartphone (iPhone)</td>
			<td>Apple</td>
			<td>SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Duty Dry Vacuum Pump</td>
			<td>Welch</td>
			<td>2546B-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization Bag</td>
			<td>Alliance</td>
			<td>211-SCM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble</td>
			<td>Igege</td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T6884-250UN</td>
			<td>100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 &#181;L aliquots are prepared and stored at - 20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin coated copper wire</td>
			<td>Arco</td>
			<td>B8871K48</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Thermo FIsher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Chamber 2</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42027-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues

Tredimensionella (3D) in vitro-modeller av skelettmuskulatur är ett värdefullt framsteg inom biomedicinsk forskning eftersom de ger möjlighet att studera skelettmuskelreformation och fungera i ett skalbart format som är mottagligt för experimentella manipuleringar. 3D muskelkultursystem är önskvärda eftersom de gör det möjligt för forskare att studera skelettmuskulatur ex vivo i samband med mänskliga celler. 3D in vitro modeller nära efterlikna aspekter av den inhemska vävnad struktur av vuxna skelettmuskulatur. Deras universella tillämpning begränsas dock av tillgången på plattformar som är enkla att tillverka, kostnads- och användarvänliga och ger relativt stora mängder mänskliga skelettmuskelvävnader. Dessutom, eftersom skelettmuskulaturen spelar en viktig funktionell roll som är nedsatt över tid i många sjukdomstillstånd, är en experimentell plattform för mikrotissuestudier mest praktisk när minimalt invasiva kalciumövergående och kontraktila kraftmätningar kan utföras direkt inom själva plattformen. I detta protokoll beskrivs tillverkning av en 96-väl plattform som kallas "MyoTACTIC", och en massproduktion av 3D mänskliga skelettmuskulaturmikrotissuer (hMMTs). Dessutom rapporteras metoderna för en minimalt invasiv tillämpning av elektrisk stimulering som möjliggör upprepade mätningar av skelettmuskelkraft och kalciumhantering av varje mikrotissue över tid.

Beskrivs häri är metoder för att kasta en 96-väl PDMS-baserad MyoTACTIC kulturplattform från en PU mögel, att tillverka matriser av hMMT replika vävnader, och att analysera två aspekter av hMMT funktion inom kulturen enhet-kraft generering och kalcium hantering. Figur 1 ger en schematisk översikt över beredningen av MyoTACTIC kulturbrunnar före hMMT-sådd. PDMS är en allmänt använd silikonbaserad polymer, som enkelt kan gjutas för att skapa komplexa enheter32...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues at JoVE.com

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

Detta manuskript beskriver ett detaljerat protokoll för att producera matriser av 3D mänskliga skelettmuskelmikrotissuer och minimalt invasiv nedströms in situ-analyser av funktion, inklusive kontraktil kraft och kalciumhanteringsanalyser.

Bedömning av funktionella mätvärden för skelettmuskulaturhälsa hos mänskliga skelettmuskulaturmikrotissuer

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Vårt protokoll beskriver detaljerade metoder för att fabricera och analysera en 3D mänskliga skelettmuskel microtissue kultur. Muskelmikrotissuer kan tillämpas på studier av grundläggande muskelbiologi, sjukdomsmodellering eller för kandidatmolekyltestning. Den största fördelen med denna teknik är att den tillåter in situ bedömning av kontraktil kraft och kalcium transienter.På grund av detta kan du genomföra longitudinella studier av muskelvävnadsfunktionen. Brennen Musgrave och Heta Lad, doktorander från mitt laboratorium, demonstrerar proceduren. Två till tre timmar före cellsådd, placera en sex väl mild taktikplatta i en 10 centimeter cellkulturrätt.Förbered varje enskild myotaktisk kultur väl genom att lägga till 100 mikroliter av en 5% pluronic F-127-lösning. Använd locket för att täcka brunnarna och applicera en paraffinfilm för att försegla skålen. Centrifugera skålen vid 1 550 gånger G i en minut i en centrifug utrustad med en plattspinneradapter.Förvara odlingsrätten vid fyra grader Celsius tills cellerna är redo för sådd. Tina sedan långsamt 150 mikroliter alikvot av källarmembranextrakt och 110 mikroliter alikvot trombin på is i kulturhuven. Arbeta i cellodling huven, tillsätt 700 mikroliter av 0,9% saltlösning till en 1,5 milliliter mikrocentrifugerrör som innehåller sju milligram pulveriserad fibrinogen.Placera röret i en 37 grader Celsius cellodlingsinkubator i tre till fem minuter utan att virvla. Ta bort och snärta röret försiktigt och pulssnurra sedan den upplösta lösningen i en mikrocentrifufu innan den återförs till kulturhuven. Filtrera fibrinogenlösningen med en en milliliter spruta utrustad med ett 0,22 mikrometers sprutafilter.Överför sedan den upplösta fibrinogenlösningen till is tillsammans med källarmembranextraktet och trombin alikvoterna. Förbered och förvärm vävnadstillväxtmediet vid 37 grader Celsius, som kommer att introduceras till kulturbrunnarna efter sådd av vävnaderna. Ta bort cellodlingsplattorna från inkubatorn och aspirera på kulturmediet.Tvätta sedan cellerna en gång genom att tillsätta fem milliliter DPBS i varje odlingsplatta. Aspirera DPBS och lossa cellerna genom att tillsätta en milliliter på 0,25% trypsin EDTA i varje odlingsfat. Placera plattan i cellodlingsinkubatorn i tre minuter, håll trypsin genom att tillsätta tre milliliter tvättmedel till odlingsfatet och överför sedan cellerna till ett lämpligt koniskt rör.Pellet cellerna genom att centrifugera vid 400 gånger G i 10 minuter. Aspirera mediet försiktigt utan att skada cellpelleten och suspendera sedan cellerna i en milliliter av tvättmediet. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och trypan blått färgämne under ljus fältmikroskopi.För att så sex vävnader, förbered tillräckligt med celler och extracellulär matris för åtta vävnader, vilket står för förluster och bubbelbildning. Överför 1,2 miljoner celler till ett nytt koniskt rör och öka sedan volymen till 10 millimeter med tvättmedium. Pellet cellerna genom att centrifugera vid 400 gånger G i 10 minuter.Förbered 150 mikroliter ECM-blandning i ett 1,5 ml mikrocentrifugerrör och förvara blandningen på is tills den används. Aspirera media från det koniska röret som innehåller cellerna, var noga med att undvika cellpelleten. Snärta kraftigt rörets ände med ett handskfinger tills pelleten visas som en cellslam.Överför 120 mikroliter av ECM-lösningen till röret som innehåller cellslammet och rör försiktigt upp och ner för att helt suspendera cellerna inom ECM för att generera en enda cellfjädring. Undvik att skapa bubblor och placera sedan cell ECM-suspensionen på is tills den används. Placera den kylda 10 centimeter skålen som innehåller myotaktiska brunnar ovanpå en ispåse inuti cellodlingshuven och aspirera på den pluronic F-127-lösningen från varje brunn.Låt restpuronic F-127-lösningen frigöras från det porösa PDMS och sätt dig till botten av brunnen genom att låta brunnarna sitta i fem minuter på is och aspirera sedan igen. Pipettera cellen ECM-suspensionen noggrant för att suspendera cellerna igen och överför sedan 105 mikroliter av suspensionen till ett färskt, förkylt 1,5 milliliter rör genom att greppa det nära toppen. Tillsätt 0,84 mikroliter på 100 enheter per milliliter trombinbuljonglösning till de 105 mikroliterna av cell ECM-suspensionen.Pipettera snabbt och noggrant för att blanda, vilket undviker införandet av bubblor. Tillsätt 15 mikroliter av cell ECM-blandningen till varje brunn utan att trycka pipetten i botten av brunnen. Med två lätta rörelser sprider du cellupphängningen bakom varje stolpe i brunnen.Placera locket på den 10 centimeter stora odlingsplattan och överför den till en 37 grader Celsius vävnadskulturinkubator i ungefär fem minuter. Tillsätt 200 mikroliter förvärmda vävnadstillväxtmedier till varje myotaktisk brunn efter att cell ECM-blandningen har polymeriserats. Byt ut locket på 10 centimeter skålen och håll den i inkubatorn tills differentieringen.Under en 14 dagars kulturperiod visade myoblaster aspekterna av inhemsk vävnad genom självorganisering i den milda taktiken väl för att bilda en 3D-mikrotissue med multikärnorade myotuber. Myotubes har sarkomere strimmor, som visualiserades genom immunstaining för sarkomerisk alfa aktinin. För att uppnå väl justerade myotuber bör tekniska fel som bubbelbildning under pipettering eller skadlig pluronbeläggning under aspiration undvikas.En representativ förskjutning av den myotaktiska brunnsplattan post som svar på låg och hög frekvens elektrisk stimulering, visas här, vilket indikerar att myotubes svarar på varierande elektriska stimuli och dra ihop sig i enlighet därmed. Kvantifiering av postförskjutningen möjliggör omvandling till absolut kontraktil kraft av HMMTs. Kalciumtransiens på HMMTs gjorda av GCaMP6-transduced myoblasts analyserades också som svar på låg och högfrekvent stimulering.Kvantifiering av fluorescerande intensitet kan användas som mätning för HMMT:s kalciumhanteringsegenskaper. De flesta människor som utför denna vävnadssådd för första gången, kämpar med att lägga till cellen extracellulär matris till brunnarna och med bubbelbildning. Vi rekommenderar att du övar tekniken på några extra mikrotissue kulturbrunnar med en mycket enkel trögflytts lösning före det första försöket med celler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineering Skelettmuskulatur Vävnader från murinceller myoblast progenitorceller och tillämpning av elektrisk stimulering

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation av inducerad Pluripotent Stamcell-härledd Mesoangioblast-liknande Myogena föregångare i musmodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Mätning av Högsta Isometrisk kraft som genereras av permeabiliserade Skelett muskelfibrer

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Engineered vaskulariserade Muskel Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Datortomografi och optisk avbildning av Osteogenesis-angiogenes koppling för att bedöma integration av skallbenet auto och Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

tillämpningar av<em&gt; In Vivo</em&gt; Provning av Rat tibialis anterior för utvärdering vävnadstekniska skelettmuskulatur Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

Cardiac Muscle Cell Based Actuator och självstabiliserande Biorobot - DEL 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

Cardiac Muscle Cell-baserad Actuator och självstabiliserande Biorobot - Del 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Halvautomatiserad längsgående Microcomputed tomografi-baserade kvantitativa strukturella analysen av en naken råtta osteoporosrelaterade kotfrakturer modell

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smälta Electrospinning handstil av tredimensionella Poly(ε-caprolactone) ställningar med kontrollerbar morfologier för Tissue Engineering program

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...