Name: assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues at JoVE.com

Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli ve Sadegh Davoudi'ye MyoTACTIC kültür platformunun icadına katkıda bulunduklarından ve burada açıklanan imalat ve analiz yöntemlerini kurdukları için teşekkür ederiz. HL, Organ-on-a-Chip Mühendislik ve Girişimcilik Bursu'nda Bir Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Eğitim Programı ve Toronto Wildcat Üniversitesi lisansüstü burslarından fon aldı. PMG, Endojen Onarımda Kanada Araştırma Başkanıdır ve bu çalışma için Ontario Rejeneratif Tıp Enstitüsü, Kök Hücre Ağı ve Kanada'nın İlk Araştırma Mükemmellik Programı olan Medicine by Design'dan destek almıştır. Şematik diyagramlar BioRender.com ile oluşturuldu.

1. PDMS MyoTACTIC plaka imalatı
NOT: PDMS MyoTACTIC plaka imalatı, daha önce açıklandığı gibi30üretilebilen bir PU negatif kalıp gerektirir. MyoTACTIC plaka tasarımı için bilgisayar destekli tasarım (CAD) SolidWorks dosyası GitHub'da (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file) kullanıma sunuldu.
<ol><li>Silikon elastomer kitteki bileşenleri kullanarak kürleme maddesine 1:15 monomer oranında tek kullanımlık plastik bir kapta ~ ...

<ol>
	<li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+Muscle:+A+brief+review+of+structure+and+function.">Skeletal Muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li><li>McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy:+From+basic+mechanisms+to+gene+therapy.">Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).</li><li>Young, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoScreen,+a+high-throughput+phenotypic+screening+platform+enabling+muscle+drug+discovery.">MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).</li><li>DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+price+of+innovation:+New+estimates+of+drug+development+costs.">The price of innovation: New estimates of drug development costs.</a> Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture.">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle.">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drug+screening+with+contractile+muscle+tissue+engineered+from+dystrophic+myoblasts.">Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinted+human+skeletal+muscle+constructs+for+muscle+function+restoration.">3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).</li><li>Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+contractile+myofiber+sheets+as+a+platform+for+studies+of+skeletal+muscle+physiology.">Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Afshar Bakooshli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+culture+model+of+innervated+human+skeletal+muscle+enables+studies+of+the+adult+neuromuscular+junction.">A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction.</a> eLife. 8, 1-29 (2019).</li><li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs.">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).</li><li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale.">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).</li><li>Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D-printed+platform+for+modular+neuromuscular+motor+units.">A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).</li><li>Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+contractile+muscle+tissue+consisting+of+human+skeletal+myocyte+cell+line.">Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).</li><li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).</li><li>Gholobova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+skeletal+muscle:+a+novel+3D+in+vitro+model+for+drug+disposition+and+toxicity+after+intramuscular+injection.">Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).</li><li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue.">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li><li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li><li>Khodabukus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+increases+hypertrophy+and+metabolic+flux+in+tissue-engineered+human+skeletal+muscle.">Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle.</a> Biomaterials. 198, 259-269 (2019).</li><li>Nagashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+tissues+with+contractility+fabricated+by+immortalized+human+myogenic+cells.">In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells.</a> Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+skeletal+micro+muscle+platform+with+pacing+capabilities.">Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities.</a> Biomaterials. 198, 217-227 (2019).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+tissue+gauges+to+measure+and+manipulate+forces+from+3D+microtissues.">Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).</li><li>Pr&#252;ller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+delivered+in+their+niche+efficiently+generate+functional+myotubes+in+three-dimensional+cell+culture.">Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture.</a> PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).</li><li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators.">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+monitor+statin-induced+myopathy+in+individual+engineered+skeletal+muscle+myobundles.">A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).</li><li>Rajabian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+skeletal+muscle+as+a+model+of+muscle+aging+and+regeneration.">Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration.</a> Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).</li><li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength.">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).</li><li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+pathological+human+myoblasts:+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Bakooshli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+human+skeletal+muscle+innervated+with+stem+cell-derived+motor+neurons+enables+epsilon-subunit+targeted+myasthenic+syndrome+studies.">A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies.</a> BioRxiv. , 275545 (2018).</li><li>Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+highly+contractile+tissue-cultured+avian+skeletal+myotubes+in+collagen+gel.">Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.</a> Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle.">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li></ol>

Bu makalede, temel kas biyolojisi, hastalık modellemesi veya aday molekül testi çalışmalarına uygulanabilecek bir 3D hMMT kültür modeli oluşturma ve analiz etme yöntemleri açıklanmaktadır. MyoTACTIC platformu maliyet dostudur, üretimi kolaydır ve iskelet kas mikrotizeleri üretmek için nispeten az sayıda hücre gerektirir. MyoTACTIC kültür platformunda oluşturulan hMMT'ler hizalanmış, çok noktalatılmış ve çizgili miyotüplerden oluşur ve kasılmayı tetikleyen kalsiyum geçicilerini başlatara...

İskelet kası insan vücudundaki en bol dokulardan biridir ve lokomotion, ısı homeostazı ve metabolizma gibi temel vücut fonksiyonlarını destekler1. Tarihsel olarak, hayvan modelleri ve iki boyutlu (2D) hücre kültürü sistemleri biyolojik süreçleri ve hastalık patogenezini incelemek ve iskelet kas hastalıklarının tedavisinde farmakolojik bileşikleri test etmek için kullanılmıştır2,3. Hayvan modelleri sağlıkta ve hastalıkta iskelet kası bilgimizi büyük ölçüde geliştirmiş olsa da, çevirisel etkileri yüksek maliyetler, etik hususlar ve türler arası farklılıklar ile engellenmiştir2,4. İskelet kasını incelemek için insan hücre tabanlı sistemlere yönelen 2D hücre kültürü sistemleri, basitlikleri nedeniyle elverişlidir. Ancak, bir sınırlama vardır. Bu biçim genellikle vücut içinde doğal olarak meydana gelen hücre-hücre ve hücre dışı matris etkileşimlerini yeniden yakalayamaz5,6. Son birkaç yılda, üç boyutlu (3D) iskelet kası modelleri, fizyolojik ve patolojik olarak ilgili süreçlerin modellenebilmesine izin vererek tüm hayvan modellerine ve geleneksel 2D kültür sistemlerine güçlü bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır ex vivo7,8. Gerçekten de, çok sayıda çalışma, insan iskelet kasını biyoartificial 3D kültür formatında modelleme stratejileri bildirmiş1. Bu çalışmaların birçoğu için bir sınırlama, aktif kuvvetin kas dokularının kültür platformlarından çıkarılması ve yıkıcı olan bir kuvvet dönüştürücüye bağlanmasının ardından ölçülmesidir, bu da bir uç nokta olarak hizmet etmekle sınırlıdır9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Diğerleri aktif kuvveti ölçmek için non-invaziv yöntemlere izin veren kültür sistemleri tasarladılar, ancak hepsi yüksek içerikli molekül test uygulamaları 7 ,8,9, 10,14,18,22,23,24,25,26,27,28'euygundeğil. ,29.
Bu protokol, iskelet kası (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) platformunda insan kas mikrotissues (hMMTs) imal etmek için ayrıntılı bir yöntem açıklar; 3D iskelet kas mikrotissues 30 toplu üretimini destekleyen bir96kuyu plakası cihazı. MyoTACTIC plaka imalat yöntemi, 96 kuyu polidimetilsiloksisan (PDMS) kültür plakasının ve buna karşılık gelen tüm kuyu özelliklerinin tek bir döküm adımında üretilmesini sağlar, böylece her kuyu mikrotissue oluşumu için nispeten az sayıda hücre gerektirir. MyoTACTIC içinde oluşan mikrotissues, cihazın iyisinden iyisine tekrarlanabilir hizalanmış, çizgili ve çok irtiküle edilmiş miyotütler içerir ve olgunlaşma üzerine, kimyasal ve elektrik uyaranlarına yerinde yanıt verebilir30. Burada, bir poliüretan (PU) replikasından PDMS MyoTACTIC kültür plakası cihazı üretme tekniği, hMMT'leri üretmek için ölümsüzleştirilmiş insan miyojenik progenitör hücrelerini uygulamak için optimize edilmiş bir yöntem ve mühendislik hMMT kuvveti üretimi ve kalsiyum işleme özelliklerinin fonksiyonel değerlendirmesi özetlenmiş ve tartışılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Saline Solution, Sterile</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>1010</td>
			<td>10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2548-CABD305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Aminocaproic Acid, &#8805;99% (titration), Powder</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td>A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.35 mm ID Tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60985-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB1167 Myoblast Cell Line</td>
			<td>Institut de Myologie (Paris, France)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>Rigol</td>
			<td>DG1022Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Extract (Geltrex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14132-02</td>
			<td>Stored as aliquots of 50 &#181;L or 100 &#181;L at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vacuum Chamber</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D2672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC to Aligator Clip Cable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Plastics</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td>Includes culture plates, serological pipettes, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8418-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from Bovine Plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>F8630-5G</td>
			<td>Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 &#181;L of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Dimension</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Oven</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope - Camera Mount</td>
			<td>Labcam</td>
			<td>Labcam for iPhone</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 1cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2606-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 50cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2612-309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127, Powder, BioReagent</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane Negative Mold</td>
			<td>In House</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Release Agent</td>
			<td>Mann Release Technologies</td>
			<td>200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Vane Vacuum Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65401906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Almedic, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2586-M36-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Basal Medium</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23260</td>
			<td>30 mL aliquotes are generated and at stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23060</td>
			<td>42 mL aliquots are generated and stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartphone (iPhone)</td>
			<td>Apple</td>
			<td>SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Duty Dry Vacuum Pump</td>
			<td>Welch</td>
			<td>2546B-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization Bag</td>
			<td>Alliance</td>
			<td>211-SCM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble</td>
			<td>Igege</td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T6884-250UN</td>
			<td>100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 &#181;L aliquots are prepared and stored at - 20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin coated copper wire</td>
			<td>Arco</td>
			<td>B8871K48</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Thermo FIsher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Chamber 2</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42027-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues

İskelet kasının üç boyutlu (3D) in vitro modelleri, iskelet kası reformunu inceleme ve deneysel manipülasyonlara uygun ölçeklenebilir bir formatta işlev bulma fırsatını sağladığı için biyomedikal araştırmalarda değerli bir ilerlemedir. 3D kas kültürü sistemleri, bilim adamlarının iskelet kası ex vivo'larını insan hücreleri bağlamında incelemelerini sağladığı için arzu edilir. 3D in vitro modeller, yetişkin iskelet kasının doğal doku yapısının yönlerini yakından taklit etti. Bununla birlikte, evrensel uygulamaları, üretimi basit, maliyetli ve kullanıcı dostu olan ve nispeten yüksek miktarlarda insan iskelet kası dokusu sağlayan platformların mevcudiyeti ile sınırlıdır. Ek olarak, iskelet kası birçok hastalık eyaletinde zamanla bozulan önemli bir fonksiyonel rol oynadığından, mikrotissue çalışmaları için deneysel bir platform, minimal invaziv kalsiyum geçici ve kontrtil kuvvet ölçümleri doğrudan platformun kendi içinde yapılabildiğinde en pratiktir. Bu protokolde, 'MyoTACTIC' olarak bilinen 96 kuyulu bir platformun imalatı ve 3D insan iskelet kas mikrotissuesinin (hMMTs) toplu üretimi açıklanmıştır. Ek olarak, iskelet kas kuvvetinin tekrarlanan ölçümlerini ve zaman içinde her mikrotissue'nin kalsiyum elleçlenmesini sağlayan elektriksel stimülasyonun minimal invaziv bir uygulaması için yöntemler bildirilmiştir.

Burada açıklanan yöntemler, bir PU kalıbından 96 kuyu PDMS tabanlı MyoTACTIC kültür platformu oluşturma, hMMT replika doku dizileri üretme ve kültür cihaz zorlama üretimi ve kalsiyum işleme içinde hMMT işlevinin iki yönünü analiz etme yöntemleridir. Şekil 1, hMMT tohumlamadan önce MyoTACTIC kültür kuyularının hazırlanmasına şematik bir genel bakış sunmaktadır. PDMS, karmaşık cihazlar oluşturmak için kolayca kalıplanabilen yaygın olarak kullanılan siliko...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues at JoVE.com

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

Bu makalede, 3D insan iskelet kas mikrotleri dizileri ve kas gücü ve kalsiyum elleçleme analizleri de dahil olmak üzere minimal invaziv aşağı akış in situ fonksiyon tahlilleri üretmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan İskelet Kas Mikrotissularında İskelet Kas Sağlığının Fonksiyonel Ölçümlerinin Değerlendirilmesi

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Protokolümüz, 3D insan iskelet kası mikrotissue kültürünün imal ve analizini yapmak için ayrıntılı yöntemleri açıklar. Kas mikrotizeleri temel kas biyolojisi, hastalık modellemesi veya aday molekül testi çalışmalarına uygulanabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kontrtil kuvvet ve kalsiyum geçicilerinin yerinde değerlendirilmesine izin ver olmasıdır.Bu nedenle, kas dokusu fonksiyonunun boyuna çalışmalarını yapabilirsiniz. Prosedürü gösteren brennen Musgrave ve Heta Lad olacak, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencileri. Hücre tohumlamadan iki ila üç saat önce, 10 santimetrelik bir hücre kültürü kabına altı iyi hafif taktik plaka kısmı yerleştirin.%5 pluronik F-127 çözümünün 100 mikrolitresi ekleyerek her bir miyotik kültürü iyi hazırlayın. Kuyuları kapatmak için kapağı kullanın ve kabı kapatmak için bir parafin filmi uygulayın. Tabağı, bir plaka spinner adaptörü ile donatılmış bir santrifüjde bir dakika boyunca 1.550 kez G'de santrifüjlayın.Hücreler tohumlama için hazır olana kadar kültür çanasını dört santigrat derecede saklayın. Sonra yavaşça bodrum membran özü 150 mikrolitre aliquot ve kültür kaput buz üzerinde trombin 110 mikrolitre aliquot çözün. Hücre kültürü davlumbazında çalışarak, yedi miligram toz fibrinojen içeren 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne% 0,9 salin çözeltisinin 700 mikrolitresini ekleyin.Tüpü 37 santigrat derece hücre kültürü inkübatörüne girdapsız üç ila beş dakika yerleştirin. Tüpü yavaşça çıkarın ve hareket ettirin, ardından çözünmüş çözeltiyi kültür başlığına geri vermeden önce bir mikro santrifüjde nabız döndürün. Fibrinojen çözeltisini 0,22 mikrometre şırınga filtresi ile donatılmış bir mililitre şırınga kullanarak filtreleyin.Daha sonra çözünmüş fibrinojen çözeltisini bodrum membran özü ve trombin aliquots ile birlikte buza aktarın. Dokuların tohumlandıktan sonra kültür kuyularına tanıtılacak olan 37 santigrat derecede doku büyüme ortamını hazırlayın ve önceden ısıtın. Hücre kültürü plakalarını inkübatörden çıkarın ve kültür medyasını aspire edin.Daha sonra her kültür plakasına beş mililitre DPBS ekleyerek hücreleri bir kez yıkayın. DPBS'yi epire edin ve her kültür yemeğine bir mililitre %0,25 trypsin EDTA ekleyerek hücreleri ayırın. Plakayı üç dakika boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin, kültür kabına üç mililitre yıkama ortamı ekleyerek tripsin tutun, ardından hücreleri uygun boyutta bir konik tüpe aktarın.Hücreleri 10 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyarak peletleyin. Hücre peletine zarar vermeden medyayı dikkatlice emiş, ardından hücreleri yıkama ortamının bir mililitresinde yeniden askıya alın. Parlak alan mikroskopisi altında hemositometre ve trypan mavi boya kullanarak hücreleri sayın.Altı dokuyu tohumlamak için, sekiz doku için yeterli hücre ve hücre dışı matris hazırlayın, böylece kayıplar ve kabarcık oluşumu için muhasebe. 1,2 milyon hücreyi yeni bir konik tüpe aktarın, ardından yıkama ortamıyla hacmi 10 milimetreye çıkarın. Hücreleri 10 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyarak peletleyin.1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünde 150 mikrolitre ECM karışımı hazırlayın ve karışımı kullanıma kadar buz üzerinde saklayın. Hücre peletinden kaçınmaya dikkat ederek, hücreleri içeren konik tüpten ortamı epire edin. Pelet bir hücre bulamacı olarak görünene kadar tüpün ucunun ucunun eldivenli bir parmakla kuvvetlice hareket ettirdiği kesin.ECM çözeltisinin 120 mikrolitresini hücre bulamacı içeren tüpe aktarın ve tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için ECM içindeki hücreleri tamamen yeniden askıya almak için dikkatlice yukarı ve aşağı pipet. Kabarcıklar oluşturmaktan kaçının, ardından hücre ECM süspansiyonunu kullanıma kadar buza yerleştirin. Miyotaktik kuyuları içeren so soğutmalı 10 santimetrelik tabağı hücre kültürü kaputunun içindeki bir buz torbasının üzerine yerleştirin ve pluronik F-127 çözeltisini her kuyudan epire edin.Artık pluronik F-127 çözeltisinin gözenekli PDMS'den salınmasına izin verin ve kuyuların buz üzerinde beş dakika bekletilmesine izin vererek kuyunun dibine yerleşin, sonra tekrar aspire edin. Hücreleri yeniden askıya almak için hücre ECM süspansiyonuna dikkatlice pipetlayın, ardından süspansiyonun 105 mikrolitresini, üste yakın kavrayarak taze, önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. 105 mikrolitre hücre ECM süspansiyonu için mililitre trombin stok çözeltisi başına 100 birimlik 0,84 mikrolitre ekleyin.Pipet hızlı ve iyice karıştırmak için, kabarcıkların girişinden kaçınarak. Pipet kapağını kuyunun dibine bastırmadan her kuyuya 15 mikrolitre hücre ECM karışımı ekleyin. İki hafif hareketle, hücre süspansiyonu kuyudaki her direğin arkasına yayın.Kapağı 10 santimetrelik kültür plakasına yerleştirin ve yaklaşık beş dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir doku kültürü inkübatörüne aktarın. Hücre ECM karışımı polimerize olduktan sonra her miyoaktik kuyuya 200 mikrolitre önceden ısıtılmış doku büyüme ortamı ekleyin. 10 santimetrelik kabın kapağını değiştirin ve farklılaşmaya kadar inkübatörde tutun.14 günlük bir kültür döneminde, mioblastlar, çok çekirdekli çizgili miyotütler ile 3D mikrotissue oluşturmak için hafif taktik kuyusunda kendi kendini düzenleyerek yerel dokunun yönlerini sergiledi. Miyotubes sarkoer alfa aktinin için immünostaining ile görselleştirilmiş sarkom çizgilerine sahiptir. İyi hizalanmış miyotütler elde etmek için pipetleme sırasında kabarcık oluşumu veya aspirasyon sırasında pluronik kaplamaya zarar verme gibi teknik hatalardan kaçınılmalıdır.Miyotoptik kuyu plakası direğinin düşük ve yüksek frekanslı elektriksel stimülasyona yanıt olarak temsili bir yer değiştirmesi, miyotütlerin değişen elektrik uyaranlarına yanıt verdiğini ve buna göre büzülmeye cevap verdiğini gösterir. Post yer değiştirmenin nicelleştirilmesi, HMMT'lerin mutlak kontuplasyon kuvvetine dönüştürülmesine izin verir.Floresan yoğunluğunun nicelemesi, HMMT'lerin kalsiyum işleme özellikleri için ölçüm olarak kullanılabilir. Bu doku tohumlamasını ilk kez yapan çoğu insan, hücre dışı matrisi kuyulara eklemek ve kabarcık oluşumu ile mücadele eder. Hücrelerle ilk denemeden önce çok basit bir viskoz çözelti ile bazı yedek mikrotissue kültür kuyularında tekniği uygulamanızı öneririz.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Elektrik Stimülasyonu murin myoblast Progenitör Hücreler ve Uygulama Mühendislik İskelet Kası Dokular

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Permeabilize İskelet Kası Fibers tarafından oluşturulan Maksimum İzometrik Kuvvet Ölçümü

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Engineered Vaskülarize Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Bilgisayarlı Tomografi ve Osteogenezi-anjiyogenez bağlamalar Optik Görüntüleme Kranial Kemik Otogreftlerin ve allogreft Entegrasyon değerlendirmek için

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Uygulamaları<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku değerlendirilmesi için Rat Tibialis Anterior Fonksiyonel Test İskelet Kası Onarım Engineered

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

Kardiyak Kas hücresine Dayalı Aktüatör ve Kendiliğinden Sertleşen Biorobot - BÖLÜM 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

Kardiyak Kas Hücresine Dayalı Aktüatör ve Kendiliğinden Sertleşen Biorobot - Bölüm 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Semiautomated boyuna Microcomputed tomografi tabanlı nicel yapısal analizi bir çıplak sıçan vertebra kırığı Osteoporoz ile ilgili Model

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Üç boyutlu Poly(ε-caprolactone) İskele kontrol edilebilir türleri morfoloji ile Electrospinning yazma doku mühendisliği uygulamaları için erime

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...