Name: time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

نشكر ماديسون غراي على إعطائي يد العون عندما لم يكن لدي أي يد. تم دعم هذا البحث من قبل منحة NSERC Discovery (RGPIN-2016-06128) ، وزمالة سلون في علم الأعصاب وكرسي أبحاث كندي من المستوى 2 (إلى J.L.L). تم دعم S. Ing-Esteves من قبل برنامج أبحاث علوم الرؤية ومنح NSERC للدراسات العليا - الدكتوراه.

ملاحظة: يمتد هذا البروتوكول لمدة يومين مع فترة لا تقل عن 4-5 أيام للنقل الفيروسي بين الأيام التجريبية (الشكل 1A). يتم إجراء التجارب على الحيوانات وفقا للمجلس الكندي للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات لاستخدام الحيوانات في البحوث ورعاية الحيوانات المختبرية بموجب البروتوكول?...

يوضح هذا الفيديو خط أنابيب تجريبي يستخدم الأدوات الجينية الحالية لتصوير ديناميكيات التشعبات لتطوير الخلايا العصبية الشبكية مع التصوير الحي البؤري. كما أظهرت الحقن داخل العين من AAVs المعتمدة على Cre التي تشفر البروتينات الفلورية المستهدفة بالغشاء في الفئران حديثي الولادة. يتم تصنيف الخلاي...

تشكل تشعبات الخلايا العصبية الشبكية أنماطا معقدة، ولكنها محددة، تؤثر على وظيفتها داخل الدوائر العصبية. في شبكية العين الفقارية، تحمل أنواع متنوعة من الخلايا العقدية الشبكية (RGCs) والخلايا العصبية الداخلية لخلايا أماكرين مورفولوجيا تغصنية فريدة تختلف في حجم الشجرة وموقعها وطول فرعها وكثافتها1. أثناء تطور ما بعد الولادة، تقوم RGCs وخلايا أماكرين بتوسيع العمليات الشجيرية الوفيرة إلى عصبية تسمى الطبقة الضفيرية الداخلية (IPL)، حيث تتلقى مدخلات الخلايا ثنائية القطب التي تنقل إشارات المستقبلات الضوئية2. وكما تم التقاطه من خلال التصوير بفاصل زمني لمجموعات شبكية العين الموصوفة بالفلورسنت في يرقات الكتاكيت أو الزرد، فإن التشكل التشعبي ديناميكي للغاية3،4،5. في غضون أيام ، تتوسع العرش الشجيرية ، وتعيد تشكيلها ، وتتشعب إلى طبقات فرعية ضيقة من IPL ، حيث تتشابك مع شركاء مختارين. تظهر العرش ديناميكيات هيكلية مختلفة على التنمية ، مع تغيرات في المعدلات النسبية لإضافة الفرع والتراجع والاستقرار. تظهر التشعبات Amacrine و RGC أيضا سلوكيات مختلفة للنمو وإعادة التشكيل قد تعكس التشجير الخاص بالنوع. ومع ذلك ، تتبعت هذه الدراسات مجموعات واسعة من الأماكرين أو RGC وركزت على الاستهداف الرقائقي ، وهو مجرد جانب واحد من جوانب المورفولوجيا.
الآليات التي تنتج التنوع المورفولوجي الهائل الذي لوحظ عبر الأنواع الفرعية للشبكية غير مفهومة بشكل جيد. كان الهدف من هذه المجموعة هو تطوير طريقة لالتقاط ديناميكيات التشعبات وإعادة تشكيل الشجرة لأنواع فرعية محددة من الشبكية في الفئران. يتطلب تحديد الآليات الخاصة بنوع الخلية لنمط التشعبات طرقا لتصور وقياس سلوكيات التشعبات للخلايا ذات الاهتمام. تعتبر الثقافات العضوية لشبكية العين الفئران مناسبة تماما لدراسات تصوير الخلايا الحية باستخدام المجهر البؤري أو متعدد الفوتونات. يتم تشريح الشبكية النامية وتركيبها في إكسبوات مسطحة يمكن تصويرها لعدة ساعات في غرفة التسجيل أو استزراعها على مدى بضعة أيام مع تأثيرات محدودة على الدوائر6,7. يمكن تصنيف الخلايا العصبية الحية في شبكية العين من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات، بما في ذلك ملء الصبغة بواسطة الأقطاب الكهربائية، والمعالجة الكهربائية، والتسليم الحيوي للجسيمات المغلفة بالأصباغ المحبة للدهون أو البلازميدات التي تشفر البروتينات الفلورية (على سبيل المثال، Gene Gun)، بالإضافة إلى ملصقات الخلايا المشفرة وراثيا7،8،9،10 . ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب غير فعالة لتصوير ديناميكيات التشعبات لأنواع فرعية محددة من الشبكية. على سبيل المثال ، طرق ملء الأصباغ منخفضة الإنتاجية وتتطلب جهاز الفيزيولوجيا الكهربية وملصقات جينية إضافية لاستهداف الخلايا ذات الأهمية بشكل موثوق. علاوة على ذلك ، يمكن لإشارات التألق القوية في السوما أن تحجب التشعبات القريبة.
يمكن لطرق توصيل الجينات الحيوية تسمية عشرات الخلايا في وقت واحد ، ولكن الخطوات التي تنطوي على توصيل الجسيمات عالية الضغط وحضانة الشبكية المعزولة بين عشية وضحاها يمكن أن تضر بفسيولوجيا الخلايا والنمو الشجيري. تقترح هذه الورقة أنه يمكن استخدام الأدوات الجينية الحديثة لالتقاط ديناميكيات التشعبات المبكرة مع نوع الخلية والدقة الهيكلية ، بالنظر إلى المعايير التجريبية التالية. أولا ، لحل الفروع الدقيقة والفيلوبوديا التي تهيمن على العرش النامي ، يجب أن تقوم الطريقة بتسمية الخلايا العصبية بالبروتينات الفلورية الساطعة التي تملأ العمليات في الشجرة بأكملها. يجب ألا تتلاشى العلامات الفلورية بسبب التبييض الضوئي خلال فترة التصوير. تم إنشاء مجموعة متنوعة من متغيرات البروتين الفلوري ومقارنتها من أجل ملاءمتها للتصوير في الجسم الحي / خارج الجسم الحي11 بناء على السطوع والاستقرار الضوئي. ثانيا ، يجب التعبير عن البروتينات الفلورية (XFPs) بمستويات عالية بما فيه الكفاية بحلول المرحلة المبكرة من تكوين أشكال التشعبات ، بحيث لا يتم تفويت نافذة النمو الضيقة. في تحليلات النقاط الزمنية الثابتة في شبكية العين الفأرية، يحدث تطور التشعبات خلال الأسبوع الأول بعد الولادة ويشمل مراحل النمو وإعادة التشكيل والاستقرار10،12،13،14،15. ثالثا ، يجب أن تؤدي الطريقة إلى وضع علامات انتقائية أو إلى زيادة احتمال وضع العلامات على السكان الفرعيين للخلايا العصبية ذات الاهتمام. رابعا ، يجب أن يكون وضع العلامات على السكان الفرعيين المستهدفين متناثرا بما فيه الكفاية بحيث يمكن تحديد الشجرة العصبية بأكملها وتتبعها. على الرغم من أنه يمكن تمييز الأنواع الفرعية RGC و amacrine من خلال خصائصها المورفولوجية الناضجة وأنماط التقسيم الطبقي IPL16،17،18،19،20 ، فإن التحدي هو تحديد الأنواع الفرعية أثناء التطوير بناء على هياكل غير ناضجة. يتم تسهيل هذه المهمة من خلال توسيع الأدوات المعدلة وراثيا لتسمية أنواع محددة من خلايا الشبكية أثناء التطوير.
تستخدم خطوط الفئران المعدلة وراثيا والطرق السريعة التي يتم فيها تحديد التعبير الخلوي والزمني للبروتينات الفلورية أو Cre بواسطة العناصر التنظيمية الجينية على نطاق واسع لدراسة أنواع خلايا الشبكية13،21،22،23. وقد جاءت الملاحظات الرئيسية حول أنماط محددة من النوع الفرعي لتطور التشعبات من دراسات شبكية العين الفئران المعدلة وراثيا في نقاط زمنية ثابتة10،14،24،25. يتيح نظام Cre-Lox ، على وجه الخصوص ، معالجة الجينات الرائعة ومراقبة الأنواع الفرعية باستخدام مجموعة متنوعة من المراسلين المعتمدين على المؤتلف وأجهزة الاستشعار والمنشطات البصرية الوراثية. وقد أدت هذه الأدوات إلى اكتشاف برامج جزيئية خاصة بنوع فرعي وخصائص وظيفية تكمن وراء تجميع دائرة الشبكية26،27،28،29،30. ومع ذلك ، لم يتم الاستفادة منها بعد لدراسة ديناميكيات التشعبات الخاصة بالنوع الفرعي في شبكية العين الفأرية. يمكن تحقيق وضع العلامات منخفضة الكثافة من خلال الجمع بين خطوط الماوس Cre والجينات المحورة التي يتم إدخالها بواسطة الكهربية أو بواسطة AAVs المؤتلفة. إذا كان ذلك متاحا، يمكن أيضا استخدام خطوط كري المستحثة بالتاموكسيفين أو الاستراتيجيات الجينية المتقاطعة. وأخيرا، ينبغي وضع علامة على الخلية بطريقة طفيفة التوغل وتصويرها باستخدام معلمات الاكتساب حتى لا تتعرض الأنسجة للخطر أو تتداخل مع الوظيفة الخلوية اللازمة لتكوين التشعبات.
تظهر هنا طريقة لتطبيق الأدوات المعدلة وراثيا والمجهر البؤري للتحقيق في ديناميكيات التشعبات في عمليات استئصال شبكية العين الحية للفئران. تم دمج خطوط الفئران المعدلة وراثيا Cre مع ناقلات AAV التي تعبر عن البروتينات الفلورية عند إعادة تركيب Cre ، مما يسمح بوضع علامات متفرقة على خلايا الشبكية ذات الاهتمام. يتم تسليم AAVs المتاحة تجاريا إلى شبكية العين حديثي الولادة عن طريق الحقن داخل الجسم الزجاجي. توضح هذه الورقة أن AAVs تنتج تعبيرا فلوريا عاليا وخاصا بنوع الخلية بنسبة 4 نقاط في البوصة ، مما يسمح بالوصول إلى نقاط زمنية بعد الولادة. ولتوضيح هذا النهج، تم تصنيف الإنترنورون الأماكرين "الانفجار النجمي" الكوليني عن طريق توصيل Brainbow AAV في الفئران حديثي الولادة التي تعبر عن أستيل ترانسفيراز الكولين (ChAT) - موقع دخول الريبوسوم الداخلي (IRES)-Cre transgene ، والذي ينشط في شبكية العين المبكرة بعد الولادة31,32. تطور خلايا الأماكرين النجمية مورفولوجيا شجرية نمطية وشعاعية تتشكل من خلال تجنب التعفن الذاتي بوساطة البروتوكادهيرينات المتجمعة33,34. تظهر هذه الورقة أن دقة التشعبات النجمية والفيلوبوديا قد تحسنت بشكل كبير بواسطة XFPs إلى غشاء البلازما مع إضافة زخارف CAAX التي تخضع للفارنيزيل ، كما هو مستخدم في Brainbow AAVs31. وأخيرا، تم تحديد بروتوكولات التصوير بالفاصل الزمني وما بعد المعالجة التي تنتج صورا عالية الجودة قابلة لإعادة بناء التشعبات والقياس الكمي المورفومتري. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد العوامل التي تتحكم في تشكل التشعبات والتقاط العديد من السلوكيات الخلوية في شبكية العين السليمة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45185-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45186-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HABG01 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 50 &#215; 15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470313-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene disposable transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tip paint brush, size 3/0</td>
			<td>Conventional art supply store</td>
			<td></td>
			<td>Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-imaging incubation system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber polyethylene tubing, PE-160 10&#39;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel heater controller, Model TC-344C</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater controller cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CC-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large bath incubation chamber with slice support</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample anchor (Harps)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0260</td>
			<td>Sample anchor must be compatible with incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sloflo In-line Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Microliter Syringe Series 700, Removable Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)&#160;</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2453</td>
			<td>Addgene Plasmid #45185&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 
			1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2454</td>
			<td>Addgene Plasmid #45186</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF Dye content &#8805;85 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tattoo paste</td>
			<td>Ketchum MFG Co</td>
			<td>329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>PV-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>Supplier may vary depending on region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH35317.604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>Open source</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations

يتطلب اكتشاف الآليات التي تنميط العرش التغصني طرقا لتصور التشعبات وتصويرها وتحليلها أثناء التطوير. شبكية العين الفأر هو نظام نموذجي قوي للتحقيق في الآليات الخاصة بنوع الخلية لتكوين الخلايا العصبية والاتصال. تنظيم وتكوين الأنواع الفرعية للشبكية محددة جيدا، والأدوات الجينية متاحة للوصول إلى أنواع محددة أثناء النمو. كما أن العديد من أنواع خلايا الشبكية تقيد التشعبات و / أو المحاور العصبية الخاصة بها إلى طبقات ضيقة ، مما يسهل التصوير بفاصل زمني. تعتبر مزارع استئصال شبكية العين للفئران مناسبة تماما لتصوير الخلايا الحية باستخدام المجهر البؤري أو متعدد الفوتونات ، ولكن الطرق المحسنة لتصوير ديناميكيات التشعبات ذات الدقة الزمنية والهيكلية غير موجودة. تظهر هنا طريقة لتسمية وتصوير تطور مجموعات شبكية محددة تتميز بنظام Cre-Lox بشكل ضئيل. الفيروسات المرتبطة بالغدية المتاحة تجاريا (AAVs) المستخدمة هنا عبرت عن البروتينات الفلورية المستهدفة بالغشاء بطريقة تعتمد على Cre. ينتج عن الولادة داخل العين ل AAVs في الفئران حديثي الولادة وضع علامات الفلورسنت على أنواع الخلايا المستهدفة قبل 4-5 أيام بعد الحقن (dpi). يمكن اكتشاف إشارات الفلورسنت الغشائية عن طريق التصوير البؤري وحل هياكل الفروع الدقيقة والديناميكيات. يتم الحصول على مقاطع فيديو عالية الجودة تمتد من 2 إلى 4 ساعات من تصوير الحوامل المسطحة للشبكية التي يتم دمجها مع السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي المؤكسج (aCSF). كما يتم توفير خط أنابيب ما بعد معالجة الصور لإزالة الالتفاف وتصحيح الانجراف ثلاثي الأبعاد (3D). يمكن استخدام هذا البروتوكول لالتقاط العديد من السلوكيات الخلوية في شبكية العين السليمة وتحديد العوامل الجديدة التي تتحكم في تكوين الخلايا العصبية. ستكون العديد من الاستراتيجيات التنموية التي تم تعلمها في شبكية العين ذات صلة بفهم تكوين الدوائر العصبية في أماكن أخرى من الجهاز العصبي المركزي.

باستخدام البروتوكول أعلاه ، تم الحصول على فيديو 3D عالي الدقة لتطوير تشعبات خلايا الانفجار النجمي ، وتفكيكها ، وتصحيحها للانجراف 3D. تم إنتاج إسقاطات قصوى على مستوى Z لإنشاء مقاطع فيديو ثنائية الأبعاد للتحليل (الفيديو التكميلي 1 ، الشكل 5A). زاد الالتفاف ثلاثي الأبعا?...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

هنا ، نقدم طريقة للتحقيق في مورفوجينيا العصب في شبكية العين بعد الولادة بواسطة المجهر البؤري بفاصل زمني. نحن نصف نهجا لوضع العلامات المتناثرة واكتساب أنواع خلايا الشبكية وعملياتها الدقيقة باستخدام ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدية المؤتلفة التي تعبر عن البروتينات الفلورية المستهدفة بالغشاء بطريقة تعتمد على Cre.

التصوير بالفاصل الزمني للتشجير العصبي باستخدام وضع العلامات على الفيروسات المرتبطة بالأدينو المتناثرة لمجموعات خلايا الشبكية المستهدفة وراثيا

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

مطلوب وضع العلامات على خلية واحدة وتصور العرش الشجيري أو المحوري لدراسة التشكل العصبي. من خلال وضع العلامات على العرش النامية بطريقة طفيفة التوغل ، تظل أنسجة الشبكية صحية ومناسبة للتصوير الحي البؤري لفترات طويلة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي القدرة على تصور العرش الفردي مع البروتينات الفلورية متعددة الألوان في غضون أربعة أيام بعد الحقن.وهذا يجعل دراسة مورفولوجيا الشجرة الوليدية ممكنة. يمكن استخدام بروتوكول التصوير والتحليل بالحقن هذا لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية عبر الجهاز العصبي المركزي. يجب تحديد اختيار Cre المناسب وموقع الحقن لاستهداف مجموعة الخلايا ذات الاهتمام.ابدأ باختيار خط ماوس Cre لتسمية مجموعات خلايا الشبكية ذات الاهتمام. الحصول على فيروس AAV المعتمد على المؤتلف ترميز البروتينات الفلورية. للحصول على أفضل وسم للعمليات الدقيقة ، حدد المتجهات التي تعبر عن البروتينات الفلورية المعدلة التي تستهدف غشاء البلازما.ل AAV aliquot على الجليد ، وإعداد واحد إلى أربعة تخفيف AAV باستخدام محلول ملحي معقم أو PBS. لتصور الحقن ، لون المحلول باللون الأزرق عن طريق إضافة ميكرولتر واحد تقريبا من محلول صبغة FCF الأخضر السريع بنسبة 0.02٪ لكل 15 ميكرولتر من تخفيف AAV. تعقيم منطقة الحقن مع 70 ٪ من الإيثانول.ردم الماصة الدقيقة بتخفيف AAV باستخدام حقنة دقيقة. تحت مجهر ستيريو ، قم بكسر طرف الماصة الدقيقة بإبرة قياس 30 لفك الحافة. بعد تخدير الفئران حديثي الولادة ، قم بوشم منصات مخالبها بحبر الوشم باستخدام إبرة قياس 30 لتحديد الحيوانات.جمع قصاصات الذيل لعزل الحمض النووي والتنميط الجيني. مسحة الجلد فوق العينين مع 70٪ من الإيثانول. استخدم إبرة قياس 30 لفتح الجفن المنصهر أثناء تطبيق ضغط خفيف بالأصابع لفتح العين.كز ثقب صغير من خلال القرنية عند تقاطع القرنية الصلبة. أدخل الماصة الزجاجية الدقيقة في الفتحة واضغط على دواسة قدم الحاقن الصغير مرتين إلى أربع مرات لحقن AAV في الفضاء داخل الجسم الزجاجي. قم بإزالة الماصة الدقيقة ببطء وتأكد من حقن AAV عن طريق تصور الصبغة الزرقاء في التلميذ.بعد تحضير aCSF الشبكية كما هو موضح في مخطوطة النص ، قم بأكسجة aCSF الشبكية عن طريق الفقاعات مع الكاربوجين لمدة لا تقل عن 15 دقيقة ، ثم اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. قم بتضمين طبق بتري قطره 60 ملم في صينية ثلج واملأه ب aCSF الشبكية المؤكسج. ضع طبق بتري المملوء تحت مجهر ستيريو.بعد ذلك ، قم بقطع رفرف الجفن للفأر الرحيم لفضح العين. استخدم ملقط حاد لاستئصال العينين ونقلهما إلى السائل الدماغي الشوكي البارد الموضوع تحت المجهر الاستريو. تحت المجهر الاستريو ، قم بتثبيت العين عن طريق ربط العصب البصري باستخدام ملقط Dumont رقم خمسة وكزة ثقب في وسط القرنية بإبرة قياس 30 ، ثم أدخل طرف واحد من المقص الدقيق في الثقب لإجراء شق من الثقب إلى نهاية القرنية.كرر ذلك لعمل أربع شرائح في الاتجاهات الأساسية ، مما يؤدي إلى إنشاء أربع لوحات. أمسك واسحب اللفافتين المجاورتين بعيدا عن بعضهما البعض ، وقم بتقشير الصلبة بلطف من شبكية العين لجميع لوحات القرنية. ثم قم بإزالة العدسة من كوب الشبكية باستخدام الملقط.أخيرا ، استخدم المقص الدقيق لإجراء أربعة شقوق شعاعية من حافة الشبكية باتجاه العصب البصري ، مما يخلق أربع بتلات متساوية. في حالة استخدام مرشحات غشاء MCE رمادية كبيرة القطر للتركيب ، فقم بقطع القرص إلى أرباع بعرض سنتيمتر واحد تقريبا ، ثم ضع قرص MCE في وسط ورقة ترشيح بيضاء أكبر. باستخدام فرشتي طلاء مقاس ثلاثة × صفر، اقلب كوبا واحدا من الشبكية على فرشاة طلاء مع وجود خلية العقدة الشبكية لأسفل.ارفع شبكية العين بلطف من السائل الدماغي الشوكي ، مع التأكد من أن توتر الماء لا يمزق الشبكية. أثناء الاستمرار في إمساك فرشاة الطلاء بشبكية العين، حرك طبق بتري الذي يحتوي على aCSF بعيدا عن الطريق وضع ورقة الترشيح البيضاء مع غشاء MCE تحت المنظار. باستخدام ماصة نقل ، ضع قطرة من aCSF في وسط ورقة ترشيح MCE.قم بتعويم شبكية العين في قطرة aCSF الناتجة عن التوتر السطحي وغشاء MCE المشحون. استخدم فرش الطلاء لوضع شبكية العين داخل القطرة مع جانب خلية العقدة الشبكية لأعلى، ثم افتح بتلات الأربعة. بمجرد وضعه ، قم بإنشاء جسر مائي بين فرشاة الطلاء وورق الترشيح الأبيض لكسر التوتر السطحي للقطرة.قم بتجميع غرفة حضانة التصوير الحي واملأها ب aCSF المؤكسج. قم بتشغيل المضخة ووحدة التحكم في درجة الحرارة ، مع التأكد من أن درجة الحرارة لا ترتفع عن 34 درجة مئوية. قد يستغرق الأمر ما يصل إلى ساعة حتى تستقر درجة حرارة الغرفة.يوصى بإعداد غرفة الحضانة قبل البدء في تشريح الشبكية. تساعد درجة حرارة الغرفة المستقرة على تقليل انحراف العينة. لنقل تل الشبكية المسطح إلى غرفة التروية، أوقف المضخة وأزل السائل الدماغي الشوكي الموجود في الغرفة.ثم ضع قرص MCE مع حامل الشبكية المسطح في غرفة الحضانة. قم بترطيب وزن العينة مسبقا لكسر التوتر السطحي ، ثم ضعه على الحامل المسطح لضمان وضع وزن العينة على ورق MCE لتقليل انحراف العينة. أعد ملء الغرفة ب aCSF الدافئ وقم بتدوير aCSF بسرعة ملليلتر واحد تقريبا في الدقيقة.ضع قطعة الأنف مع هدف غمس الماء 25 مرة في غرفة التصوير. قم بفحص الخلايا المصنفة ذات الأهمية باستخدام الضوء epifluorescent ، واضبط حجم التصوير لالتقاط الميزات المتغصنة ذات الاهتمام. باستخدام جدول بحث يحدد كلا من البيكسلات المشبعة وغير المشبعة، اضبط طاقة الليزر بحيث لا تكون البيكسلات مشبعة.الحصول على حجم التصوير 3D وتكرار الاستحواذ بمعدل الإطار المطلوب. يمكن ضبط حجم التصوير بين كل نقطة زمنية للتعويض عن انحراف العينة. استيراد سلسلة الصور، وتقسيم الصور حسب الوقت.احفظ جميع النقاط الزمنية يدويا أو عن طريق تشغيل مكون إضافي ماكرو. قم بإنشاء دالة انتشار نقطة نظرية باستخدام المكون الإضافي ImageJ بالنقر فوق Defraction PSF 3D ، وفتحة العددية للعدسة ، والطول الموجي لانبعاث الفلوروفور ، وحجم البكسل ، وتباعد Z مطلوبة لإنشاء PSF دقيق. حدد المكونات الإضافية ووحدات الماكرو وقم بالتشغيل لإجراء إزالة الالتفاف التكراري المتوازي للدفعة لجميع النقاط الزمنية باستخدام الماكرو المقدم.قم باستيراد جميع النقاط الزمنية غير المعقدة كمكدس بالنقر فوق ملف أو استيراد أو تسلسل صورة. قم بتحويل المكدس إلى مكدس تشعبي بالنقر فوق صورة، مكدسات تشعبية، ثم مكدسات إلى مكدس تشعبي. أضف عدد شرائح Z والأطر الزمنية ، ثم صحح الانجراف 3D باستخدام المكون الإضافي الصحيح 3D drift.احفظ المكدس التشعبي المصحح للانجراف 3D وقم بتحويل الصورة مرة أخرى إلى مكدس عادي بالنقر فوق الصورة ، و hyperstacks ، و hyperstack إلى مكدس ، ثم تقسيم النقاط الزمنية بالنقر فوق الصورة ، المكدسات ، الأدوات ، و مكدسات الخائن. بالنسبة لعدد المكدسات الفرعية المراد تقسيمها، أدخل عدد النقاط الزمنية. استخدم معالجة الدفعات لإنشاء عرض أقصى لجميع النقاط الزمنية.قم باستيراد تسلسل صور الفاصل الزمني بالنقر فوق ملف، استيراد، ثم تسلسل صورة. واستخدام أدوات ImageJ التقليدية للتحليل المطلوب للفيديو ثنائي الأبعاد غير المعقد والمعالج بعد المعالجة ، تم الحصول على فيديو ثلاثي الأبعاد عالي الدقة لتطوير تشعبات خلايا الانفجار النجمي ، وتفكيكها ، وتصحيحها للانجراف 3D. تم إنتاج إسقاطات قصوى على مستوى Z لإنشاء مقاطع فيديو 2D للتحليل ، تظهر منطقة من الصقل الشجيري ومنطقة من النمو الشجيري.3D deconvolution من كل نقطة زمنية زادت من دقة توقعات filopodia الدقيقة من خلية أماكرين P6 Starburst واحدة قبل وبعد إزالة الالتفاف مع ImageJ. فترات العدوى AAV المطولة لا تؤدي بالضرورة إلى زيادة إشارة الفلورسنت كما هو موضح في مستويات مماثلة من التعبير عن البروتين في خمسة و 11 يوما بعد الحقن. يعد تقليل انحراف العينة أثناء التصوير أمرا مهما.يتم تقليل الانجراف إلى الحد الأدنى من خلال الحفاظ على درجة حرارة تصوير ثابتة وتحديد موقع الوزن على العينة بشكل مناسب. في حالة حدوث انحراف ، يسمح الاكتساب اليدوي للسلسلة الزمنية بضبط حجم التصوير بين الإطارات. وهذا يضمن بقاء ميزات الاهتمام في الإطار.ينتج هذا البروتوكول مقاطع فيديو 3D عالية الدقة وخالية من التعقيد وتصحيح الانجراف لتطوير الخلايا العصبية. تؤدي مقاطع الفيديو هذه إلى فهم أفضل لأسلاك الخلايا العصبية وهي مطلوبة لتطوير طرق التحليل الحسابي للتشكل 3D. هناك حاجة إلى برامج تتبع وتتبع تلقائية أفضل لتحقيق تحليل عالي الإنتاجية لتطوير الخلايا العصبية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

داخل القحف حقن الغدة المرتبطة ناقلات فيروسية

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

والفحص عن عضوي النمط شريحة الوقت الفاصل بين التصوير عالية الدقة للهجرة الخلايا العصبية في الدماغ بعد الولادة

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

الردود تصوير الخلايا العصبية في الجهاز الاستعدادات لقطات للالميكعي تعرب عن جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

الوقت الفاصل بين التصوير للهجرة أرومة عصبية في شرائح الدماغ الأمامي الحاد للماوس الكبار

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

محرك عانى من قطع الأعصاب والوقت الفاصل بين التصوير من السلوكيات الخلايا الغروية في اسماك الزرد لايف

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير من الفأر القوقعة إإكسبلنتس

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

سوببيال الغدة المرتبطة فيروس 9 (AAV9) ناقلات تسليم في الفئران الكبار

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

طرق ونصائح للإدارة عن طريق الحقن الوريدي من الفيروسات المرتبطة بالغدد للفئران والتقييم لتوصيل الجهاز العصبي المركزي

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

والتصور وتصوير مباشر من العضيات أوليجوديندروسيتي في المخ أورجانوتيبيك الشرائح باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدد والفحص المجهري [كنفوكل]

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

التحليل الكمي لتعقيد أربوريزاتيون الجذعية العصبية في المورفولوجية

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...