Name: time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

我们感谢麦迪逊·格雷（Madison Gray）在我没有帮助的时候帮了我一把。这项研究得到了NSERC发现补助金（RGPIN-2016-06128），斯隆神经科学奖学金和加拿大研究主席Tier 2（J.L.L）的支持。S. Ing-Esteves得到了视觉科学研究计划和NSERC研究生奖学金博士的支持。

注意：该方案跨越2天，实验日之间的病毒转导最短时间为4-5天（图1A）。动物实验是根据加拿大动物护理委员会根据病童医院动物服务实验室动物使用和护理委员会批准的协议进行的，用于研究和实验动物护理。
1. 新生儿AAV注射和成像实验的准备
<ol><li>选择Cre小鼠线以标记感兴趣的视网膜细胞群。在AAV注射时，通过与Cre转基因报告基因交叉或通过Cre抗...

该视频演示了一个实验管道，该管道利用现有的遗传工具，通过共聚焦实时成像对发育中的视网膜神经元的树突动力学进行成像。还证明了将编码膜靶向荧光蛋白的Cre依赖性AAVs的眼内注射到新生小鼠中。遗传靶向群体的单细胞早在4-5 dpi时就被明确标记。为标准成像室准备视网膜平片支架以执行活细胞共聚焦成像。这种方法可以生成单个细胞及其精细投影的高分辨率延时视频。使用开源软件（包?...

视网膜神经元的树突形成复杂但特定的模式，影响它们在神经回路中的功能。在脊椎动物视网膜中，不同类型的视网膜神经节细胞（RGC）和柏宁细胞中间神经元具有独特的树突形态，其树突形态在心轴大小、位置、分支长度和密度上有所不同1。在产后发育过程中，RGC和amcrine细胞将旺盛的树突突延伸到称为内丛状层（IPL）的神经瞳孔中，在那里它们接收双极细胞输入，发送光感受器信号2。通过对雏鸡或斑马鱼幼虫中荧光标记的视网膜种群进行延时成像捕获，树突形态发生具有高度动态性3，4，5。在几天内，树突状乔木膨胀，重塑并撞击到IPL的狭窄子层，在那里它们与选定的伙伴突触。乔木在发育过程中表现出不同的结构动力学，分支增加，收缩和稳定的相对速率发生变化。Amacrine和RGC枝晶也表现出不同的生长和重塑行为，这可能反映了特定类型的树木化。然而，这些研究追踪了广泛的amcrine或RGC群体，并专注于层流靶向，这只是形态学的一个方面。
产生在视网膜亚型中观察到的巨大形态多样性的机制知之甚少。该小组的目标是开发一种方法来捕获小鼠中定义的视网膜亚型的树突动力学和乔木重塑。识别树突图案化的细胞类型特异性机制需要可视化和测量目标细胞的树突行为的方法。小鼠视网膜的器官型培养非常适合使用共聚焦或多光子显微镜的活细胞成像研究。将发育中的视网膜解剖并安装到平坦的外植体中，该外植体可以在记录室中成像数小时或在几天内培养，对电路的影响有限6，7。活的视网膜神经元可以通过多种技术进行标记，包括通过电极填充染料，电穿孔，涂有亲脂性染料或编码荧光蛋白的质粒（例如，Gene Gun）的颗粒的生物传递，以及遗传编码的细胞标签7，8，9，10.然而，这些方法对于特定视网膜亚型的树突动力学成像效率低下。例如，染料填充方法的通量较低，需要电生理学设备和额外的遗传标记才能可靠地靶向感兴趣的细胞。此外，体细胞中的强荧光信号会遮挡附近的树突。
生物基因递送方法可以同时标记数十个细胞，但涉及高压颗粒递送和孤立视网膜过夜孵育的步骤可能会损害细胞生理学和树突生长。本文提出，根据以下实验标准，可以利用最近的遗传工具来捕获具有细胞类型和结构分辨率的早期树突动力学。首先，为了解决主导发育中的乔木的细枝和丝状体，该方法应该用明亮的荧光蛋白标记神经元，这些蛋白填充了整个心轴中的过程。在成像期间，荧光标记不应因光漂白而褪色。已经生成了多种荧光蛋白变体，并根据亮度和光稳定性比较了其对体内/离体成像的适用性11 。其次，荧光蛋白（XFPs）必须在树突形态发生的最早阶段以足够高的水平表达，以便不会错过狭窄的发育窗口。在对小鼠视网膜静态时间点的分析中，树突发育发生在出生后的第一周，包括生长，重塑和稳定阶段10，12，13，14，15。第三，该方法应导致选择性标记或增加感兴趣的神经元亚群的标记概率。第四，目标亚群的标记必须足够稀疏，以便可以识别和追踪整个神经元乔木。虽然RGC和amacrine亚型可以通过其成熟的形态特征和IPL分层模式来区分16，17，18，19，20，但挑战在于基于未成熟结构在发育过程中识别亚型。通过扩增转基因工具在发育过程中标记特定的视网膜细胞类型，可以促进这项任务。
转基因和敲入小鼠品系，其中荧光蛋白或Cre的细胞和时间表达由基因调节元件决定，被广泛用于研究视网膜细胞类型13，21，22，23。对树突发育亚型特异性模式的关键观察来自静态时间点对转基因小鼠视网膜的研究10，14，24，25。特别是Cre-Lox系统，它可以使用各种重组酶依赖性报告基因，传感器和光遗传学激活剂对亚型进行精细的基因操作和监测。这些工具导致了亚型特异性分子程序和功能特性的发现，这些功能特性是视网膜电路组装的基础26，27，28，29，30。然而，它们尚未被用于研究小鼠视网膜中亚型特异性的树突动力学。通过将Cre小鼠品系与通过电穿孔或重组AAV引入的转基因相结合，可以实现低密度标记。如果可行，也可以使用他莫昔芬诱导的Cre系或交叉遗传策略。最后，应以微创方式标记细胞，并使用采集参数进行成像，以免损害组织或干扰树突形态发生所需的细胞功能。
这里介绍的是一种应用转基因工具和共聚焦显微镜来研究活小鼠视网膜外植体中的树突动力学的方法。Cre转基因小鼠品系已与AAV载体相结合，后者在Cre重组时表达荧光蛋白，这允许对感兴趣的视网膜细胞进行稀疏标记。市售的 AAV 通过玻璃体内注射输送到新生儿视网膜。本文表明，AAV以4 dpi产生显着的高和细胞类型特异性荧光表达，允许访问产后时间点。为了说明这种方法，通过在表达胆碱乙酰转移酶（ChAT）-内部核糖体进入位点（IRES）-Cre转基因的新生小鼠中传递Brainbow AAV来标记胆碱能“星爆”amacrine中间神经元，该基因在产后早期视网膜中活跃31，32。Starburst amacrine细胞发展出一种刻板的放射状乔木形态，由簇状的原钙粘蛋白介导的树突自我回避形成33，34。本文表明，通过添加用于Brainbow AAVs31的经过法呢基化的CAAX基序，XFP显着提高了星爆树突和丝状体的分辨率。最后，已经确定了延时成像和后处理方案，可产生适合树突重建和形态量化的高质量图像。该协议可用于识别控制树突形态发生的因素，并捕获完整视网膜中的几种细胞行为。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45185-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45186-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HABG01 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 50 &#215; 15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470313-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene disposable transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tip paint brush, size 3/0</td>
			<td>Conventional art supply store</td>
			<td></td>
			<td>Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-imaging incubation system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber polyethylene tubing, PE-160 10&#39;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel heater controller, Model TC-344C</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater controller cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CC-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large bath incubation chamber with slice support</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample anchor (Harps)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0260</td>
			<td>Sample anchor must be compatible with incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sloflo In-line Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Microliter Syringe Series 700, Removable Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)&#160;</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2453</td>
			<td>Addgene Plasmid #45185&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 
			1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2454</td>
			<td>Addgene Plasmid #45186</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF Dye content &#8805;85 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tattoo paste</td>
			<td>Ketchum MFG Co</td>
			<td>329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>PV-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>Supplier may vary depending on region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH35317.604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>Open source</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations

发现树突状乔木的模式需要方法在发育过程中可视化，成像和分析树突。小鼠视网膜是一个强大的模型系统，用于研究神经元形态发生和连接的细胞类型特异性机制。视网膜亚型的组织和组成是明确的，遗传工具可用于在发育过程中访问特定类型。许多视网膜细胞类型也将其树突和/或轴突限制在狭窄的层，这有助于延时成像。小鼠视网膜外植体培养物非常适合使用共聚焦或多光子显微镜进行活细胞成像，但缺乏针对具有时间和结构分辨率的树突动力学成像优化的方法。这里介绍的是一种稀疏地标记和成像由Cre-Lox系统标记的特定视网膜群体发展的方法。这里使用的市售腺相关病毒（AAV）以Cre依赖性方式表达膜靶向荧光蛋白。新生儿小鼠中AAV的眼内递送在注射后4-5天（dpi）产生靶向细胞类型的荧光标记。膜荧光信号可通过共聚焦成像进行检测，并解析精细的分支结构和动力学。从充满含氧人工脑脊液（aCSF）的视网膜平片成像仪获取跨越2-4小时的高质量视频。还提供了用于反卷积和三维（3D）漂移校正的图像后处理管道。该协议可用于捕获完整视网膜中的几种细胞行为，并确定控制神经突起形态的新因素。在视网膜中学到的许多发育策略将与理解中枢神经系统其他地方的神经回路的形成有关。

使用上述协议，采集了星爆细胞枝晶发育的高分辨率3D视频，对其进行了解卷积，并针对3D漂移进行了校正。生成Z平面最大投影以制作用于分析的2D视频（补充视频1， 图5A）。每个时间点的3D反卷积提高了细丝状突起的分辨率（图5B，C）。细丝状突起是视网膜树突发育的特征36 ，在影像学检查过程中应可见。AA...

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Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

在这里，我们提出了一种通过延时共聚焦显微镜研究产后小鼠视网膜外植体中神经突形态发生的方法。我们描述了一种使用重组腺相关病毒载体（以 Cre依赖性方式表达膜靶向荧光蛋白）对视网膜细胞类型及其精细过程进行稀疏标记和获取的方法。

使用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向视网膜细胞群的神经元树化延时成像

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

需要单细胞标记和树突或轴突乔木的可视化来研究神经元形态发生。通过以微创方式标记发育中的心轴，视网膜组织保持健康，适合长时间共聚焦活体成像。该方法的主要优点是能够在注射后四天内可视化具有多色荧光蛋白的单个心轴。这使得研究新生儿乔木形态学成为可能。该注射成像和分析方案可用于研究整个中枢神经系统的神经元形态。必须确定适当的Cre选择和注射位置以靶向感兴趣的细胞群。首先选择Cre小鼠线来标记感兴趣的视网膜细胞群。获得编码荧光蛋白的重组酶依赖性AAV病毒。为了对精细过程进行最佳标记，请选择表达靶向质膜的修饰荧光蛋白的载体。对于冰上的AAV等分试样，并使用无菌盐水或PBS制备一到四个AAV稀释液。为了可视化注射，通过每15微升AAV稀释液添加约一微升0.02%快速绿色FCF染料溶液，将溶液染成蓝色。用70%乙醇灭菌注射区域。使用微量注射器用AAV稀释液回填微量移液器。在体视显微镜下，用30号针头打破微量移液器尖端以解封尖端。麻醉新生小鼠后，使用30号针头用纹身墨水纹身爪垫以识别动物。收集尾部剪报以进行DNA分离和基因分型。用70%乙醇擦拭覆盖眼睛的皮肤。使用30号针打开融合的眼睑，同时用手指轻轻按压以睁开眼睛。在角膜巩膜交界处的角膜上戳一个小孔。将玻璃微量移液器插入孔中，然后按压微型喷油器脚踏板两到四次，将AAV注入玻璃体内空间。慢慢取出微量移液管，并通过可视化瞳孔中的蓝色染料来确认AAV注射。按照文本手稿中所述制备视网膜aCSF后，通过用碳水化合物冒泡至少15分钟来氧化视网膜aCSF，然后将pH值调节至7.4。将直径为60毫米的培养皿嵌入冰盘中，并用含氧视网膜aCSF填充。将装满的培养皿置于体视显微镜下。接下来，切开安乐死小鼠的眼睑瓣以暴露眼睛。使用钝镊子对眼睛进行去核，并将其转移到置于体视显微镜下的冷视网膜aCSF中。在立体显微镜下，使用Dumont五号镊子扣住视神经来稳定眼睛，并用30号针头在角膜中心戳一个洞，然后将微型剪刀的一个尖端插入孔中，从孔到角膜末端做一个切口。重复此步骤，在基本方向上制作四个切片，形成四个襟翼。抓住并拉开两个相邻的皮瓣，轻轻地将巩膜从视网膜上剥离所有角膜皮瓣。然后使用镊子从视网膜杯中取出晶状体。最后，使用微型剪刀从视网膜边缘向视神经做四个桡向切口，形成四个相等的花瓣。如果使用大直径灰色MCE膜过滤器进行安装，请将圆盘切成大约一厘米宽的象限，然后将MCE圆盘放在较大的白色滤纸的中心。使用两个尺寸的三乘零油漆刷，将一个视网膜杯翻转到油漆刷上，视网膜神经节细胞面朝下。轻轻地将视网膜从aCSF中抬起，确保水张力不会撕裂视网膜。在仍然拿着带有视网膜的画笔的同时，将含有acSF的培养皿移开，并将带有MCE膜的白色滤纸放在立体镜下。使用转移移液器，将一滴aCSF滴放在MCE滤纸的中心。将视网膜漂浮到由表面张力和带电的MCE膜产生的aCSF液滴中。使用画笔将视网膜定位在液滴内，视网膜神经节细胞朝上，然后展开四片花瓣。定位后，在画笔和白色滤纸之间形成一个水桥，以打破液滴的表面张力。组装活体成像孵育室，并用含氧的aCSF填充。打开泵和温度控制器，确保温度不会上升到34摄氏度以上。腔室温度可能需要长达一个小时才能稳定下来。建议在开始视网膜解剖之前设置孵育室。稳定的腔室温度有助于减少样品漂移。要将视网膜扁平丘转移到灌注室中，请停止泵并取出腔室中的aCSF。然后将带有视网膜扁平支架的MCE盘放入孵育室。预润湿样品砝码以破坏表面张力，然后将其放在平坦的支架上，确保将样品砝码放在MCE纸上以减少样品漂移。用加热的aCSF重新填充腔室，并以每分钟约一毫升的速度循环aCSF。将物镜转换器与25次浸水物镜一起放入成像室中。使用落射荧光筛选感兴趣的标记细胞，并调整成像体积以捕获感兴趣的树突状特征。使用识别过饱和和和不足像素的查找表，调整激光功率，使没有像素过饱和。采集 3D 成像体积并以所需的帧速率重复采集。可以在每个时间点之间调整成像体积，以补偿样品漂移。导入图像系列，按时间拆分图像。手动保存所有时间点或通过运行宏插件。通过单击 Defraction PSF 3D 使用 ImageJ 插件创建理论点扩散函数，需要镜头数值孔径、荧光团发射波长、像素大小和 Z 间距才能创建准确的 PSF。选择插件、宏并运行以使用提供的宏对所有时间点执行批量并行迭代反卷积。通过单击文件，导入和图像序列，将所有非卷积时间点作为堆栈导入。通过单击图像，超堆栈，然后将堆栈转换为超堆栈，将堆栈转换为超堆栈。添加 Z 切片和时间帧的数量，然后使用正确的 3D 漂移插件更正 3D 漂移。保存 3D 漂移校正超堆栈，并通过单击图像、超堆栈、超堆栈到堆栈将图像转换回常规堆栈，然后通过单击图像、堆栈、工具和堆栈拆分器来拆分时间点。对于要拆分的子堆栈数，请输入时间点数。使用批处理为所有时间点创建最大投影。通过单击文件、导入和图像序列来导入延时图像序列。并使用传统的ImageJ工具对解卷积和后处理的二维视频进行所需的分析，获取，解卷并校正3D漂移的高分辨率3D视频， 以发展星爆细胞树突。制作了Z平面最大投影以制作用于分析的2D视频，显示树突细化区域和树突生长区域。每个时间点的3D反卷积提高了ImageJ反卷积前后单个P6星爆阱膜细胞的精细丝状突起的分辨率。延长的AAV感染期并不一定导致荧光信号增加，如注射后5天和11天蛋白质表达水平相似所示。减少成像过程中的样品漂移非常重要。通过保持一致的成像温度和在样品上适当定位重量，可以最大限度地减少漂移。如果发生漂移，手动采集时间序列允许在帧之间调整成像体积。这可确保感兴趣的功能保留在帧中。该协议可生成开发神经突起的高分辨率、反卷积和漂移校正 3D 视频。这些视频可以更好地理解神经元布线，并且是推进3D形态发生计算分析方法所必需的。需要更好的自动跟踪和跟踪软件来实现神经突起开发的高通量分析。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

颅内注射腺相关病毒载体

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

科研

神经科学

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

对于高分辨率延时成像神经细胞迁移的一个器官型产后脑切片检测

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

在犁鼻器官的切片准备工作表示一个基因编码的钙传感器成像神经元的反应

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

急性片的成年小鼠前脑的神经细胞迁移的延时成像

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

电机神经切断和时间推移成像胶质细胞行为在现场斑马鱼

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

老鼠耳蜗外植体的长期时间推移成像

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

在成年小鼠中的亚型腺相关病毒9（AAV9）载体递送

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

腺相关病毒对大鼠的静脉管理方法和技巧及中枢神经系统转导的评价

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

腺相关病毒和共聚焦显微镜对器官脑切片胶质细胞器的可视化和实时成像

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

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嗜德维人神经元树突状树突状复杂度的定量分析

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...