Name: time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Vi takker Madison Gray for at give mig en hånd, da jeg ikke havde nogen. Denne forskning blev støttet af et NSERC Discovery Grant (RGPIN-2016-06128), et Sloan Fellowship i neurovidenskab og en Canada Research Chair Tier 2 (til LER). S. Ing-Esteves blev støttet af Vision Science Research Program og NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral.

BEMÆRK: Denne protokol strækker sig over 2 dage med en minimumsperiode på 4-5 dage for viral transduktion mellem forsøgsdage (figur 1A). Dyreforsøg udføres i overensstemmelse med Canadian Council on Animal Care Guidelines for Use of Animals in Research and Laboratory Animal Care i henhold til protokoller godkendt af Laboratory of Animal Services Animal Use and Care Committee på Hospital for Sick Children (Toronto, Canada).
1. Forberedelser til neonatale AAV-i...

Denne video demonstrerer en eksperimentel pipeline, der bruger eksisterende genetiske værktøjer til at afbilde dendritdynamik ved udvikling af retinale neuroner med konfokal live-imaging. Også demonstreret er intraokulære injektioner af Cre-afhængige AAV'er, der koder membranmålrettede fluorescerende proteiner i neonatale mus. Enkeltceller fra genetisk målrettede populationer er stærkt mærket så tidligt som 4-5 dpi. Retinale fladmonteringer blev forberedt til standard billeddannelseskamre til at udføre levende...

Dendritter af retinale neuroner danner indviklede, men specifikke mønstre, der påvirker deres funktion inden for neurale kredsløb. I hvirveldyrens nethinde bærer forskellige typer retinale ganglionceller (RGC'er) og amakrine celleinterneuroner unikke dendritiske morfologier, der adskiller sig i arborstørrelse, placering, grenlængde og densitet1. Under postnatal udvikling udvider RGC'er og amakrine celler sprudlende dendritiske processer til en neuropil kaldet det indre plexiformlag (IPL), hvor de modtager bipolære celleindgange, der transmitterer fotoreceptorsignaler2. Som fanget af time-lapse-billeddannelse af fluorescerende mærkede retinale populationer i kyllinger eller zebrafisklarver er dendritmorfogenese meget dynamisk3,4,5. Inden for få dage udvides, ombygges og forgrenes dendritiske arbors til smalle underlag i IPL, hvor de synapser med udvalgte partnere. Arbors udviser forskellige strukturelle dynamikker over udvikling, med ændringer i relative satser for grentilsætning, tilbagetrækning og stabilisering. Amakrine og RGC dendritter udviser også forskellige udvækst og ombygning adfærd, der kan afspejle typespecifik arborisering. Disse undersøgelser spores imidlertid brede amakrine eller RGC-populationer og fokuserede på laminær målretning, hvilket kun er et aspekt af morfologi.
De mekanismer, der producerer den enorme morfologiske mangfoldighed, der observeres på tværs af retinale undertyper, forstås dårligt. Formålet med denne gruppe var at udvikle en metode til at fange dendritdynamik og arbor-ombygning af definerede retinale undertyper i mus. Identifikation af celletypespecifikke mekanismer for dendritmønster kræver metoder til at visualisere og måle dendritadfærd hos celler af interesse. Organotypiske kulturer af musenethinden er velegnede til levende cellebilleddannelsesundersøgelser ved hjælp af konfokal eller multifotonmikroskopi. Udviklende nethinden dissekeres og monteres i et fladt eksplant, der kan afbildes i flere timer i et optagekammer eller dyrkes over et par dage med begrænsede virkninger på kredsløbet6,7. Levende retinale neuroner kan mærkes ved hjælp af en række teknikker, herunder farvestoffyldning med elektroder, elektroporation, biolistisk levering af partikler belagt med lipofile farvestoffer eller plasmider, der koder for fluorescerende proteiner (f.eks. Gene Gun), samt genetisk kodede celleetiketter7,8,9,10 . Disse tilgange er imidlertid ineffektive til billeddannelse af dendritdynamik af specifikke retinale undertyper. For eksempel er farvestoffyldningsmetoder lavgennemstrømning og kræver elektrofysiologiske apparater og yderligere genetiske etiketter for pålideligt at målrette mod celler af interesse. Desuden kan de stærke fluorescenssignaler i soma skjule nærliggende dendritter.
Biolistiske genleveringsmetoder kan samtidig mærke snesevis af celler, men trin, der involverer højtrykspartikellevering og inkubering natten over af isoleret nethinden, kan kompromittere cellefysiologi og dendritisk udvækst. Dette papir foreslår, at nyere genetiske værktøjer kan anvendes til at fange tidlig dendritdynamik med celletype og strukturel opløsning i betragtning af følgende eksperimentelle kriterier. For det første for at løse de fine grene og filopodier, der dominerer udviklende arbors, skal metoden mærke neuroner med lyse, fluorescerende proteiner, der fylder processer i hele arboret. Fluorescensmærkningen bør ikke falme på grund af fotoblevask i billeddannelsesperioden. En række fluorescerende proteinvarianter er blevet genereret og sammenlignet med hensyn til egnethed til in vivo/ex vivo-billeddannelse11 baseret på lysstyrke og fotostabilitet. For det andet skal de fluorescerende proteiner (XFP'er) udtrykkes på tilstrækkeligt høje niveauer af det tidligste stadium af dendritmorfogenese, således at det smalle udviklingsvindue ikke går glip af. I analyser af statiske tidspunkter i musenethinden sker dendritudvikling i løbet af den første postnatale uge og omfatter faser af udvækst, ombygning og stabilisering10,12,13,14,15. For det tredje bør metoden føre til selektiv mærkning eller til en øget sandsynlighed for mærkning af den neuronale underpopulation af interesse. For det fjerde skal mærkningen af måldelpopulationen være tilstrækkelig sparsom, således at hele neuronal arbor kan identificeres og spores. Selvom RGC og amakrine undertyper kan skelnes ved deres modne morfologiske egenskaber og IPL-stratificeringsmønstre16,17,18,19,20, er udfordringen at identificere undertyper under udvikling baseret på umodne strukturer. Denne opgave lettes af udvidelsen af transgene værktøjer til at mærke specifikke retinale celletyper under udvikling.
Transgene og knock-in muselinjer, hvor cellulær og tidsmæssig ekspression af fluorescerende proteiner eller Cre bestemmes af genregulerende elementer, anvendes i vid udstrækning til at studere retinale celletyper13,21,22,23. Nøgleobservationer om subtypespecifikke mønstre for dendritudvikling er kommet fra undersøgelser af transgene musenethinden på statiske tidspunkter10,14,24,25. Cre-Lox-systemet muliggør især udsøgt genmanipulation og overvågning af undertyper ved hjælp af en række rekombinaseafhængige journalister, sensorer og optogenetiske aktivatorer. Disse værktøjer har ført til opdagelser af subtypespecifikke molekylære programmer og funktionelle egenskaber, der ligger til grund for retinal kredsløbssamling26,27,28,29,30. De er dog endnu ikke udnyttet til at studere subtypespecifik dendritdynamik i musenehinden. Mærkning med lav densitet kan opnås ved at kombinere Cre-muselinjer med transgener indført ved elektroporation eller ved rekombinante AAV'er. Hvis det er tilgængeligt, kan tamoxifen-inducerbare Cre-linjer eller intersektionelle genetiske strategier også anvendes. Endelig skal cellen mærkes på en minimalt invasiv måde og afbildes ved hjælp af erhvervelsesparametre for ikke at kompromittere vævet eller forstyrre den cellulære funktion, der kræves til dendritmorfogenese.
Præsenteret her er en metode til at anvende transgene værktøjer og konfokal mikroskopi til at undersøge dendritdynamik i levende mus retinale eksplantenter. Cre transgene muselinjer er blevet kombineret med AAV-vektorer, der udtrykker fluorescerende proteiner ved Cre-rekombination, hvilket giver mulighed for sparsom mærkning af retinale celler af interesse. Kommercielt tilgængelige AAV'er leveres til neonatal nethinden ved intravitreale injektioner. Dette papir viser, at AAV'er producerer signifikant høje og celletypespecifikke fluorescerende udtryk med 4 dpi, hvilket giver adgang til postnatale tidspunkter. For at illustrere denne tilgang, den kolinerge "starburst" amakrine interneuron blev mærket ved at levere Brainbow AAV i neonatale mus, der udtrykker cholin acetyltransferase (ChAT)-internt ribosom entry site (IRES)-Cre transgen, som er aktiv i den tidlige postnatale nethinden31,32. Starburst amakrine celler udvikler en stereotyp og radial arbor morfologi, der er formet af dendrit selvundgåelse medieret af de klyngede protocadheriner33,34. Dette papir viser, at opløsningen af stjerneskudsdendritter og filopodier forbedres signifikant af XFP'er til plasmamembranen med tilføjelsen af CAAX-motivet, der gennemgår farnesylering, som anvendt til Brainbow AAV'erne31. Endelig er time-lapse-billeddannelse og efterbehandlingsprotokoller blevet bestemt, der producerer billeder af høj kvalitet, der er modtagelige for dendritrekonstruktion og morfometrisk kvantificering. Denne protokol kan bruges til at identificere faktorer, der styrer dendritmorfogenese og til at fange flere cellulære adfærd i den intakte nethinden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45185-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45186-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HABG01 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 50 &#215; 15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470313-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene disposable transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tip paint brush, size 3/0</td>
			<td>Conventional art supply store</td>
			<td></td>
			<td>Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-imaging incubation system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber polyethylene tubing, PE-160 10&#39;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel heater controller, Model TC-344C</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater controller cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CC-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large bath incubation chamber with slice support</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample anchor (Harps)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0260</td>
			<td>Sample anchor must be compatible with incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sloflo In-line Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Microliter Syringe Series 700, Removable Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)&#160;</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2453</td>
			<td>Addgene Plasmid #45185&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 
			1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2454</td>
			<td>Addgene Plasmid #45186</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF Dye content &#8805;85 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tattoo paste</td>
			<td>Ketchum MFG Co</td>
			<td>329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>PV-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>Supplier may vary depending on region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH35317.604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>Open source</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations

Opdagelse af mekanismer, der mønstrer dendritiske arbors, kræver metoder til at visualisere, afbilde og analysere dendritter under udvikling. Musens nethinde er et kraftfuldt modelsystem til undersøgelse af celletypespecifikke mekanismer for neuronal morfogenese og forbindelse. Organiseringen og sammensætningen af retinale undertyper er veldefineret, og genetiske værktøjer er tilgængelige for at få adgang til specifikke typer under udvikling. Mange retinale celletyper begrænser også deres dendritter og / eller axoner til smalle lag, hvilket letter time-lapse-billeddannelse. Musens nethindeeksplanteringskulturer er velegnede til levende cellebilleddannelse ved hjælp af konfokal eller multifotonmikroskopi, men metoder, der er optimeret til billeddannelse af dendritdynamik med tidsmæssig og strukturel opløsning, mangler. Præsenteret her er en metode til sparsomt at mærke og afbilde udviklingen af specifikke retinale populationer præget af Cre-Lox-systemet. Kommercielt tilgængelige adenoassocierede vira (AAV'er), der anvendes her, udtrykte membranmålrettede fluorescerende proteiner på en Cre-afhængig måde. Intraokulær levering af AAV'er i neonatale mus producerer fluorescerende mærkning af målrettede celletyper 4-5 dage efter injektion (dpi). Membranens fluorescerende signaler kan detekteres ved konfokal billeddannelse og løser fine grenstrukturer og dynamik. Videoer i høj kvalitet, der spænder over 2-4 timer, erhverves fra billeddannelse af retinale flade monteringer perfuseret med iltet kunstig cerebrospinalvæske (aCSF). Der findes også en billedbehandlingsrørledning til dekonvolution og tredimensionel (3D) afdriftkorrektion. Denne protokol kan bruges til at fange flere cellulære adfærd i den intakte nethinde og til at identificere nye faktorer, der styrer neuritmorfogenese. Mange udviklingsstrategier, der læres i nethinden, vil være relevante for at forstå dannelsen af neurale kredsløb andre steder i centralnervesystemet.

Ved hjælp af ovenstående protokol blev en højopløselig 3D-video af udvikling af starburstcelledendritter erhvervet, dekonvolveret og korrigeret for 3D-drift. Z-plan maksimale fremskrivninger blev produceret for at lave 2D-videoer til analyse (supplerende video 1, figur 5A). 3D-dekonvolution af hvert tidspunkt øgede opløsningen af fine filopodia-fremskrivninger (figur 5B,C). Fine filopodia fremspring er et træk ved at udvi...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Her præsenterer vi en metode til undersøgelse af neuritmorfogenese i postnatal mus retinale eksplantenter ved time-lapse konfokal mikroskopi. Vi beskriver en tilgang til sparsom mærkning og erhvervelse af retinale celletyper og deres fine processer ved hjælp af rekombinante adeno-associerede virusvektorer, der udtrykker membranmålrettede fluorescerende proteiner på en Cre-afhængig måde.

Time-Lapse billeddannelse af neuronal arborisering ved hjælp af sparsom adeno-associeret virusmærkning af genetisk målrettede retinale cellepopulationer

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Enkeltcellemærkning og visualisering af dendritiske eller aksonale arbors er påkrævet for at studere neuronal morfogenese. Ved at mærke udviklende arbors på en minimalt invasiv måde forbliver retinalvæv sundt og egnet til langvarig konfokal levende billeddannelse. Den største fordel ved denne metode er evnen til at visualisere individuelle arbors med flerfarvede fluorescerende proteiner inden for fire dage efter injektionen.Dette gør det muligt at studere neonatale arbormorfologier. Denne injektionsbilleddannelses- og analyseprotokol kan bruges til at studere neuronale morfologier på tværs af centralnervesystemet. Passende Cre-udvælgelse og injektionssted skal bestemmes for at målrette mod cellepopulationen af interesse.Begynd med at vælge en Cre-muselinje for at mærke de retinale cellepopulationer af interesse. Opnå rekombinaseafhængig AAV-virus, der koder for fluorescerende proteiner. For optimal mærkning af fine processer skal du vælge vektorer, der udtrykker modificerede fluorescerende proteiner rettet mod plasmamembranen.For AAV aliquot på is, og forberede en en til fire AAV fortynding ved hjælp af steril saltvand eller PBS. For at visualisere injektionerne skal opløsningen farves blå ved at tilsætte ca. en mikroliter 0,02% Fast Green FCF-farvestofopløsning for hver 15 mikroliter AAV-fortynding. Steriliser injektionsområdet med 70% ethanol.Genopfyld mikropipetten med AAV-fortyndingen ved hjælp af en mikrosyring. Under et stereomikroskop skal du bryde mikropipettespidsen med en 30-gauge nål for at løsne spidsen. Efter bedæstning af de neonatale mus, tatovere deres pote puder med tatoveringsblæk ved hjælp af en 30-gauge nål til at identificere dyrene.Saml haleafklip til DNA-isolering og genotypning. Swab huden over øjnene med 70% ethanol. Brug en 30-gauge nål til at åbne det smeltede øjenlåg, mens du anvender let tryk med fingrene for at åbne øjet.Stik et lille hul gennem hornhinden ved hornhinde sclera krydset. Indsæt glasmikropipetten i hullet, og tryk på mikroinjektorfodpedalen to til fire gange for at injicere AAV i det intravitreale rum. Fjern langsomt mikropipetten, og bekræft AAV-injektionen ved at visualisere det blå farvestof i pupillen.Efter at have forberedt retinal aCSF som beskrevet i tekstmanuskriptet, iltes den retinale aCSF ved at boble med carbogen i mindst 15 minutter, og pH justeres derefter til 7,4. Integrer en petriskål med en diameter på 60 millimeter i en isbakke og fyld den med iltet retinal aCSF. Placer den fyldte petriskål under et stereomikroskop.Skær derefter øjenlågsklappen på den aflivede mus for at udsætte øjet. Brug stump tang til at enukleere øjnene og overføre dem til den kolde retinale aCSF placeret under stereomikroskopet. Under stereomikroskopet stabiliseres øjet ved at klemme den optiske nerve ved hjælp af Dumont nummer fem tang og stikke et hul i midten af hornhinden med en 30 gauge nål, og indsæt derefter en spids af mikrosaksen i hullet for at lave et snit fra hullet til enden af hornhinden.Gentag for at lave fire skiver i kardinalretningerne, og skab fire klapper. Tag fat i og træk de to tilstødende klapper fra hinanden, og skræl forsigtigt scleraen fra nethinden for alle hornhindeklapperne. Fjern derefter linsen fra retinalkoppen ved hjælp af tangen.Endelig skal du bruge mikrosaks til at lave fire radiale snit fra kanten af nethinden mod synsnerven, hvilket skaber fire lige store kronblade. Hvis du bruger grå MCE-membranfiltre med stor diameter til montering, skal du skære disken i kvadranter cirka en centimeter på tværs og derefter placere MCE-disken på midten af et større hvidt filterpapir. Brug to størrelse tre til nul pensler til at vende en retinal kop på en pensel med retinal ganglion celle side nedad.Løft forsigtigt nethinden ud af aCSF'en, og sørg for, at vandspændingen ikke river nethinden. Mens du stadig holder penslen med nethinden, skal du flytte petriskålen, der indeholder aCSF, af vejen og placere det hvide filterpapir med MCE-membranen under stereoskopet. Brug en overførselspipette til at placere en dråbe aCSF i midten af MCE-filterpapiret.Flyd nethinden ind i aCSF-dråben skabt af overfladespændingen og den ladede MCE-membran. Brug pensler til at placere nethinden i dråben med retinal ganglion cellesiden op, og fold derefter de fire kronblade ud. Når den er placeret, skal du oprette en vandbro mellem penslen og det hvide filterpapir for at bryde dråbens overfladespænding.Saml inkubationskammeret til levende billeddannelse, og fyld det med iltet aCSF. Tænd for pumpen og temperaturregulatoren, og sørg for, at temperaturen ikke stiger over 34 grader Celsius. Det kan tage op til en time, før kammertemperaturen stabiliseres.Det anbefales at oprette inkubationskammeret, inden retinal dissektion påbegyndes. Stabil kammertemperatur hjælper med at reducere prøveafdrift. For at overføre den retinale flade høj til perfusionskammeret skal du stoppe pumpen og fjerne aCSF'en, der er i kammeret.Anbring derefter MCE-skiven med det retinale flade beslag i inkubationskammeret. Forvæd en prøvevægt for at bryde overfladespændingen, og anbring den derefter på det flade beslag, der sikrer, at prøvevægten placeres på MCE-papiret for at reducere prøveafdrift. Genopfyld kammeret med den opvarmede aCSF, og cirkulere aCSF med ca. en milliliter pr. Minut.Placer næsestykket med det 25 gange vanddyppende mål i billedkammeret. Screen for mærkede celler af interesse ved hjælp af epifluorescerende lys, og juster billedvolumenet for at fange dendritiske træk af interesse. Brug en opslagstabel, der identificerer både overmættede og undermættede pixels, til at justere lasereffekten, så ingen pixels er overmættede.Hent 3D-billedvolumen, og gentag anskaffelsen med den ønskede billedhastighed. Billedvolumen kan justeres mellem hvert tidspunkt for at kompensere for prøveafdrift. Importer billedserien, op del billederne efter tid.Gem alle tidspunkter manuelt eller ved at køre et makro-plugin. Opret en teoretisk punktspredningsfunktion ved hjælp af ImageJ-pluginet ved at klikke på Defraction PSF 3D, objektivets numeriske blænde, fluoroforemissionsbølgelængde, pixelstørrelse og Z-afstand er nødvendige for at oprette en nøjagtig PSF. Vælg plugins, makroer og kør for at udføre batch parallel iterativ dekonvolution for alle tidspunkter ved hjælp af den medfølgende makro.Importer alle dekonvolverede tidspunkter som en stak ved at klikke på fil, importere og derefter billedsekvens. Konverter stakken til en hyperstack ved at klikke på billede, hyperstacks og derefter stable til hyperstack. Tilføj antallet af Z-skiver og tidsrammer, og korriger derefter 3D-driften ved hjælp af det korrekte 3D-drift-plugin.Gem den 3D-drift korrigerede hyperstack, og konverter billedet tilbage til en almindelig stak ved at klikke på billede, hyperstacks, hyperstack for at stable, og opdel derefter tidspunkterne ved at klikke på billede, stakke, værktøjer og stakke splitter. Angiv antallet af tidspunkter for at opdele antallet af understakke. Brug batchbehandling til at oprette en maksimal projektion for alle tidspunkter.Importer timelapse-billedsekvensen ved at klikke på Fil, importere og derefter på billedsekvens. Og brug konventionelle ImageJ-værktøjer til den ønskede analyse af dekonvolveret og postbehandlet todimensionel video, En 3D-video i høj opløsning af udvikling af starburst-celledendritter blev erhvervet, dekonvolveret og korrigeret for 3D-drift. Z-plan maksimale fremskrivninger blev produceret for at lave 2D-videoer til analyse, der viser et område med dendritisk forfining og et område med dendritisk udvækst.3D-dekonvolution af hvert tidspunkt øgede opløsningen af fine filopodia-fremskrivninger af enkelt P6-stjerneskud amakrin celle før og efter dekonvolution med ImageJ. Langvarige AAV-infektionsperioder fører ikke nødvendigvis til øget fluorescerende signal, som det fremgår af lignende niveauer af proteinekspression fem og 11 dage efter injektionen. Det er vigtigt at reducere prøveafdrift under billeddannelse.Afdrift minimeres ved at opretholde en ensartet billedtemperatur og ved at placere vægten på prøven korrekt. Hvis der opstår afdrift, giver manuel erhvervelse af tidsserien mulighed for justering af billedvolumen mellem rammer. Dette sikrer, at funktionerne af interesse forbliver i rammen.Denne protokol producerer høj opløsning, dekonvolveret og driftkorrigeret 3D-videoer af udvikling af neuritter. Sådanne videoer fører til en bedre forståelse af neuronledninger og er nødvendige for at fremme beregningsmæssige analysemetoder til 3D-morfogenese. Bedre automatisk sporings- og sporingssoftware er nødvendig for at opnå analyse af neuritudvikling med høj kapacitet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Imaging Neuronal Svar på Slice Varer af Vomeronasal Organ udtryk for en genetisk kodet Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse Imaging af neuroblast Migration i Akutte Skiver af den voksne Mouse forhjerne

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Nerve transection og Time-lapse Imaging af gliacelle Behaviors Live zebrafisk

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Langsigtet Time Lapse Imaging af Mouse Cochlear Eksplantater

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpiel Adeno-associeret Virus 9 (AAV9) Vector Levering i Voksne Mus

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Metoder og Tips til intravenøs indgift af Adeno-associeret Virus at rotter og evaluering af centralnervesystemet transduktion

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering og Live Imaging af Oligodendrocyte organeller i Organotypic hjerne skiver ved hjælp af Adeno-associeret Virus og konfokal mikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Kvantitativ analyse af Neuronal dendritiske Arborization kompleksitet i Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...