Name: time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

We bedanken Madison Gray dat ze me een hand heeft gegeven toen ik er geen had. Dit onderzoek werd ondersteund door een NSERC Discovery Grant (RGPIN-2016-06128), een Sloan Fellowship in Neuroscience en een Canada Research Chair Tier 2 (aan J.L.L). S. Ing-Esteves werd ondersteund door het Vision Science Research Program en NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral.

OPMERKING: Dit protocol beslaat 2 dagen met een minimale periode van 4-5 dagen voor virale transductie tussen experimentele dagen (figuur 1A). Dierproeven worden uitgevoerd in overeenstemming met de Canadian Council on Animal Care Guidelines for Use of Animals in Research and Laboratory Animal Care volgens protocollen die zijn goedgekeurd door het Laboratory of Animal Services Animal Use and Care Committee in het Hospital for Sick Children (Toronto, Canada).
1. Voor...

Deze video demonstreert een experimentele pijplijn die bestaande genetische hulpmiddelen gebruikt om de dendrietdynamiek van ontwikkelende retinale neuronen in beeld te brengen met confocale live-imaging. Ook aangetoond zijn intraoculaire injecties van Cre-afhankelijke AAV's die coderen voor membraangerichte fluorescerende eiwitten in neonatale muizen. Afzonderlijke cellen van genetisch gerichte populaties worden al helder gelabeld als 4-5 dpi. Retinale flat-mounts werden voorbereid voor standaard beeldvormingskamers om ...

Dendrieten van retinale neuronen vormen ingewikkelde, maar specifieke patronen die hun functie binnen neurale circuits beïnvloeden. In het netvlies van gewervelde dieren dragen verschillende soorten retinale ganglioncellen (RGC's) en interneuronen van amacrinecellen unieke dendritische morfologieën die verschillen in arborgrootte, locatie, taklengte en dichtheid1. Tijdens de postnatale ontwikkeling breiden RGC's en amacrinecellen uitbundige dendritische processen uit tot een neuropil die de binnenste plexiforme laag (IPL) wordt genoemd, waar ze bipolaire celingangen ontvangen die fotoreceptorsignalen verzenden2. Zoals vastgelegd door time-lapse beeldvorming van fluorescerend gelabelde retinale populaties in kuiken- of zebravislarven, is de morfogenese van dendriet zeer dynamisch3,4,5. Binnen enkele dagen breiden dendritische priëlen zich uit, vervormen en vertakken ze naar smalle sublagen van de IPL, waar ze synapsen met geselecteerde partners. De priëlen vertonen verschillende structurele dynamieken gedurende de ontwikkeling, met veranderingen in relatieve snelheden van taktoevoeging, terugtrekking en stabilisatie. Amacrine- en RGC-dendrieten vertonen ook verschillende uitgroei- en remodelleringsgedragingen die typespecifieke arborisatie kunnen weerspiegelen. Deze studies volgden echter brede amacrine- of RGC-populaties en richtten zich op laminaire targeting, wat slechts één aspect van morfologie is.
De mechanismen die de enorme morfologische diversiteit produceren die wordt waargenomen in retinale subtypen zijn slecht begrepen. Het doel van deze groep was om een methode te ontwikkelen om dendrietdynamica en arbor remodeling van gedefinieerde retinale subtypen bij muizen vast te leggen. Het identificeren van celtypespecifieke mechanismen van dendrietpatronen vereist methoden om dendrietgedrag van interessante cellen te visualiseren en te meten. Organotypische culturen van het netvlies van muizen zijn zeer geschikt voor live-cell imaging studies met behulp van confocale of multifotonenmicroscopie. Ontwikkelende netvliezen worden ontleed en gemonteerd in een platte explant die gedurende enkele uren in een opnamekamer kan worden afgebeeld of gedurende enkele dagen kan worden gekweekt met beperkte effecten op het circuit6,7. Levende retinale neuronen kunnen worden gelabeld door een verscheidenheid aan technieken, waaronder kleurstofvulling door elektroden, elektroporatie, biolistische afgifte van deeltjes bedekt met lipofiele kleurstoffen of plasmiden die coderen voor fluorescerende eiwitten (bijv. Gene Gun), evenals genetisch gecodeerde cellabels7,8,9,10 . Deze benaderingen zijn echter inefficiënt voor het afbeelden van dendrietdynamica van specifieke retinale subtypen. Verfvulmethoden hebben bijvoorbeeld een lage doorvoer en vereisen elektrofysiologische apparatuur en aanvullende genetische labels om op betrouwbare wijze cellen van belang te targeten. Bovendien kunnen de sterke fluorescentiesignalen in de soma nabijgelegen dendrieten verdoezelen.
Biolistische genafgiftemethoden kunnen tegelijkertijd tientallen cellen labelen, maar stappen met hogedrukdeeltjesafgifte en nachtelijke incubatie van geïsoleerd netvlies kunnen de celfysiologie en dendritische uitgroei in gevaar brengen. Dit artikel stelt voor dat recente genetische hulpmiddelen kunnen worden gebruikt om vroege dendrietdynamica vast te leggen met celtype en structurele resolutie, gezien de volgende experimentele criteria. Ten eerste, om de fijne takken en filopodia op te lossen die zich ontwikkelende priëlen domineren, moet de methode neuronen labelen met heldere, fluorescerende eiwitten die processen in het hele prieel vullen. De fluorescentielabeling mag niet vervagen als gevolg van fotobleaching tijdens de beeldvormingsperiode. Er zijn verschillende fluorescerende eiwitvarianten gegenereerd en vergeleken voor geschiktheid voor in vivo/ex vivo beeldvorming11 op basis van helderheid en fotostabiliteit. Ten tweede moeten de fluorescerende eiwitten (XFP's) in voldoende hoge niveaus tot expressie worden gebracht door het vroegste stadium van dendrietmorfogenese, zodat het smalle ontwikkelingsvenster niet wordt gemist. In analyses van statische tijdpunten in het netvlies van de muis vindt dendrietontwikkeling plaats tijdens de eerste postnatale week en omvat fasen van uitgroei, remodellering en stabilisatie10,12,13,14,15. Ten derde moet de methode leiden tot selectieve etikettering of tot een grotere kans op etikettering van de neuronale subpopulatie van belang. Ten vierde moet de etikettering van de doelsubpopulatie voldoende dun zijn om het gehele neuronale prieel te kunnen identificeren en traceren. Hoewel RGC- en amacrine-subtypen kunnen worden onderscheiden door hun volwassen morfologische kenmerken en IPL-stratificatiepatronen16,17,18,19,20, is de uitdaging om subtypen tijdens de ontwikkeling te identificeren op basis van onvolgroeide structuren. Deze taak wordt vergemakkelijkt door de uitbreiding van transgene hulpmiddelen om specifieke retinale celtypen tijdens de ontwikkeling te labelen.
Transgene en knock-in muislijnen waarin cellulaire en temporele expressie van fluorescerende eiwitten of Cre wordt bepaald door genregulerende elementen worden veel gebruikt om retinale celtypen te bestuderen13,21,22,23. Belangrijke observaties over subtypespecifieke patronen van dendrietontwikkeling zijn afkomstig van studies van transgene muizenvliezen op statische tijdpunten10,14,24,25. Met name het Cre-Lox-systeem maakt uitstekende genmanipulatie en monitoring van subtypen mogelijk met behulp van een verscheidenheid aan recombinase-afhankelijke reporters, sensoren en optogenetische activatoren. Deze hulpmiddelen hebben geleid tot ontdekkingen van subtypespecifieke moleculaire programma's en functionele eigenschappen die ten grondslag liggen aan retinale circuitassemblage26,27,28,29,30. Ze moeten echter nog worden gebruikt om subtypespecifieke dendrietdynamica in het netvlies van de muis te bestuderen. Labeling met lage dichtheid kan worden bereikt door Cre-muislijnen te combineren met transgenen die worden geïntroduceerd door elektroporatie of door recombinante AAV's. Indien beschikbaar, kunnen tamoxifen-induceerbare Cre-lijnen of intersectionele genetische strategieën ook worden gebruikt. Ten slotte moet de cel op een minimaal invasieve manier worden geëtiketteerd en in beeld worden gebracht met behulp van acquisitieparameters om het weefsel niet in gevaar te brengen of de cellulaire functie te verstoren die nodig is voor de morfogenese van dendriet.
Hier wordt een methode gepresenteerd om transgene hulpmiddelen en confocale microscopie toe te passen om dendrietdynamiek in retinale explantaten van levende muizen te onderzoeken. Cretransgene muislijnen zijn gecombineerd met AAV-vectoren die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen bij Cre-recombinatie, wat een schaarse labeling van retinale cellen van belang mogelijk maakt. Commercieel verkrijgbare AAV's worden geleverd aan neonatale netvlies door intravitreale injecties. Dit artikel toont aan dat AAV's een significant hoge en celtypespecifieke fluorescerende expressie produceren met 4 dpi, waardoor toegang tot postnatale tijdspunten mogelijk is. Om deze benadering te illustreren, werd de cholinerge "starburst" amacrine interneuron gelabeld door Brainbow AAV af te leveren bij neonatale muizen die de choline-acetyltransferase (ChAT) -interne ribosoom entry site (IRES) -Cre transgen tot expressie brengen, dat actief is in het vroege postnatale retina31,32. Starburst amacrine cellen ontwikkelen een stereotiepe en radiale arbor morfologie die wordt gevormd door dendriet zelfvermijding gemedieerd door de geclusterde protocadherinen33,34. Dit artikel toont aan dat de resolutie van starburst dendrieten en filopodia aanzienlijk wordt verbeterd door XFP's aan het plasmamembraan met de toevoeging van het CAAX-motief dat farnesylatie ondergaat, zoals gebruikt voor de Brainbow AAV's31. Ten slotte zijn time-lapse beeldvorming en nabewerkingsprotocollen vastgesteld die beelden van hoge kwaliteit produceren die vatbaar zijn voor dendrietreconstructie en morfometrische kwantificering. Dit protocol kan worden gebruikt om factoren te identificeren die de morfogenese van dendriet regelen en om verschillende cellulaire gedragingen in het intacte netvlies vast te leggen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45185-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45186-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HABG01 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 50 &#215; 15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470313-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene disposable transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tip paint brush, size 3/0</td>
			<td>Conventional art supply store</td>
			<td></td>
			<td>Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-imaging incubation system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber polyethylene tubing, PE-160 10&#39;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel heater controller, Model TC-344C</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater controller cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CC-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large bath incubation chamber with slice support</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample anchor (Harps)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0260</td>
			<td>Sample anchor must be compatible with incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sloflo In-line Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Microliter Syringe Series 700, Removable Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)&#160;</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2453</td>
			<td>Addgene Plasmid #45185&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 
			1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2454</td>
			<td>Addgene Plasmid #45186</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF Dye content &#8805;85 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tattoo paste</td>
			<td>Ketchum MFG Co</td>
			<td>329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>PV-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>Supplier may vary depending on region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH35317.604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>Open source</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations

Het ontdekken van mechanismen die dendritische priëlen patroon, vereist methoden om dendrieten tijdens de ontwikkeling te visualiseren, in beeld te brengen en te analyseren. Het netvlies van de muis is een krachtig modelsysteem voor het onderzoek van celtypespecifieke mechanismen van neuronale morfogenese en connectiviteit. De organisatie en samenstelling van retinale subtypen zijn goed gedefinieerd en genetische hulpmiddelen zijn beschikbaar om toegang te krijgen tot specifieke typen tijdens de ontwikkeling. Veel retinale celtypen beperken ook hun dendrieten en / of axonen tot smalle lagen, wat time-lapse beeldvorming vergemakkelijkt. Explantaatculturen van muizen zijn zeer geschikt voor live-cell imaging met behulp van confocale of multifotonenmicroscopie, maar methoden die zijn geoptimaliseerd voor het afbeelden van dendrietdynamica met temporele en structurele resolutie ontbreken. Hier wordt een methode gepresenteerd om de ontwikkeling van specifieke retinale populaties gemarkeerd door het Cre-Lox-systeem spaarzaam te labelen en in beeld te brengen. Commercieel verkrijgbare adeno-geassocieerde virussen (AAV's) die hier worden gebruikt, brachten membraangerichte fluorescerende eiwitten tot expressie op een Cre-afhankelijke manier. Intraoculaire toediening van AAV's bij neonatale muizen produceert fluorescerende etikettering van gerichte celtypen 4-5 dagen na injectie (dpi). De fluorescerende signalen van het membraan zijn detecteerbaar door confocale beeldvorming en lossen fijne takstructuren en dynamica op. Video's van hoge kwaliteit van 2-4 uur worden verkregen van het afbeelden van retinale flat-mounts doordrenkt met zuurstofrijk kunstmatig hersenvocht (aCSF). Ook wordt een beeld-nabewerkingspijplijn geleverd voor deconvolutie en driedimensionale (3D) driftcorrectie. Dit protocol kan worden gebruikt om verschillende cellulaire gedragingen in het intacte netvlies vast te leggen en om nieuwe factoren te identificeren die de morfogenese van neuriet regelen. Veel ontwikkelingsstrategieën die in het netvlies worden geleerd, zullen relevant zijn voor het begrijpen van de vorming van neurale circuits elders in het centrale zenuwstelsel.

Met behulp van het bovenstaande protocol werd een 3D-video met hoge resolutie van het ontwikkelen van starburst-celdendrieten verkregen, gedeconvoleerd en gecorrigeerd voor 3D-drift. Z-plane maximale projecties werden geproduceerd om 2D-video's te maken voor analyse (Aanvullende video 1, figuur 5A). 3D-deconvolutie van elk tijdstip verhoogde de resolutie van fijne filopodiaprojecties (figuur 5B,C). Fijne filopodia-uitsteeksels z...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Hier presenteren we een methode voor het onderzoeken van neurietmorfogenese in postnatale muis retinale explantaten door time-lapse confocale microscopie. We beschrijven een aanpak voor schaarse etikettering en acquisitie van retinale celtypen en hun fijne processen met behulp van recombinante adeno-geassocieerde virusvectoren die membraangerichte fluorescerende eiwitten op een Cre-afhankelijke manier tot expressie brengen.

Time-lapse beeldvorming van neuronale arborisatie met behulp van schaarse Adeno-geassocieerde virusetikettering van genetisch gerichte retinale celpopulaties

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Eencellige labeling en visualisatie van dendritische of axonale priële priëlen is vereist om neuronale morfogenese te bestuderen. Door ontwikkelende priëlen op een minimaal invasieve manier te labelen, blijft netvliesweefsel gezond en geschikt voor langdurige confocale live beeldvorming. Het belangrijkste voordeel van deze methode is de mogelijkheid om individuele priëlen met meerkleurige fluorescerende eiwitten binnen vier dagen na injectie te visualiseren.Dit maakt het bestuderen van neonatale arbor morfologieën mogelijk. Dit injectiebeeldvormings- en analyseprotocol kan worden gebruikt om neuronale morfologieën in het centrale zenuwstelsel te bestuderen. De juiste Cre-selectie en injectielocatie moeten worden bepaald om zich te richten op de celpopulatie van belang.Begin met het selecteren van een Cre-muislijn om de retinale celpopulaties van belang te labelen. Verkrijg recombinase-afhankelijk AAV-virus dat codeert voor fluorescerende eiwitten. Voor een optimale etikettering van fijne processen selecteert u vectoren die gemodificeerde fluorescerende eiwitten tot expressie brengen die zich op het plasmamembraan richten.Voor de AAV aliquot op ijs, en bereid een één tot vier AAV verdunning met behulp van steriele zoutoplossing of PBS. Om de injecties te visualiseren, kleurt u de oplossing blauw door ongeveer één microliter 0,02% Fast Green FCF-kleurstofoplossing toe te voegen voor elke 15 microliter AAV-verdunning. Steriliseer het injectiegebied met 70% ethanol.Vul de micropipette met de AAV-verdunning met behulp van een microsyringe. Breek onder een stereomicroscoop de micropipettepunt met een naald van 30 gauge om de punt los te maken. Na het verdoven van de neonatale muizen, tatoeëer hun voetzolen met tatoeage-inkt met behulp van een naald van 30 gauge om de dieren te identificeren.Verzamel staartknipsels voor DNA-isolatie en genotypering. Veeg de huid boven de ogen af met 70% ethanol. Gebruik een naald van 30 gauge om het vergroeide ooglid te openen terwijl u lichte druk uitoefent met de vingers om het oog te openen.Prik een klein gaatje door het hoornvlies bij de kruising van de cornea sclera. Steek de glazen micropipette in het gat en druk twee tot vier keer op het voetpedaal van de micro-injector om de AAV in de intravitreale ruimte te injecteren. Verwijder langzaam de micropipette en bevestig de AAV-injectie door de blauwe kleurstof in de pupil te visualiseren.Na het voorbereiden van de retinale aCSF zoals beschreven in het teksthandschrift, oxygeneert u de retinale aCSF door minimaal 15 minuten met carbogen te borrelen en vervolgens de pH aan te passen aan 7,4. Sluit een petrischaaltje met een diameter van 60 millimeter in een ijsbak en vul deze met zuurstofrijke retinale aCSF. Leg de gevulde petrischaal onder een stereomicroscoop.Snijd vervolgens de ooglidflap van de geëuthanaseerde muis om het oog bloot te leggen. Gebruik een stompe tang om de ogen te enucleeren en breng ze over naar de koude retinale aCSF die onder de stereomicroscoop is geplaatst. Stabiliseer onder de stereomicroscoop het oog door de oogzenuw vast te klemmen met behulp van dumont nummer vijf tang en prik een gat in het midden van het hoornvlies met een naald van 30 gauge en steek vervolgens een punt van de microschaar in het gat om een incisie te maken van het gat naar het einde van het hoornvlies.Herhaal dit om vier plakjes in de windrichtingen te maken, waardoor er vier flappen ontstaan. Pak de twee aangrenzende flappen vast en trek ze uit elkaar en pel de sclera voorzichtig van het netvlies voor alle hoornvliesflappen. Verwijder vervolgens de lens van de retinale cup met behulp van de tang.Gebruik ten slotte een microschaar om vier radiale incisies te maken van de rand van het netvlies naar de oogzenuw, waardoor vier gelijke bloemblaadjes ontstaan. Als u grijze MCE-membraanfilters met een grote diameter gebruikt voor montage, snijdt u de schijf in kwadranten van ongeveer een centimeter breed en plaatst u de MCE-schijf vervolgens op het midden van een groter wit filterpapier. Gebruik twee verfkwasten van maat drie bij nul en draai een retinale cup op een verfkwast met de retinale ganglioncel naar beneden.Til het netvlies voorzichtig uit de aCSF en zorg ervoor dat de waterspanning het netvlies niet scheurt. Terwijl u de verfkwast nog steeds met het netvlies vasthoudt, verplaatst u de petrischaal met aCSF uit de weg en plaatst u het witte filterpapier met het MCE-membraan onder de stereoscoop. Plaats met behulp van een transferpipet een druppel aCSF in het midden van het MCE-filterpapier.Drijf het netvlies in de aCSF-druppel die wordt gecreëerd door de oppervlaktespanning en het geladen MCE-membraan. Gebruik verfkwasten om het netvlies in de druppel te plaatsen met de retinale ganglioncel naar boven en vouw vervolgens de vier bloemblaadjes uit. Eenmaal geplaatst, maak je een waterbrug tussen de verfkwast en wit filterpapier om de oppervlaktespanning van de druppel te breken.Monteer de live imaging incubatiekamer en vul deze met zuurstofrijke aCSF. Schakel de pomp en temperatuurregelaar in en zorg ervoor dat de temperatuur niet boven de 34 graden Celsius komt. Het kan tot een uur duren voordat de kamertemperatuur is gestabiliseerd.Het wordt aanbevolen om de incubatiekamer in te stellen voordat u begint met retinale dissectie. Stabiele kamertemperatuur helpt de monsterdrift te verminderen. Om de retinale platte heuvel in de perfusiekamer over te brengen, stopt u de pomp en verwijdert u de aCSF die zich in de kamer bevindt.Plaats vervolgens de MCE-schijf met de retinale platte houder in de incubatiekamer. Maak een monstergewicht voor om de oppervlaktespanning te breken en plaats het vervolgens op de vlakke houder om ervoor te zorgen dat het monstergewicht op het MCE-papier wordt geplaatst om de monsterdrift te verminderen. Vul de kamer opnieuw met de opgewarmde aCSF en laat aCSF circuleren met ongeveer één milliliter per minuut.Plaats het neusstuk met het 25 keer waterdippende objectief in de beeldvormingskamer. Scherm voor gelabelde cellen van belang met behulp van epifluorescent licht en pas het beeldvolume aan om dendritische kenmerken van belang vast te leggen. Gebruik een opzoektabel die zowel oververzadigde als onderverzadigde pixels identificeert, pas het laservermogen zodanig aan dat er geen pixels oververzadigd zijn.Verkrijg het 3D-beeldvolume en herhaal acquisitie met de gewenste framesnelheid. Het beeldvolume kan tussen elk tijdstip worden aangepast om de monsterdrift te compenseren. Importeer de afbeeldingsreeks en splitst de afbeeldingen op tijd.Sla alle tijdspunten handmatig op of door een macro-plug-in uit te voeren. Maak een theoretische puntspreidingsfunctie met behulp van de ImageJ-plug-in door te klikken op Defraction PSF 3D, lens numeriek diafragma, fluorofoore-emissiegolflengte, pixelgrootte en Z-afstand zijn vereist om een nauwkeurige PSF te maken. Selecteer plug-ins, macro's en voer uit om batch parallelle iteratieve deconvolutie uit te voeren voor alle tijdspunten met behulp van de meegeleverde macro.Importeer alle gedeconvolgeerde tijdspunten als een stapel door op bestand te klikken en vervolgens op afbeeldingsvolgorde. Converteer de stack naar een hyperstack door te klikken op image, hyperstacks en vervolgens stacks naar hyperstack. Voeg het aantal Z-slices en tijdframes toe en corrigeer de 3D-drift met de juiste 3D-driftplug-in.Sla de 3D-drift gecorrigeerde hyperstack op en converteer de afbeelding terug naar een gewone stapel door op afbeelding, hyperstacks, hyperstacks te klikken om te stapelen en splits vervolgens de tijdpunten door op afbeelding, stapels, gereedschappen en stapels splitter te klikken. Als u het aantal substacks wilt splitsen, voert u het aantal tijdpunten in. Gebruik batchverwerking om een maximale projectie voor alle tijdspunten te maken.Importeer de timelapse-afbeeldingsreeks door op bestand, importeer en vervolgens op afbeeldingsreeks te klikken. En gebruik conventionele ImageJ-tools voor de gewenste analyse van gedeconvolgeerde en nabewerkte tweedimensionale video, Een hoge resolutie 3D-video van het ontwikkelen van starburst-celdendrieten werd verkregen, gedeconvoleerd en gecorrigeerd voor 3D-drift. Z-plane maximale projecties werden geproduceerd om 2D-video's te maken voor analyse, die een gebied van dendritische verfijning en een gebied van dendritische uitgroei laten zien.3D-deconvolutie van elk tijdspunt verhoogde de resolutie van fijne filopodiaprojecties van enkele P6 starburst amacrinecel voor en na deconvolutie met ImageJ. Langdurige AAV-infectieperioden leiden niet noodzakelijkerwijs tot een verhoogd fluorescerend signaal, zoals blijkt uit vergelijkbare niveaus van eiwitexpressie vijf en 11 dagen na injectie. Het verminderen van monsterdrift tijdens beeldvorming is belangrijk.Drift wordt geminimaliseerd door een consistente beeldtemperatuur te handhaven en door het gewicht op de juiste manier op het monster te plaatsen. Als er drift optreedt, maakt handmatige acquisitie van de tijdreeks het mogelijk om het beeldvolume tussen frames aan te passen. Dit zorgt ervoor dat de kenmerken van belang in beeld blijven.Dit protocol produceert hoge resolutie, gedeconvolgeerde en drift-gecorrigeerde 3D-video's van het ontwikkelen van neurieten. Dergelijke video's leiden tot een beter begrip van neuronbedrading en zijn nodig om computationele analysemethoden van 3D-morfogenese te bevorderen. Betere automatische tracerings- en trackingsoftware is vereist om een hoge doorvoeranalyse van neurietontwikkeling te bereiken.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracraniële Injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Imaging neuronale responsen bij Slice Bereidingen van Vomeronasal Het uiten van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse imaging van neuroblast migratie in Acute Schijfjes van de volwassen muis voorhersenen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Nerve doorsnijding en Time-lapse beeldvorming van gliacellen Gedrag Live zebravis

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Langdurige Time Lapse Imaging van Muis Cochlear Explantaten

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpiaal Adeno-geassocieerde Virus 9 (AAV9) Vector Levering in Volwassene Muizen

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Methoden en Tips voor intraveneuze toediening van Adeno-associated Virus voor ratten en evaluatie van het centrale zenuwstelsel transductie

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisatie en Live beeldvorming van Oligodendrocyte organellen in Organotypic hersenen plakjes met behulp van Adeno-associated Virus en confocale microscopie

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Kwantitatieve analyse van neuronale dendritische Arborization complexiteit in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...