Name: time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Nous remercions Madison Gray de m’avoir donné un coup de main alors que je n’en avais pas. Cette recherche a été soutenue par une subvention de découverte du CRSNG (RGPIN-2016-06128), une bourse Sloan en neurosciences et une chaire de recherche du Canada de niveau 2 (à J.L.L.). S. Ing-Esteves a été soutenu par le Programme de recherche en sciences de la vision et les bourses d’études supérieures-doctorales du CRSNG.

REMARQUE: Ce protocole s’étend sur 2 jours avec une période minimale de 4-5 jours pour la transduction virale entre les jours expérimentaux (Figure 1A). Les expériences sur les animaux sont effectuées conformément aux Lignes directrices du Conseil canadien sur les soins aux animaux pour l’utilisation des animaux en recherche et les soins aux animaux de laboratoire en vertu des protocoles approuvés par le Comité d’utilisation et de soins des animaux du Laboratoire des services a...

Cette vidéo démontre un pipeline expérimental qui utilise des outils génétiques existants pour imager la dynamique des dendrites des neurones rétiniens en développement avec l’imagerie confocale en direct. Les injections intraoculaires d’AAV créo-dépendants codant pour des protéines fluorescentes ciblant la membrane chez des souris néonatales ont également été démontrées. Les cellules individuelles de populations génétiquement ciblées sont marquées de manière brillante dès 4-5 dpi. Des supports ...

Les dendrites des neurones rétiniens forment des modèles complexes, mais spécifiques, qui influencent leur fonction dans les circuits neuronaux. Dans la rétine des vertébrés, divers types de cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) et d’interneurones de cellules amacrines présentent des morphologies dendritiques uniques qui diffèrent par la taille, l’emplacement, la longueur des branches et la densité1. Au cours du développement postnatal, les RGC et les cellules amacrines étendent les processus dendritiques exubérants dans un neuropil appelé couche plexiforme interne (IPL), où ils reçoivent des entrées de cellules bipolaires transmettant des signaux photorécepteurs2. Comme l’a montré l’imagerie en accéléré des populations rétiniennes marquées par fluorescence chez les larves de poussins ou de poissons-zèbres, la morphogenèse dendrite est très dynamique3,4,5. En quelques jours, les tonnelles dendritiques se dilatent, se remodèlent et se ramifient en sous-couches étroites de l’IPL, où elles synapsent avec des partenaires sélectionnés. Les tonnelles présentent une dynamique structurelle différente au cours du développement, avec des changements dans les taux relatifs d’ajout, de rétraction et de stabilisation des branches. Les dendrites d’amacrine et de RGC présentent également des comportements de croissance et de remodelage différents qui pourraient refléter une arborisation spécifique au type. Cependant, ces études ont suivi de larges populations d’amacrine ou de RGC et se sont concentrées sur le ciblage laminaire, qui n’est qu’un aspect de la morphologie.
Les mécanismes qui produisent la grande diversité morphologique observée entre les sous-types rétiniens sont mal compris. L’objectif de ce groupe était de développer une méthode pour capturer la dynamique des dendrites et le remodelage arboricole de sous-types rétiniens définis chez la souris. L’identification des mécanismes spécifiques au type de cellule de la modélisation des dendrites nécessite des méthodes pour visualiser et mesurer les comportements de dendrite des cellules d’intérêt. Les cultures organotypiques de rétines de souris sont bien adaptées aux études d’imagerie de cellules vivantes utilisant la microscopie confocale ou multiphotonique. Les rétines en développement sont disséquées et montées dans une explante plate qui peut être imagée pendant plusieurs heures dans une chambre d’enregistrement ou cultivée sur quelques jours avec des effets limités sur le circuit6,7. Les neurones rétiniens vivants peuvent être marqués par une variété de techniques, y compris le remplissage de colorants par électrodes, l’électroporation, l’administration biolistique de particules recouvertes de colorants lipophiles ou de plasmides codant pour des protéines fluorescentes (par exemple, Gene Gun), ainsi que des étiquettes cellulaires génétiquement codées7,8,9,10 . Cependant, ces approches sont inefficaces pour l’imagerie de la dynamique des dendrites de sous-types rétiniens spécifiques. Par exemple, les méthodes de remplissage de colorant sont à faible débit et nécessitent un appareil d’électrophysiologie et des étiquettes génétiques supplémentaires pour cibler de manière fiable les cellules d’intérêt. De plus, les forts signaux de fluorescence dans le soma peuvent obscurcir les dendrites voisines.
Les méthodes d’administration de gènes biolistiques peuvent marquer simultanément des dizaines de cellules, mais les étapes impliquant l’administration de particules à haute pression et l’incubation nocturne de la rétine isolée peuvent compromettre la physiologie cellulaire et l’excroissance dendritique. Cet article propose que des outils génétiques récents puissent être utilisés pour capturer la dynamique précoce des dendrites avec le type cellulaire et la résolution structurelle, compte tenu des critères expérimentaux suivants. Tout d’abord, pour résoudre les fines branches et les filopodes qui dominent les tonnelles en développement, la méthode devrait marquer les neurones avec des protéines fluorescentes brillantes qui remplissent les processus dans toute la tonnelle. Le marquage par fluorescence ne doit pas s’estomper en raison du photoblanchiment pendant la période d’imagerie. Diverses variantes de protéines fluorescentes ont été générées et comparées pour déterminer si elles conviennent à l’imagerie in vivo/ex vivo11 en fonction de la luminosité et de la photostabilité. Deuxièmement, les protéines fluorescentes (XFP) doivent être exprimées à des niveaux suffisamment élevés au stade le plus précoce de la morphogenèse de la dendrite, de sorte que la fenêtre de développement étroite ne soit pas manquée. Dans les analyses des points temporels statiques dans la rétine de la souris, le développement de la dendrite se produit au cours de la première semaine postnatale et comprend des phases d’excroissance, de remodelage et de stabilisation10,12,13,14,15. Troisièmement, la méthode devrait conduire à un étiquetage sélectif ou à une probabilité accrue de marquage de la sous-population neuronale d’intérêt. Quatrièmement, l’étiquetage de la sous-population cible doit être suffisamment clairsemé pour que l’ensemble de la tonnelle neuronale puisse être identifié et tracé. Bien que les sous-types de RGC et d’amacrine puissent être distingués par leurs caractéristiques morphologiques matures et leurs profils de stratification IPL16,17,18,19,20, le défi consiste à identifier des sous-types au cours du développement basés sur des structures immatures. Cette tâche est facilitée par l’expansion d’outils transgéniques pour marquer des types de cellules rétiniennes spécifiques au cours du développement.
Les lignées de souris transgéniques et knock-in dans lesquelles l’expression cellulaire et temporelle des protéines fluorescentes ou Cre est déterminée par des éléments régulateurs géniques sont largement utilisées pour étudier les types de cellules rétiniennes13,21,22,23. Des observations clés sur les modèles spécifiques de sous-type du développement de la dendrite proviennent d’études sur des rétines de souris transgéniques à des points temporels statiques10,14,24,25. Le système Cre-Lox, en particulier, permet une manipulation génique et une surveillance exquises des sous-types à l’aide d’une variété de rapporteurs, de capteurs et d’activateurs optogénétiques dépendants de la recombinase. Ces outils ont conduit à la découverte de programmes moléculaires spécifiques à un sous-type et de propriétés fonctionnelles qui sous-tendent l’assemblage de circuits rétiniens26,27,28,29,30. Cependant, ils n’ont pas encore été exploités pour étudier la dynamique des dendrites spécifiques au sous-type dans la rétine de la souris. Le marquage à faible densité peut être obtenu en combinant des lignées de souris Cre avec des transgènes introduits par électroporation ou par des AAV recombinants. Si elles sont disponibles, des lignées de Cre inductibles au tamoxifène ou des stratégies génétiques intersectionnelles peuvent également être utilisées. Enfin, la cellule doit être marquée de manière peu invasive et imagée à l’aide de paramètres d’acquisition afin de ne pas compromettre le tissu ou interférer avec la fonction cellulaire requise pour la morphogenèse dendrite.
Présenté ici est une méthode pour appliquer des outils transgéniques et la microscopie confocale pour étudier la dynamique de la dendrite dans les explants rétiniens de souris vivantes. Les lignées de souris transgéniques Cre ont été combinées avec des vecteurs AAV qui expriment des protéines fluorescentes lors de la recombinaison Cre, ce qui permet un marquage clairsemé des cellules rétiniennes d’intérêt. Les AAV disponibles dans le commerce sont administrés à la rétine néonatale par injections intravitréennes. Cet article démontre que les AAV produisent une expression fluorescente significativement élevée et spécifique au type de cellule de 4 dpi, permettant l’accès aux points de temps postnatals. Pour illustrer cette approche, l’interneuron amacrine cholinergique « starburst » a été marqué en délivrant Brainbow AAV chez des souris néonatales exprimant le transgène de la choline acétyltransférase (ChAT)-site interne du ribosome (IRES)-Cre, qui est actif dans la rétine postnatale précoce31,32. Les cellules amacrines Starburst développent une morphologie de tonnelle stéréotypée et radiale qui est façonnée par l’auto-évitement de la dendrite médiée par les protocadhérines groupées33,34. Cet article montre que la résolution des dendrites et des filopodestes d’étoiles est considérablement améliorée par les XFP à la membrane plasmique avec l’ajout du motif CAAX qui subit une farnésylation, tel qu’utilisé pour les AAV Brainbow31. Enfin, des protocoles d’imagerie en accéléré et de post-traitement ont été déterminés pour produire des images de haute qualité susceptibles d’être reconstruites dendrites et quantifiées morphométriques. Ce protocole peut être utilisé pour identifier les facteurs contrôlant la morphogenèse dendrite et pour capturer plusieurs comportements cellulaires dans la rétine intacte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45185-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45186-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HABG01 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 50 &#215; 15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470313-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene disposable transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tip paint brush, size 3/0</td>
			<td>Conventional art supply store</td>
			<td></td>
			<td>Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-imaging incubation system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber polyethylene tubing, PE-160 10&#39;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel heater controller, Model TC-344C</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater controller cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CC-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large bath incubation chamber with slice support</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample anchor (Harps)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0260</td>
			<td>Sample anchor must be compatible with incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sloflo In-line Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Microliter Syringe Series 700, Removable Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)&#160;</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2453</td>
			<td>Addgene Plasmid #45185&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 
			1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2454</td>
			<td>Addgene Plasmid #45186</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF Dye content &#8805;85 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tattoo paste</td>
			<td>Ketchum MFG Co</td>
			<td>329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>PV-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>Supplier may vary depending on region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH35317.604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>Open source</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations

La découverte des mécanismes qui forment les tonnelles dendritiques nécessite des méthodes pour visualiser, imager et analyser les dendrites pendant le développement. La rétine de souris est un puissant système modèle pour l’étude des mécanismes spécifiques au type cellulaire de morphogenèse neuronale et de connectivité. L’organisation et la composition des sous-types rétiniens sont bien définies, et des outils génétiques sont disponibles pour accéder à des types spécifiques au cours du développement. De nombreux types de cellules rétiniennes contraignent également leurs dendrites et / ou axones à des couches étroites, ce qui facilite l’imagerie time-lapse. Les cultures d’explants de rétine de souris sont bien adaptées à l’imagerie de cellules vivantes à l’aide de la microscopie confocale ou multiphotonique, mais les méthodes optimisées pour l’imagerie de la dynamique des dendrites avec une résolution temporelle et structurelle font défaut. Présenté ici est une méthode pour étiqueter et imager de manière éparse le développement de populations rétiniennes spécifiques marquées par le système Cre-Lox. Les virus adéno-associés (AAV) disponibles dans le commerce utilisés ici ont exprimé des protéines fluorescentes ciblées sur la membrane d’une manière dépendante de Cre. L’administration intraoculaire d’AAV chez les souris néonatales produit un marquage fluorescent des types de cellules ciblées 4 à 5 jours après l’injection (dpi). Les signaux fluorescents membranaires sont détectables par imagerie confocale et résolvent les structures et la dynamique fines des branches. Des vidéos de haute qualité couvrant 2 à 4 h sont acquises à partir de supports plats rétiniens d’imagerie perfusés de liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné (CSPa). Un pipeline de post-traitement d’image pour la déconvolution et la correction de dérive tridimensionnelle (3D) est également fourni. Ce protocole peut être utilisé pour capturer plusieurs comportements cellulaires dans la rétine intacte et pour identifier de nouveaux facteurs contrôlant la morphogenèse des neurites. De nombreuses stratégies de développement apprises dans la rétine seront pertinentes pour comprendre la formation de circuits neuronaux ailleurs dans le système nerveux central.

En utilisant le protocole ci-dessus, une vidéo 3D haute résolution du développement de dendrites de cellules starburst a été acquise, déconcentrée et corrigée pour la dérive 3D. Des projections maximales du plan Z ont été produites pour réaliser des vidéos 2D à des fins d’analyse (vidéo supplémentaire 1, figure 5A). La déconvolution 3D de chaque point temporel a augmenté la résolution des projections de filopodia fines (Figure 5B,C</...

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Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Nous présentons ici une méthode pour étudier la morphogenèse des neurites dans les explants rétiniens postnatals de souris par microscopie confocale time-lapse. Nous décrivons une approche pour le marquage clairsemé et l’acquisition de types de cellules rétiniennes et de leurs processus fins en utilisant des vecteurs de virus adéno-associés recombinants qui expriment des protéines fluorescentes ciblées sur la membrane d’une manière dépendante de Cre.

Imagerie en accéléré de l’arborisation neuronale à l’aide du marquage clairsemé du virus adéno-associé à des populations de cellules rétiniennes génétiquement ciblées

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Le marquage unicellulaire et la visualisation des tonnelles dendritiques ou axonales sont nécessaires pour étudier la morphogenèse neuronale. En marquant les tonnelles en développement d’une manière peu invasive, le tissu rétinien reste sain et convient à l’imagerie confocale prolongée en direct. Le principal avantage de cette méthode est la possibilité de visualiser des tonnelles individuelles avec des protéines fluorescentes multicolores dans les quatre jours suivant l’injection.Cela rend possible l’étude des morphologies des tonnelles néonatales. Ce protocole d’imagerie et d’analyse par injection peut être utilisé pour étudier les morphologies neuronales dans le système nerveux central. Le lieu approprié de sélection et d’injection du Cre doit être déterminé pour cibler la population cellulaire d’intérêt.Commencez par sélectionner une ligne de souris Cre pour étiqueter les populations de cellules rétiniennes d’intérêt. Obtenir le virus AAV dépendant de la recombinase codant pour des protéines fluorescentes. Pour un marquage optimal des processus fins, sélectionnez des vecteurs qui expriment des protéines fluorescentes modifiées ciblant la membrane plasmique.Pour l’aliquote AAV sur glace, et préparez une dilution AAV d’un à quatre à l’aide d’une solution saline stérile ou pbS. Pour visualiser les injections, colorez la solution en bleu en ajoutant environ un microlitre de solution de colorant FCF Fast Green à 0,02% pour chaque 15 microlitres de dilution AAV. Stériliser la zone d’injection avec de l’éthanol à 70%.Remblayer la micropipette avec la dilution AAV à l’aide d’un microsyringe. Sous un stéréomicroscope, cassez la pointe de la micropipette avec une aiguille de calibre 30 pour desceller la pointe. Après avoir anesthésié les souris néonatales, tatouez leurs coussinets avec de l’encre de tatouage à l’aide d’une aiguille de calibre 30 pour identifier les animaux.Recueillir des coupures de queue pour l’isolement de l’ADN et le génotypage. Écouvillonnez la peau recouvrant les yeux avec de l’éthanol à 70%. Utilisez une aiguille de calibre 30 pour ouvrir la paupière fusionnée tout en appliquant une légère pression avec les doigts pour ouvrir l’œil.Percer un petit trou dans la cornée à la jonction de la sclérotique cornéenne. Insérez la micropipette en verre dans le trou et appuyez deux à quatre fois sur la pédale du micro-injecteur pour injecter l’AAV dans l’espace intravitréen. Retirez lentement la micropipette et confirmez l’injection d’AAV en visualisant le colorant bleu dans la pupille.Après avoir préparé l’aCSF rétinien comme décrit dans le manuscrit du texte, oxygénez l’aCSF rétinien en bouillonnant avec du carbogène pendant au moins 15 minutes, puis ajustez le pH à 7,4. Incorporez une boîte de Petri de 60 millimètres de diamètre dans un bac à glace et remplissez-la d’aCSF rétinien oxygéné. Placez la boîte de Petri remplie sous un stéréomicroscope.Ensuite, coupez le rabat de paupière de la souris euthanasiée pour exposer l’œil. Utilisez des pinces contondantes pour énucléer les yeux et les transférer dans le CSAf rétinien froid placé sous le stéréomicroscope. Sous le stéréomicroscope, stabiliser l’œil en serrant le nerf optique à l’aide de la pince Numéro cinq de Dumont et percer un trou au centre de la cornée avec une aiguille de calibre 30, puis insérer une pointe des micro-ciseaux dans le trou pour faire une incision du trou à l’extrémité de la cornée.Répétez l’opération pour faire quatre tranches dans les directions cardinales, en créant quatre rabats. Saisissez et séparez les deux lambeaux adjacents, en pelant doucement la sclérotique de la rétine pour tous les lambeaux de cornée. Retirez ensuite le cristallin de la coupe rétinienne à l’aide de la pince.Enfin, utilisez des micro-ciseaux pour faire quatre incisions radiales du bord de la rétine vers le nerf optique, créant quatre pétales égaux. Si vous utilisez des filtres à membrane MCE gris de grand diamètre pour le montage, coupez le disque en quadrants d’environ un centimètre de diamètre, puis placez le disque MCE au centre d’un papier filtre blanc plus grand. À l’aide de deux pinceaux de taille trois par zéro, retournez une tasse rétinienne sur un pinceau avec la cellule ganglionnaire rétinienne vers le bas.Soulevez doucement la rétine hors de l’aCSF, en vous assurant que la tension de l’eau ne déchire pas la rétine. Tout en tenant toujours le pinceau avec la rétine, déplacez la boîte de Petri contenant de l’aCSF et placez le papier filtre blanc avec la membrane MCE sous le stéréoscope. À l’aide d’une pipette de transfert, placez une gouttelette d’aCSF au centre du papier filtre MCE.Faites flotter la rétine dans la gouttelette d’aCSF créée par la tension superficielle et la membrane MCE chargée. Utilisez des pinceaux pour positionner la rétine dans la gouttelette avec la cellule ganglionnaire rétinienne vers le haut, puis dépliez les quatre pétales. Une fois positionné, créez un pont d’eau entre le pinceau et le papier filtre blanc pour briser la tension superficielle de la gouttelette.Assemblez la chambre d’incubation d’imagerie en direct et remplissez-la d’aCSF oxygéné. Allumez la pompe et le régulateur de température, en vous assurant que la température ne dépasse pas 34 degrés Celsius. Il peut s’écouler jusqu’à une heure avant que la température de la chambre ne se stabilise.Il est recommandé de mettre en place la chambre d’incubation avant de commencer la dissection rétinienne. La température stable de la chambre aide à réduire la dérive de l’échantillon. Pour transférer le monticule plat rétinien dans la chambre de perfusion, arrêtez la pompe et retirez le CSPa qui se trouve dans la chambre.Placez ensuite le disque MCE avec le support plat rétinien dans la chambre d’incubation. Pré-mouillez un poids d’échantillon pour briser la tension superficielle, puis placez-le sur le support plat en vous assurant que le poids de l’échantillon est placé sur le papier MCE pour réduire la dérive de l’échantillon. Remplissez la chambre avec l’aCSF réchauffé et faites circuler l’aCSF à environ un millilitre par minute.Positionnez le nez avec l’objectif de trempage d’eau 25 fois dans la chambre d’imagerie. Filtrez les cellules marquées d’intérêt à l’aide d’une lumière épifluorescente et ajustez le volume d’imagerie pour capturer les caractéristiques dendritiques d’intérêt. À l’aide d’une table de choix qui identifie à la fois les pixels sursaturés et sous-saturés, ajustez la puissance du laser de manière à ce qu’aucun pixel ne soit sursaturé.Acquérez le volume d’imagerie 3D et répétez l’acquisition à la fréquence d’images souhaitée. Le volume d’imagerie peut être ajusté entre chaque point temporel pour compenser la dérive de l’échantillon. Importez la série d’images en divisant les images en fonction du temps.Enregistrez tous les points de temps manuellement ou en exécutant un plugin de macro. Créez une fonction théorique d’étalement de points à l’aide du plug-in ImageJ en cliquant sur Défenaction PSF 3D, l’ouverture numérique de l’objectif, la longueur d’onde d’émission de fluorophore, la taille des pixels et l’espacement Z sont nécessaires pour créer un PSF précis. Sélectionnez des plugins, des macros et exécutez pour effectuer une déconvolution itérative parallèle par lots pour tous les points temporels à l’aide de la macro fournie.Importez tous les points temporels déconcentrés en tant que pile en cliquant sur fichier, importer, puis séquence d’images. Convertissez la pile en hyperstack en cliquant sur image, hyperstacks, puis piles en hyperstack. Ajoutez le nombre de tranches Z et de périodes, puis corrigez la dérive 3D à l’aide du plugin de dérive 3D approprié.Enregistrez l’hyperstack corrigée de la dérive 3D et reconvertissez l’image en une pile normale en cliquant sur image, hyperstacks, hyperstack à empiler, puis divisez les points temporels en cliquant sur image, piles, outils et séparateur de piles. Pour connaître le nombre de sous-piles à fractionner, entrez le nombre de points temporels. Utilisez le traitement par lots pour créer une projection maximale pour tous les points temporels.Importez la séquence d’images en accéléré en cliquant sur fichier, importer, puis séquence d’images. Et utilisez les outils ImageJ conventionnels pour l’analyse souhaitée de la vidéo bidimensionnelle déconcentrée et post-traitée, Une vidéo 3D haute résolution de dendrites de cellules de sursaut d’étoiles en développement a été acquise, déconvolvée et corrigée pour la dérive 3D. Des projections maximales du plan Z ont été produites pour réaliser des vidéos 2D à des fins d’analyse, montrant une zone de raffinement dendritique et une zone de croissance dendritique.La déconvolution 3D de chaque point temporel a augmenté la résolution des projections de filopodes fins de cellule amacrine à sursaut d’étoile P6 unique avant et après la déconvolution avec ImageJ. Les périodes prolongées d’infection à AAV n’entraînent pas nécessairement une augmentation du signal fluorescent, comme le montrent des niveaux similaires d’expression des protéines cinq et 11 jours après l’injection. Il est important de réduire la dérive de l’échantillon pendant l’imagerie.La dérive est minimisée en maintenant une température d’imagerie constante et en positionnant correctement le poids sur l’échantillon. En cas de dérive, l’acquisition manuelle de la série chronologique permet d’ajuster le volume d’imagerie entre les images. Cela garantit que les caractéristiques d’intérêt restent dans le cadre.Ce protocole produit des vidéos 3D haute résolution, déconcentrées et corrigées de la dérive de neurites en développement. De telles vidéos permettent de mieux comprendre le câblage des neurones et sont nécessaires pour faire progresser les méthodes d’analyse informatique de la morphogenèse 3D. De meilleurs logiciels de traçage et de suivi automatiques sont nécessaires pour réaliser une analyse à haut débit du développement de neurites.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Injection intracrânienne des vecteurs adéno-associés virale

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Recherche

Neurosciences

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Un test organotypique à haute résolution imagerie time-lapse de la migration neuronale dans le cerveau postnatal

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Réponses d&#39;imagerie neuronale dans les préparations d&#39;organe voméronasal Slice Exprimant un capteur de calcium codées génétiquement

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes en tranches aiguës du cerveau antérieur souris adultes

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Moteur section du nerf et imagerie time-lapse de comportements de cellules gliales chez le poisson zèbre en direct

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

La livraison de vecteur 9 (AAV9) associée au virus Adeno-Associé Subpial (AAV9) chez les souris adultes

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Méthodes et conseils pour l’Administration intraveineuse de Virus Adeno-associé à des Rats et d’évaluation de la Transduction du système nerveux Central

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisation et l’imagerie direct des oligodendrocytes Organelles dans des tranches de cerveau organotypique utilisant Virus Adeno-associé et microscopie confocale

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Analyse quantitative de la complexité d’arborisation dendritique neuronale chez la drosophile

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...