Name: time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Wir danken Madison Gray, dass sie mir geholfen hat, als ich keine hatte. Diese Forschung wurde durch einen NSERC Discovery Grant (RGPIN-2016-06128), ein Sloan Fellowship in Neuroscience und einen Canada Research Chair Tier 2 (an J.L.L.) unterstützt. S. Ing-Esteves wurde durch das Vision Science Research Program und NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral unterstützt.

HINWEIS: Dieses Protokoll erstreckt sich über 2 Tage mit einem Mindestzeitraum von 4-5 Tagen für die Virustransduktion zwischen den Versuchstagen (Abbildung 1A). Tierversuche werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care für die Verwendung von Tieren in der Forschung und Labortierpflege gemäß Protokollen durchgeführt, die vom Laboratory of Animal Services Animal Use and Care Committee am Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada) genehmigt wurden....

Dieses Video zeigt eine experimentelle Pipeline, die vorhandene genetische Werkzeuge nutzt, um die Dendritendynamik der sich entwickelnden Netzhautneuronen mit konfokaler Live-Bildgebung abzubilden. Gezeigt werden auch intraokulare Injektionen von Cre-abhängigen AAVs, die membrangerichtete fluoreszierende Proteine in neonatale Mäuse kodieren. Einzelzellen genetisch zielgerichteter Populationen sind bereits mit 4-5 dpi hell markiert. Retinale flache Montierungen wurden für Standard-Bildgebungskammern vorbereitet, um ko...

Dendriten von Netzhautneuronen bilden komplizierte, aber spezifische Muster, die ihre Funktion innerhalb neuronaler Schaltkreise beeinflussen. In der Netzhaut von Wirbeltieren tragen verschiedene Arten von retinalen Ganglienzellen (RGCs) und Amacrinzell-Interneuronen einzigartige dendritische Morphologien, die sich in Baumgröße, Lage, Astlänge und Dichte unterscheiden1. Während der postnatalen Entwicklung verlängern RGCs und Amacrinzellen überschwängliche dendritische Prozesse in einen Neuropil, der als innere plexiforme Schicht (IPL) bezeichnet wird, wo sie bipolare Zelleingänge empfangen, die Photorezeptorsignale übertragen2. Wie durch Zeitraffer-Bildgebung fluoreszierend markierter Netzhautpopulationen in Küken- oder Zebrafischlarven erfasst, ist die Dendritenmorphogenese hochdynamisch3,4,5. Innerhalb weniger Tage dehnen sich dendritische Lauben aus, remodellieren und verzweigen sich zu engen Unterschichten des IPL, wo sie mit ausgewählten Partnern synapsieren. Die Dornen weisen im Laufe der Entwicklung unterschiedliche strukturelle Dynamiken auf, mit Änderungen der relativen Raten der Zweigaddition, des Rückzugs und der Stabilisierung. Amacrin- und RGC-Dendriten zeigen auch unterschiedliche Auswuchs- und Umbauverhaltensweisen, die eine typspezifische Arborisierung widerspiegeln können. Diese Studien verfolgten jedoch breite amakrine oder RGC-Populationen und konzentrierten sich auf laminares Targeting, das nur ein Aspekt der Morphologie ist.
Die Mechanismen, die die enorme morphologische Vielfalt erzeugen, die bei retinalen Subtypen beobachtet wird, sind kaum verstanden. Ziel dieser Gruppe war es, eine Methode zur Erfassung der Dendritendynamik und des Dornumbaus definierter retinaler Subtypen in Mäusen zu entwickeln. Die Identifizierung zelltypspezifischer Mechanismen der Dendritenmusterung erfordert Methoden zur Visualisierung und Messung des Dendritenverhaltens von Zellen von Interesse. Organotypische Kulturen von Mausretinas eignen sich gut für Lebendzellbildgebungsstudien mit konfokaler oder Multiphotonenmikroskopie. Sich entwickelnde Netzhäute werden seziert und zu einem flachen Explant montiert, das für mehrere Stunden in einer Aufnahmekammer abgebildet oder über einige Tage mit begrenzten Auswirkungen auf die Schaltung kultiviert werden kann6,7. Lebende retinale Neuronen können durch eine Vielzahl von Techniken markiert werden, einschließlich Farbstofffüllung durch Elektroden, Elektroporation, biolistische Abgabe von Partikeln, die mit lipophilen Farbstoffen oder Plasmiden, die für fluoreszierende Proteine (z. B. Gene Gun) beschichtet sind, sowie genetisch kodierte Zellmarkierungen7,8,9,10 . Diese Ansätze sind jedoch ineffizient für die Bildgebung der Dendritendynamik bestimmter retinaler Subtypen. Zum Beispiel sind Farbstofffüllmethoden mit geringem Durchsatz und erfordern elektrophysiologische Geräte und zusätzliche genetische Markierungen, um zuverlässig auf Zellen von Interesse abzuzielen. Darüber hinaus können die starken Fluoreszenzsignale im Soma benachbarte Dendriten verdecken.
Biolistische Genabgabemethoden können gleichzeitig Dutzende von Zellen markieren, aber Schritte, die die Hochdruckpartikelabgabe und die Inkubation isolierter Netzhaut über Nacht beinhalten, können die Zellphysiologie und das dendritische Auswachsen beeinträchtigen. Dieses Papier schlägt vor, dass neuere genetische Werkzeuge eingesetzt werden können, um die frühe Dendritendynamik mit Zelltyp und struktureller Auflösung zu erfassen, wobei die folgenden experimentellen Kriterien berücksichtigt werden. Erstens, um die feinen Zweige und Filopodien aufzulösen, die sich entwickelnde Lauben dominieren, sollte die Methode Neuronen mit hellen, fluoreszierenden Proteinen markieren, die Prozesse in der gesamten Laube füllen. Die Fluoreszenzmarkierung sollte aufgrund von Photobleichen während der Bildgebungsphase nicht verblassen. Eine Vielzahl von fluoreszierenden Proteinvarianten wurde generiert und auf Eignung für in vivo/ex vivo imaging11 basierend auf Helligkeit und Photostabilität verglichen. Zweitens müssen die fluoreszierenden Proteine (XFPs) im frühesten Stadium der Dendritenmorphogenese in ausreichend hohen Mengen exprimiert werden, damit das enge Entwicklungsfenster nicht übersehen wird. Bei Analysen statischer Zeitpunkte in der Netzhaut der Maus tritt die Entwicklung der Dendriten während der ersten postnatalen Woche auf und umfasst Phasen des Auswachsens, des Umbaus und der Stabilisierung10,12,13,14,15. Drittens sollte die Methode zu einer selektiven Markierung oder zu einer erhöhten Wahrscheinlichkeit der Markierung der interessierenden neuronalen Subpopulation führen. Viertens muss die Markierung der Zielsubpopulation ausreichend spärlich sein, damit die gesamte neuronale Laube identifiziert und verfolgt werden kann. Obwohl RGC- und amakrine Subtypen durch ihre reifen morphologischen Eigenschaften und IPL-Schichtungsmuster unterschieden werden können16,17,18,19,20, besteht die Herausforderung darin, Subtypen während der Entwicklung basierend auf unreifen Strukturen zu identifizieren. Diese Aufgabe wird durch die Erweiterung transgener Werkzeuge erleichtert, um bestimmte retinale Zelltypen während der Entwicklung zu markieren.
Transgene und Knock-in-Mauslinien, in denen die zelluläre und zeitliche Expression fluoreszierender Proteine oder Cre durch genregulatorische Elemente bestimmt wird, werden häufig zur Untersuchung von Netzhautzelltypen verwendet13,21,22,23. Wichtige Beobachtungen zu subtypspezifischen Mustern der Dendritenentwicklung stammen aus Studien an transgenen Mausnetzhäuten zu statischen Zeitpunkten10,14,24,25. Insbesondere das Cre-Lox-System ermöglicht eine exquisite Genmanipulation und Überwachung von Subtypen mit einer Vielzahl von rekombinaseabhängigen Reportern, Sensoren und optogenetischen Aktivatoren. Diese Werkzeuge haben zur Entdeckung subtypspezifischer molekularer Programme und funktioneller Eigenschaften geführt, die der retinalen Schaltkreismontage zugrunde liegen26,27,28,29,30. Sie müssen jedoch noch genutzt werden, um die subtypspezifische Dendritendynamik in der Netzhaut der Maus zu untersuchen. Eine Markierung mit geringer Dichte kann durch die Kombination von Cre-Mauslinien mit Transgenen erreicht werden, die durch Elektroporation oder durch rekombinante AAVs eingeführt werden. Falls verfügbar, können auch Tamoxifen-induzierbare Cre-Linien oder intersektionale genetische Strategien verwendet werden. Schließlich sollte die Zelle minimal-invasiv markiert und unter Verwendung von Erfassungsparametern abgebildet werden, um das Gewebe nicht zu beeinträchtigen oder die für die Dendritenmorphogenese erforderliche Zellfunktion zu beeinträchtigen.
Hier wird eine Methode zur Anwendung transgener Werkzeuge und konfokaler Mikroskopie vorgestellt, um die Dendritendynamik in lebenden Netzhautexplantationen von Mäusen zu untersuchen. Cre transgene Mauslinien wurden mit AAV-Vektoren kombiniert, die fluoreszierende Proteine bei Cre-Rekombination exprimieren, was eine spärliche Markierung von Netzhautzellen von Interesse ermöglicht. Kommerziell erhältliche AAVs werden durch intravitreale Injektionen an die neonatale Netzhaut abgegeben. Diese Arbeit zeigt, dass AAVs eine signifikant hohe und zelltypspezifische Fluoreszenzexpression von 4 dpi erzeugen, was den Zugang zu postnatalen Zeitpunkten ermöglicht. Um diesen Ansatz zu veranschaulichen, wurde das cholinerge "Starburst" amacrine Interneuron markiert, indem Brainbow AAV in neonatalen Mäusen verabreicht wurde, die das Cholin-Acetyltransferase (ChAT)-interne Ribosom-Entry-Site (IRES)-Cre-Transgen exprimierten, das in der frühen postnatalen Netzhaut aktiv ist31,32. Starburst-Amakrinzellen entwickeln eine stereotype und radiale Dornmorphologie, die durch die Selbstvermeidung von Dendriten geformt wird, die durch die geclusterten Protocadherine vermittelt wird33,34. Diese Arbeit zeigt, dass die Auflösung von Starburst-Dendriten und Filopodien durch XFPs zur Plasmamembran durch Zugabe des CAAX-Motivs, das einer Farnesylierung unterzogen wird, wie es für den Brainbow AAVs31 verwendet wird, signifikant verbessert wird. Schließlich wurden Zeitraffer-Bildgebungs- und Nachbearbeitungsprotokolle bestimmt, die qualitativ hochwertige Bilder erzeugen, die für die Dendritenrekonstruktion und morphometrische Quantifizierung geeignet sind. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Faktoren zu identifizieren, die die Dendritenmorphogenese kontrollieren, und um mehrere zelluläre Verhaltensweisen in der intakten Netzhaut zu erfassen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45185-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45186-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HABG01 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 50 &#215; 15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470313-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene disposable transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tip paint brush, size 3/0</td>
			<td>Conventional art supply store</td>
			<td></td>
			<td>Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-imaging incubation system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber polyethylene tubing, PE-160 10&#39;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel heater controller, Model TC-344C</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater controller cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CC-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large bath incubation chamber with slice support</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample anchor (Harps)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0260</td>
			<td>Sample anchor must be compatible with incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sloflo In-line Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Microliter Syringe Series 700, Removable Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)&#160;</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2453</td>
			<td>Addgene Plasmid #45185&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 
			1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2454</td>
			<td>Addgene Plasmid #45186</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF Dye content &#8805;85 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tattoo paste</td>
			<td>Ketchum MFG Co</td>
			<td>329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>PV-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>Supplier may vary depending on region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH35317.604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>Open source</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations

Die Entdeckung von Mechanismen, die dendritische Dornen strukturieren, erfordert Methoden zur Visualisierung, Abbildung und Analyse von Dendriten während der Entwicklung. Die Mausnetzhaut ist ein leistungsfähiges Modellsystem zur Untersuchung zelltypspezifischer Mechanismen der neuronalen Morphogenese und Konnektivität. Die Organisation und Zusammensetzung der retinalen Subtypen ist klar definiert, und genetische Werkzeuge stehen zur Verfügung, um während der Entwicklung auf bestimmte Typen zuzugreifen. Viele retinale Zelltypen beschränken ihre Dendriten und / oder Axone auch auf schmale Schichten, was die Zeitrafferbildgebung erleichtert. Maus-Retina-Explantationskulturen eignen sich gut für die Lebendzellbildgebung mittels konfokaler oder Multiphotonenmikroskopie, aber es fehlen Methoden, die für die Bildgebung der Dendritendynamik mit zeitlicher und struktureller Auflösung optimiert sind. Hier wird eine Methode vorgestellt, um die Entwicklung spezifischer Netzhautpopulationen, die durch das Cre-Lox-System gekennzeichnet sind, spärlich zu markieren und abzubilden. Kommerziell erhältliche Adeno-assoziierte Viren (AAVs), die hier verwendet werden, exprimierten membranzielgerichtete fluoreszierende Proteine in einer Cre-abhängigen Weise. Die intraokulare Verabreichung von AAVs bei neonatalen Mäusen führt zu einer fluoreszierenden Markierung der Zielzelltypen durch 4-5 Tage nach der Injektion (dpi). Die Membranfluoreszenzsignale sind durch konfokale Bildgebung detektierbar und lösen feine Aststrukturen und -dynamiken auf. Hochwertige Videos von 2-4 h werden von bildgebenden retinalen Flatmounts aufgenommen, die mit sauerstoffreicher künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) durchblutet sind. Ebenfalls enthalten ist eine Bildnachbearbeitungspipeline zur Dekonvolution und dreidimensionalen (3D) Driftkorrektur. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um mehrere zelluläre Verhaltensweisen in der intakten Netzhaut zu erfassen und neue Faktoren zu identifizieren, die die Morphogenese der Neuriten steuern. Viele Entwicklungsstrategien, die in der Netzhaut erlernt werden, werden für das Verständnis der Bildung neuronaler Schaltkreise an anderer Stelle im zentralen Nervensystem relevant sein.

Mit dem obigen Protokoll wurde ein hochauflösendes 3D-Video der Entwicklung von Starburst-Zelldendriten aufgenommen, dekonvolviert und für die 3D-Drift korrigiert. Es wurden maximale Projektionen der Z-Ebene erstellt, um 2D-Videos für die Analyse zu erstellen (Ergänzendes Video 1, Abbildung 5A). Die 3D-Dekonvolution jedes Zeitpunkts erhöhte die Auflösung von feinen Filopodienprojektionen (Abbildung 5B,C). Feine Filopodienv...

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Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Hier stellen wir eine Methode zur Untersuchung der Neuritenmorphogenese in postnatalen Maus-Netzhautexplantationen mittels konfokaler Zeitraffinalmikroskopie vor. Wir beschreiben einen Ansatz zur spärlichen Markierung und Erfassung von retinalen Zelltypen und deren Feinprozessen unter Verwendung rekombinanter adenoassoziierter Virusvektoren, die membrangerichtete fluoreszierende Proteine in einer Cre-abhängigen Weise exprimieren.

Zeitraffer-Bildgebung neuronaler Arborisation mittels spärlicher adenoassoziierter Virusmarkierung genetisch zielgerichteter Netzhautzellpopulationen

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Die Einzelzellmarkierung und Visualisierung von dendritischen oder axonalen Lauben ist erforderlich, um die neuronale Morphogenese zu untersuchen. Durch die minimal-invasive Kennzeichnung von sich entwickelnden Lauben bleibt das Netzhautgewebe gesund und für eine längere konfokale Live-Bildgebung geeignet. Der Hauptvorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, einzelne Lauben mit mehrfarbigen fluoreszierenden Proteinen innerhalb von vier Tagen nach der Injektion sichtbar zu machen.Dies ermöglicht die Untersuchung neonataler Laubenmorphologien. Dieses Injektionsbildgebungs- und Analyseprotokoll kann verwendet werden, um neuronale Morphologien im gesamten Zentralnervensystem zu untersuchen. Die geeignete Cre-Selektion und der Injektionsort müssen so bestimmt werden, dass sie auf die interessierende Zellpopulation abzielen.Beginnen Sie mit der Auswahl einer Cre-Mauslinie, um die interessierenden Netzhautzellpopulationen zu kennzeichnen. Erhalten Sie ein rekombinaseabhängiges AAV-Virus, das für fluoreszierende Proteine kodiert. Für eine optimale Markierung von Feinprozessen wählen Sie Vektoren, die modifizierte fluoreszierende Proteine exprimieren, die auf die Plasmamembran abzielen.Für das AAV-Aliquot auf Eis und bereiten Sie eine ein- bis vierfache AAV-Verdünnung mit steriler Kochsalzlösung oder PBS vor. Um die Injektionen zu visualisieren, färben Sie die Lösung blau, indem Sie etwa einen Mikroliter 0,02% Fast Green FCF-Farbstofflösung pro 15 Mikroliter AAV-Verdünnung hinzufügen. Sterilisieren Sie den Injektionsbereich mit 70% Ethanol.Füllen Sie die Mikropipette mit einer Mikrospritze mit der AAV-Verdünnung ab. Brechen Sie unter einem Stereomikroskop die Mikropipettenspitze mit einer 30-Gauge-Nadel, um die Spitze abzudichten. Nachdem Sie die neonatalen Mäuse betäubt haben, tätowieren Sie ihre Pfotenpolster mit Tätowierfarbe mit einer 30-Gauge-Nadel, um die Tiere zu identifizieren.Sammeln Sie Schwanzausschnitte für die DNA-Isolierung und Genotypisierung. Tupfen Sie die Haut über den Augen mit 70% Ethanol ab. Verwenden Sie eine 30-Gauge-Nadel, um das verschmolzene Augenlid zu öffnen, während Sie leichten Druck mit den Fingern ausüben, um das Auge zu öffnen.Stecken Sie ein kleines Loch durch die Hornhaut an der Hornhaut-Sklera-Kreuzung. Setzen Sie die Glasmikropipette in das Loch ein und drücken Sie das Mikroinjektor-Fußpedal zwei- bis viermal, um das AAV in den intravitrealen Raum zu injizieren. Entfernen Sie langsam die Mikropipette und bestätigen Sie die AAV-Injektion, indem Sie den blauen Farbstoff in der Pupille sichtbar machen.Nachdem Sie das retinale aCSF wie im Textmanuskript beschrieben hergestellt haben, sauerstoffreichen Sie das retinale aCSF, indem Sie mindestens 15 Minuten lang mit Carbogen sprudeln, und stellen Sie dann den pH-Wert auf 7,4 ein. Betten Sie eine Petrischale mit einem Durchmesser von 60 Millimetern in eine Eisschale ein und füllen Sie sie mit sauerstoffreichem retinalem aCSF. Legen Sie die gefüllte Petrischale unter ein Stereomikroskop.Als nächstes schneiden Sie den Augenlidlappen der eingeschläferten Maus ab, um das Auge freizulegen. Verwenden Sie stumpfe Pinzetten, um die Augen zu enukleieren und sie in das kalte retinale aCSF unter dem Stereomikroskop zu übertragen. Stabilisieren Sie unter dem Stereomikroskop das Auge, indem Sie den Sehnerv mit der Dumont-Pinzette Nummer fünf umklammern und mit einer 30-Gauge-Nadel ein Loch in die Mitte der Hornhaut stechen, dann eine Spitze der Mikroschere in das Loch einführen, um einen Schnitt vom Loch bis zum Ende der Hornhaut zu machen.Wiederholen Sie den Vorgang, um vier Scheiben in die Himmelsrichtungen zu machen und vier Klappen zu erzeugen. Greifen und ziehen Sie die beiden benachbarten Klappen auseinander und schälen Sie die Sklera vorsichtig von der Netzhaut für alle Hornhautklappen. Entfernen Sie dann die Linse mit der Pinzette aus der Netzhauttasse.Verwenden Sie schließlich eine Mikroschere, um vier radiale Schnitte vom Rand der Netzhaut in Richtung Sehnerv zu machen, wodurch vier gleiche Blütenblätter entstehen. Wenn Sie graue MCE-Membranfilter mit großem Durchmesser für die Montage verwenden, schneiden Sie die Scheibe in Quadranten mit einem Durchmesser von etwa einem Zentimeter und legen Sie die MCE-Scheibe dann auf die Mitte eines größeren weißen Filterpapiers. Drehen Sie mit zwei Pinseln der Größe drei mal Null einen Netzhautbecher auf einen Pinsel, wobei die retinale Ganglienzelle mit der Seite nach unten zeigt.Heben Sie die Netzhaut vorsichtig aus dem aCSF heraus und stellen Sie sicher, dass die Wasserspannung die Netzhaut nicht reißt. Während Sie den Pinsel noch mit der Netzhaut halten, bewegen Sie die Petrischale mit aCSF aus dem Weg und legen Sie das weiße Filterpapier mit der MCE-Membran unter das Stereoskop. Legen Sie mit einer Transferpipette einen Tropfen aCSF in die Mitte des MCE-Filterpapiers.Schweben Sie die Netzhaut in das aCSF-Tröpfchen, das durch die Oberflächenspannung und die geladene MCE-Membran erzeugt wird. Verwenden Sie Pinsel, um die Netzhaut innerhalb des Tröpfchens mit der Rückseite der retinalen Ganglienzelle nach oben zu positionieren, und entfalten Sie dann die vier Blütenblätter. Sobald Sie positioniert sind, erstellen Sie eine Wasserbrücke zwischen dem Pinsel und dem weißen Filterpapier, um die Oberflächenspannung des Tröpfchens zu brechen.Montieren Sie die Live-Imaging-Inkubationskammer und füllen Sie sie mit sauerstoffhaltigem aCSF. Schalten Sie die Pumpe und den Temperaturregler ein und achten Sie darauf, dass die Temperatur nicht über 34 Grad Celsius steigt. Es kann bis zu einer Stunde dauern, bis sich die Kammertemperatur stabilisiert hat.Es wird empfohlen, die Inkubationskammer vor Beginn der Netzhautdissektion einzurichten. Stabile Kammertemperatur hilft, die Probendrift zu reduzieren. Um den retinalen flachen Hügel in die Perfusionskammer zu übertragen, stoppen Sie die Pumpe und entfernen Sie den aCSF, der sich in der Kammer befindet.Legen Sie dann die MCE-Disc mit der retinalen flachen Halterung in die Inkubationskammer. Benetzen Sie ein Probengewicht vor, um die Oberflächenspannung zu brechen, und legen Sie es dann auf die flache Halterung, um sicherzustellen, dass das Probengewicht auf das MCE-Papier gelegt wird, um die Probendrift zu reduzieren. Füllen Sie die Kammer mit dem erwärmten aCSF auf und zirkulieren Sie aCSF mit etwa einem Milliliter pro Minute.Positionieren Sie den Nasenhalter mit dem 25-fachen Wassertauchobjektiv in der Bildgebungskammer. Suchen Sie mit epifluoreszierendem Licht nach markierten Zellen von Interesse und passen Sie das Bildgebungsvolumen an, um dendritische Merkmale von Interesse zu erfassen. Passen Sie die Laserleistung mithilfe einer Nachschlagetabelle an, die sowohl übersättigte als auch untersättigte Pixel identifiziert, sodass keine Pixel übersättigt sind.Erfassen Sie das 3D-Bildvolumen und wiederholen Sie die Aufnahme mit der gewünschten Bildrate. Das Bildvolumen kann zwischen den einzelnen Zeitpunkten eingestellt werden, um die Probendrift zu kompensieren. Importieren Sie die Bildserie und teilen Sie die Bilder nach Zeit auf.Speichern Sie alle Zeitpunkte manuell oder durch Ausführen eines Makro-Plugins. Erstellen Sie eine theoretische Punktspreizfunktion mit dem ImageJ-Plugin, indem Sie auf Defraction PSF 3D klicken, die numerische Blende des Objektivs, die Fluorophor-Emissionswellenlänge, die Pixelgröße und der Z-Abstand sind erforderlich, um eine genaue PSF zu erstellen. Wählen Sie Plug-ins und Makros aus, und führen Sie sie aus, um eine parallele iterative Dekonvolution für alle Zeitpunkte mithilfe des bereitgestellten Makros durchzuführen.Importieren Sie alle verdrehten Zeitpunkte als Stapel, indem Sie auf Datei, Import und dann auf Bildsequenz klicken. Konvertieren Sie den Stack in einen Hyperstack, indem Sie auf image, hyperstacks und dann auf stacks in hyperstacks klicken. Fügen Sie die Anzahl der Z-Slices und Zeitrahmen hinzu und korrigieren Sie dann die 3D-Drift mit dem richtigen 3D-Drift-Plugin.Speichern Sie den 3D-Drift-korrigierten Hyperstack und konvertieren Sie das Bild zurück in einen normalen Stack, indem Sie auf Image, Hyperstacks, Hyperstack to Stack klicken und dann die Zeitpunkte teilen, indem Sie auf Image, Stacks, Tools und Stacks Splitter klicken. Geben Sie für die Anzahl der aufzuteilenden Teilstapel die Anzahl der Zeitpunkte ein. Verwenden Sie die Stapelverarbeitung, um eine maximale Projektion für alle Zeitpunkte zu erstellen.Importieren Sie die Zeitraffer-Bildsequenz, indem Sie auf Datei, Import und dann auf Bildsequenz klicken. Und verwenden Sie herkömmliche ImageJ-Tools für die gewünschte Analyse von dekonvolvierten und nachbearbeiteten zweidimensionalen Videos, Ein hochauflösendes 3D-Video der Entwicklung von Starburst-Zelldendriten wurde aufgenommen, dekonvolviert und für 3D-Drift korrigiert. Maximale Projektionen der Z-Ebene wurden erstellt, um 2D-Videos für die Analyse zu erstellen, die einen Bereich der dendritischen Verfeinerung und einen Bereich des dendritischen Auswuchses zeigen.Die 3D-Dekonvolution jedes Zeitpunkts erhöhte die Auflösung von feinen Filopodienprojektionen einzelner P6-Starburst-Amakrinzellen vor und nach der Dekonvolution mit ImageJ. Längere AAV-Infektionsperioden führen nicht unbedingt zu einem erhöhten Fluoreszenzsignal, wie ähnliche Proteinexpression fünf und 11 Tage nach der Injektion zeigen. Es ist wichtig, die Probendrift während der Bildgebung zu reduzieren.Die Drift wird minimiert, indem eine konstante Abbildungstemperatur aufrechterhalten und das Gewicht auf der Probe entsprechend positioniert wird. Wenn eine Drift auftritt, ermöglicht die manuelle Erfassung der Zeitreihe die Anpassung des Bildvolumens zwischen den Frames. Dadurch wird sichergestellt, dass die interessierenden Merkmale im Rahmen bleiben.Dieses Protokoll erzeugt hochauflösende, dekonvolvierte und driftkorrigierte 3D-Videos von sich entwickelnden Neuriten. Solche Videos führen zu einem besseren Verständnis der Neuronenverdrahtung und sind erforderlich, um computergestützte Analysemethoden der 3D-Morphogenese voranzutreiben. Bessere automatische Tracing- und Tracking-Software ist erforderlich, um eine Hochdurchsatzanalyse der Neuritenentwicklung zu erreichen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intrakranielle Injektion von Adeno-assoziierte virale Vektoren

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Forschung

Neurowissenschaften

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Imaging neuronalen Antworten in Scheiben Zubereitungen von Vomeronasalorgan Ausdruck eines genetisch kodierte Kalzium-Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-assoziiertes Virus 9 (AAV9) Vektorlieferung in erwachsenen Mäusen

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Methoden und Tipps für die intravenöse Gabe von Adeno-assoziierten Virus an Ratten und Bewertung des zentralen Nervensystems Transduktion

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisierung und Live Imaging Oligodendrozyt Organellen in organotypischen Gehirnscheiben mit Adeno-assoziierten Virus und konfokale Mikroskopie

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analyse der neuronalen dendritischen Arborization Komplexität in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...