Name: time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

אנו מודים למדיסון גריי על שעזרה לי כשלא היה לי. מחקר זה נתמך על ידי מענק גילוי NSERC (RGPIN-2016-06128), מלגת סלואן במדעי המוח ויו"ר מחקר קנדה רובד 2 (ל- J.L.L. ). ס. אינג-אסטבס נתמך על ידי תוכנית המחקר למדעי הראייה ומלגות לתואר שני של NSERC- דוקטורט.

הערה: פרוטוקול זה משתרע על פני יומיים עם פרק זמן מינימלי של 4-5 ימים להעברה ויראלית בין ימי ניסוי (איור 1A). ניסויים בבעלי חיים מבוצעים בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים לשימוש בבעלי חיים במחקר וטיפול בבעלי חיים במעבדה תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי המעבדה לשירותים ...

וידאו זה מדגים צינור ניסיוני המשתמש בכלים גנטיים קיימים כדי לדמיין דינמיקה של דנדריט של פיתוח נוירונים ברשתית עם הדמיה חיה קונפוקלית. כמו כן הוכחו זריקות תוך עיניות של AAVs תלויי Cre קידוד חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה לעכברים יילודים. תאים בודדים של אוכלוסיות ממוקדות גנטית מסומנים ב?...

דנדריטים של נוירונים ברשתית יוצרים דפוסים מורכבים, אך ספציפיים, המשפיעים על תפקידם בתוך מעגלים עצביים. ברשתית החולייתנית, סוגים מגוונים של תאי גנגליון רשתית (RGCs) ואינטראורונים תא amacrine נושאים מורפולוגיות דנדריטיות ייחודיות השונות בגודל ארבור, מיקום, אורך ענף, וצפיפות1. במהלך התפתחות לאחר הלידה, RGCs ותאי amacrine להרחיב תהליכים דנדריטיים תוססים לתוך נוירופיל הנקרא שכבת plexiform הפנימית (IPL), שם הם מקבלים קלט תא דו קוטבי המשדר אותות photoreceptor2. כפי שנתפס על ידי הדמיה בזמן-לשגות של אוכלוסיות רשתית שכותרתו פלואורסצנטית בזחלי אפרוחים או דגי זברה, מורפוגנזה דנדריט הוא דינמי מאוד 3,4,5. בתוך ימים, arbors דנדריטי להרחיב, לשפץ, ו ramify כדי לצמצם את שכבות המשנה של IPL, שם הם סינפסה עם שותפים נבחרים. הארבורים מציגים דינמיקה מבנית שונה על פני ההתפתחות, עם שינויים בשיעורים היחסיים של תוספת ענף, נסיגה וייצוב. אמקרין ודנדריטים של RGC מפגינים גם התנהגויות שונות של צמיחה ושיפוץ שעשויות לשקף ארבוריזציה ספציפית לסוג. עם זאת, מחקרים אלה עקבו אחר אוכלוסיות אמקרין או RGC רחבות והתמקדו במיקוד למינארי, שהוא רק היבט אחד של המורפולוגיה.
המנגנונים המייצרים את המגוון המורפולוגי העצום שנצפו על פני תת-סוגים ברשתית אינם מובנים כהלכה. מטרתה של קבוצה זו הייתה לפתח שיטה ללכידת דינמיקה דנדריקית ושיפוץ ארבור של תת-סוגים מוגדרים של רשתית בעכברים. זיהוי מנגנונים ספציפיים לסוג התא של דפוסי דנדריט דורש שיטות כדי לדמיין ולמדוד התנהגויות דנדריט של תאים מעניינים. תרביות אורגנוטיפיות של רשתיות עכבר מתאימות היטב למחקרי הדמיה של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או רב-פוטונית. הרשתיות המתפתחות מנותחות ומורכבות לתוך גולה שטוח שניתן לצלם במשך מספר שעות בחדר הקלטות או לתרבות במשך כמה ימים עם השפעות מוגבלות על המעגלים 6,7. נוירוני רשתית חיים יכולים להיות מסומנים על ידי מגוון טכניקות, כולל מילוי צבע על ידי אלקטרודות, אלקטרופורציה, משלוח ביוליסטי של חלקיקים מצופים בצבעים ליפופיליים או פלסמידים קידוד חלבונים פלואורסצנטיים (למשל, Gene Gun), כמו גם תוויות תאים מקודדים גנטית7,8,9,10 . עם זאת, גישות אלה אינן יעילות עבור הדמיה דנדריט דינמיקה של תת סוגים ספציפיים ברשתית. לדוגמה, שיטות מילוי צבע הן בעלות תפוקה נמוכה ודורשות מנגנון אלקטרופיזיולוגי ותוויות גנטיות נוספות לתאי יעד אמינים של עניין. יתר על כן, אותות הפלואורסצנטיות החזקים בסומא יכולים לטשטש דנדריטים סמוכים.
שיטות העברת גנים ביוליסטיות יכולות לתייג בו זמנית עשרות תאים, אך צעדים הכוללים אספקת חלקיקים בלחץ גבוה ודגרה לילית של רשתית מבודדת עלולים לסכן את הפיזיולוגיה של התא ואת הצמיחה הדנדריטית. מאמר זה מציע כי כלים גנטיים אחרונים ניתן להשתמש כדי ללכוד דינמיקה דנדריט מוקדם עם סוג התא ורזולוציה מבנית, בהתחשב בקריטריונים הניסיוניים הבאים. ראשית, כדי לפתור את הענפים העדינים ואת הפילופודיה השולטים arbors המתפתחים, השיטה צריכה לתייג נוירונים עם חלבונים בהירים, פלואורסצנטיים הממלאים תהליכים בכל הארבור. תיוג הפלואורסצנטיות לא אמור לדעוך עקב הלבנת פוטואורסצנטיות במהלך תקופת ההדמיה. מגוון גרסאות חלבון פלואורסצנטיות נוצרו והושוו להתאמה להדמיית vivo/ex vivo/ex vivo11 המבוססת על בהירות ופוטוסטיות. שנית, החלבונים הפלואורסצנטיים (XFPs) חייבים לבוא לידי ביטוי ברמות גבוהות מספיק בשלב המוקדם ביותר של מורפוגנזה דנדריט, כך שהחלון ההתפתחותי הצר לא יוחמץ. בניתוחים של נקודות זמן סטטיות ברשתית העכבר, התפתחות דנדריט מתרחשת במהלך השבוע הראשון שלאחר הלידה וכוללת שלבים של צמיחה, שיפוץ וייצוב10,12,13,14,15. שלישית, השיטה צריכה להוביל תיוג סלקטיבי או להסתברות מוגברת של תיוג של תת האוכלוסייה העצבית של עניין. רביעית, תיוג של אוכלוסיית המשנה של היעד חייב להיות דליל מספיק, כך שניתן יהיה לזהות את הארבור העצבי כולו ולעקוב אחריו. למרות שתת-סוגים של משמרות המהפכה ואמקרין יכולים להיות מובחנים על ידי המאפיינים המורפולוגיים הבוגרים שלהם ודפוסי ריבוד IPL16,17,18,19,20, האתגר הוא לזהות תת-סוגים במהלך הפיתוח המבוססים על מבנים לא בוגרים. משימה זו מתאפשרת על ידי הרחבת כלים מהונדסים לתייג סוגי תאים ספציפיים ברשתית במהלך הפיתוח.
קווי עכבר מהונדסים ונוק-אין שבהם ביטוי תאי וטמפורלי של חלבונים פלואורסצנטיים או Cre נקבע על ידי אלמנטים רגולטוריים גנטיים נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור סוגי תאי רשתית13,21,22,23. תצפיות מפתח על דפוסים ספציפיים תת-סוג של התפתחות דנדריט הגיעו ממחקרים של רשתות עכבר מהונדסות בנקודות זמן סטטיות10,14,24,25. מערכת Cre-Lox, בפרט, מאפשרת מניפולציה וניטור גנים מעולים של תת-סוגים באמצעות מגוון כתבים, חיישנים ומפעילים אופטוגנטיים תלויי רקומבינאז. כלים אלה הובילו לתגליות של תוכניות מולקולריות ספציפיות לתת-סוג ומאפיינים פונקציונליים העומדים בבסיס הרכבת מעגל רשתית26,27,28,29,30. עם זאת, הם עדיין לא להיות ממונפים ללמוד דינמיקה דנדריט ספציפית תת סוג ברשתית העכבר. תיוג בצפיפות נמוכה ניתן להשיג על ידי שילוב קווי עכבר Cre עם טרנסג'נים שהוצגו על ידי אלקטרופורציה או על ידי AAVs רקומביננטי. אם זמין, טמוקסיפן-inducable Cre קווים או אסטרטגיות גנטיות הצטלבות ניתן להשתמש גם. לבסוף, התא צריך להיות מתויג באופן זעיר פולשני ותמונה באמצעות פרמטרי רכישה כדי לא לסכן את הרקמה או להפריע לתפקוד התאי הנדרש עבור מורפוגנזה דנדריט.
מוצגת כאן שיטה ליישם כלים מהונדסים ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לחקור את הדינמיקה של דנדריט ברשתית חיה. קווי עכבר מהונדסים Cre שולבו עם וקטורים AAV המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים על recombination Cre, המאפשר תיוג דליל של תאי רשתית של עניין. AAVs זמין מסחרית מועברים לרשתית היילוד על ידי זריקות intravitreal. מאמר זה מדגים כי AAVs לייצר ביטוי פלואורסצנטי גבוה באופן משמעותי סוג התא על ידי 4 dpi, המאפשר גישה לנקודות זמן לאחר הלידה. כדי להמחיש גישה זו, cholinergic "starburst" amacrine interneuron תויג על ידי מתן Brainbow AAV בעכברים יילודים המבטאים את כולין acetyltransferase (ChAT)-אתר הכניסה לריבוזום פנימי (IRES)-Cre transgene, אשר פעיל ברשתית שלאחר הלידה המוקדמת31,32. תאי amacrine Starburst לפתח מורפולוגיה ארבור סטריאוטיפית רדיאלית כי הוא מעוצב על ידי דנדריט הימנעות עצמית בתיווך protocadherins מקובצים33,34. מאמר זה מראה כי הרזולוציה של דנדריטים starburst ו filopodia משופרת באופן משמעותי על ידי XFPs לקרום הפלזמה עם תוספת של מוטיב CAAX אשר עובר farnesylation, כפי המשמש Brainbow AAVs31. לבסוף, נקבעו פרוטוקולי הדמיה ופוסט-עיבוד של זמן המייצרים תמונות באיכות גבוהה הניתנות לשחזור דנדריט וכימות מורפומטרי. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות גורמים השולטים מורפוגנזה דנדריט וכדי ללכוד כמה התנהגויות תאיות ברשתית שלמה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45185-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45186-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HABG01 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 50 &#215; 15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470313-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene disposable transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tip paint brush, size 3/0</td>
			<td>Conventional art supply store</td>
			<td></td>
			<td>Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-imaging incubation system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber polyethylene tubing, PE-160 10&#39;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel heater controller, Model TC-344C</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater controller cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CC-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large bath incubation chamber with slice support</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample anchor (Harps)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0260</td>
			<td>Sample anchor must be compatible with incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sloflo In-line Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Microliter Syringe Series 700, Removable Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)&#160;</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2453</td>
			<td>Addgene Plasmid #45185&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 
			1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2454</td>
			<td>Addgene Plasmid #45186</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF Dye content &#8805;85 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tattoo paste</td>
			<td>Ketchum MFG Co</td>
			<td>329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>PV-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>Supplier may vary depending on region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH35317.604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>Open source</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations

גילוי מנגנונים שמעצבים ארבורים דנדריטיים דורש שיטות להמחשה, דימוי וניתוח דנדריטים במהלך הפיתוח. רשתית העכבר היא מערכת מודל רבת עוצמה לחקירה של מנגנונים ספציפיים לסוג התא של מורפוגנזה עצבית וקישוריות. הארגון וההרכב של תת-סוגים ברשתית מוגדרים היטב, וכלים גנטיים זמינים כדי לגשת לסוגים ספציפיים במהלך הפיתוח. סוגי תאי רשתית רבים מגבילים גם את הדנדריטים ו/או האקסונים שלהם לשכבות צרות, מה שמאפשר הדמיה בזמן לשגות. תרביות רשתית העכבר מתאימות היטב להדמיית תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או מולטיפוטונית, אך חסרות שיטות המותאמות לדינמיקת דנדריט הדמיה עם רזולוציה זמנית ומבנית. מוצג כאן היא שיטה לתייג ולדמיין בדלילות את ההתפתחות של אוכלוסיות רשתית ספציפיות המסומנות על ידי מערכת Cre-Lox. וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) הזמינים מסחרית המשמשים כאן מבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה באופן תלוי Cre- תלוי. משלוח תוך עיני של AAVs בעכברים יילודים מייצר תיוג פלואורסצנטי של סוגי תאים ממוקדים על ידי 4-5 ימים לאחר ההזרקה (dpi). אותות פלואורסצנטיים ממברנה ניתנים לזיהוי על ידי הדמיה קונפוקלית ולפתור מבני ענף עדינים ודינמיקה. קטעי וידאו באיכות גבוהה המשתרעים על פני 2-4 שעות נרכשים מהדמיית רשתית שטוחה-תושבות עם נוזל שדרתי מלאכותי מחומצן (aCSF). כמו כן מסופק צינור לאחר עיבוד תמונה עבור deconvolution ותיקון סחיפה תלת מימדי (3D). פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללכוד כמה התנהגויות תאיות ברשתית שלמה ולזהות גורמים חדשניים השולטים מורפוגנזה neurite. אסטרטגיות התפתחותיות רבות הנלמדות ברשתית יהיו רלוונטיות להבנת היווצרות מעגלים עצביים במקומות אחרים במערכת העצבים המרכזית.

באמצעות הפרוטוקול לעיל, וידאו 3D ברזולוציה גבוהה של דנדריטים תאים starburst פיתוח נרכש, פירוק, ותיקן עבור סחיפה 3D. הקרנות מקסימליות של מטוס Z הופקו כדי ליצור סרטוני דו-ממד לניתוח (סרטון משלים 1, איור 5A). פירוק תלת-ממדי של כל נקודת זמן הגביר את הרזולוציה של תחזיות פילופודיה ...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

כאן, אנו מציגים שיטה לחקירת מורפוגנזה נויריט ברשתית לאחר הלידה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית לשגות זמן. אנו מתארים גישה לתיוג דליל ורכישה של סוגי תאי רשתית ותהליכים עדינים שלהם באמצעות וקטורים וירוס הקשורים אדנו רקומביננטי המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה באופן תלוי Cre.

הדמיה בזמן לשגות של arborization עצבי באמצעות תיוג וירוסים דליל אדנו הקשורים של אוכלוסיות תאי רשתית ממוקדים גנטית

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

תיוג תא יחיד והדמיה של arbors דנדריטי או אקסוני נדרש לחקור מורפוגנזה עצבית. על ידי תיוג פיתוח arbors באופן זעיר פולשני, רקמת הרשתית נשארת בריאה ומתאימה להדמיה חיה קונפוקלית ממושכת. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא היכולת לדמיין arbors בודדים עם חלבונים פלואורסצנטיים צבעוניים מרובי צבעים בתוך ארבעה ימים לאחר ההזרקה.זה הופך את לימוד מורפולוגיות ארבור יילודים לאפשריות. פרוטוקול הדמיה וניתוח הזרקה זה יכול לשמש כדי ללמוד מורפולוגיות עצביות ברחבי מערכת העצבים המרכזית. בחירת Cre מתאימה ומיקום הזרקה חייבים להיות נחושים כדי למקד את אוכלוסיית התאים של עניין.התחל על ידי בחירת קו עכבר Cre כדי לתייג את אוכלוסיות תאי הרשתית של עניין. להשיג רקומבינאז תלוי AAV וירוס קידוד חלבונים פלואורסצנטיים. לקבלת תיוג אופטימלי של תהליכים עדינים, בחר וקטורים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים מותאמים המתמקדים בקרום הפלזמה.עבור aliquot AAV על קרח, ולהכין דילול AAV אחד עד ארבעה באמצעות תמיסת מלח סטרילית או PBS. כדי לדמיין את הזריקות, צבע את הפתרון בכחול על-ידי הוספת מיקרוליטר אחד של 0.02% פתרון צבע FCF מהיר ירוק עבור כל 15 מיקרוליטרים של דילול AAV. לחטא את אזור ההזרקה עם 70% אתנול.מלאו את המיקרופיפט בדילול AAV באמצעות מיקרו-מזרק. תחת מיקרוסקופ סטריאו, לשבור את קצה micropipette עם מחט 30-מד כדי לפתוח את הקצה. לאחר המרדים את העכברים היילודים, לקעקע את רפידות כף רגליהם עם דיו קעקוע באמצעות מחט 30-מד כדי לזהות את החיות.לאסוף גזירי זנב לבידוד DNA ו genotyping. ספוגית העור מעל העיניים עם 70% אתנול. השתמש במחט 30 מד כדי לפתוח את העפעף המותך תוך הפעלת לחץ אור עם האצבעות כדי לפתוח את העין.לתקוע חור קטן דרך הקרנית בצומת sclera הקרנית. הכנס את micropipette הזכוכית לתוך החור ולחץ על דוושת רגל מזרק מיקרו פעמיים עד ארבע פעמים כדי להזריק את AAV לתוך החלל התוך-צדדי. הסר באיטיות את המיקרופיפט ואשר הזרקת AAV על ידי הדמיית הצבע הכחול באישון.לאחר הכנת רשתית aCSF כמתואר בכתב היד טקסט, לחמצן את רשתית aCSF על ידי מבעבע עם קרבוגן לפחות 15 דקות, ולאחר מכן להתאים את ה- pH ל 7.4. הטמע צלחת פטרי בקוטר 60 מילימטר לתוך מגש קרח ומלא אותו עם aCSF רשתית מחומצנת. מניחים את צלחת הפטרי הממולאת מתחת למיקרוסקופ סטריאו.לאחר מכן, לחתוך את דש העפעף של העכבר המתת חסד כדי לחשוף את העין. השתמש מלקחיים קהים כדי enucleate העיניים ולהעביר אותם לתוך רשתית קרה aCSF להציב מתחת למיקרוסקופ סטריאו. תחת מיקרוסקופ הסטריאו, לייצב את העין על ידי הידוק עצב הראייה באמצעות Dumont מספר חמש מלקחיים ולדקור חור במרכז הקרנית עם מחט 30 מד, ולאחר מכן להכניס קצה אחד של מספריים מיקרו לתוך החור כדי לבצע חתך מהחור עד סוף הקרנית.חוזרים על הפעולה כדי ליצור ארבע פרוסות בכיוונים הקרדינליים, ויוצרים ארבעה מדפים. אוחזים ומפרקים את שני המדפים הסמוכים, מקלפים בעדינות את הסקלרה מהרשתית עבור כל מדפים הקרנית. לאחר מכן להסיר את העדשה מכוס הרשתית באמצעות מלקחיים.לבסוף, השתמש במספריים מיקרו כדי לבצע ארבעה חתכים רדיאליים מקצה הרשתית לכיוון עצב הראייה, יצירת ארבעה עלי כותרת שווים. אם אתם משתמשים במסנני קרום MCE אפורים בקוטר גדול להרכבה, חתכו את הדיסק לרביעים שרוחבם בערך סנטימטר אחד, ולאחר מכן הניחו את דיסק ה-MCE על מרכז נייר סינון לבן גדול יותר. בעזרת שתי מברשות צבע בגודל שלוש על אפס, הפוך רשתית אחת על מברשת צבע עם צד תא גנגליון הרשתית כלפי מטה.הרם בעדינות את הרשתית מתוך ה- ACSF, וודא שמתח המים אינו קורע את הרשתית. בעודם מחזיקים את מברשת הצבע עם הרשתית, הזיזו את צלחת הפטרי המכילה ACSF מהדרך והניחו את נייר הסינון הלבן עם קרום ה- MCE מתחת לסטריאוסקופ. באמצעות פיפטת העברה, מקם טיפה של aCSF במרכז נייר הסינון של MCE.צף את הרשתית לתוך טיפת aCSF שנוצרה על ידי מתח פני השטח וטעון MCE קרום. השתמש מברשות צבע כדי למקם את הרשתית בתוך טיפה עם צד תא גנגליון רשתית למעלה, ולאחר מכן לפתוח את ארבעת עלי הכותרת. לאחר מיקום, ליצור גשר מים בין מברשת צבע ונייר סינון לבן כדי לשבור את מתח פני השטח של טיפה.להרכיב את תא הדגירה הדמיה חיה ולמלא אותו עם ACSF מחומצן. הפעל את משאבת בקר הטמפרטורה, לוודא כי הטמפרטורה אינה עולה מעל 34 מעלות צלזיוס. זה יכול לקחת עד שעה לטמפרטורת התא להתייצב.מומלץ להקים את תא הדגירה לפני תחילת ניתוח הרשתית. טמפרטורת תא יציבה מסייעת להפחית את הסחף לדוגמה. כדי להעביר את התל השטוח ברשתית לתא הזלוף, לעצור את המשאבה ולהסיר את aCSF כי הוא בתא.לאחר מכן הנח את דיסק MCE עם הרכבה שטוחה ברשתית לתוך תא הדגירה. הרטיבו מראש משקל מדגם כדי לשבור את מתח פני השטח, ולאחר מכן הניחו אותו על ההרכבה השטוחה כדי להבטיח שמשקל הדגימה יונח על נייר ה- MCE כדי להפחית את הסחף לדוגמה. מלאו מחדש את התא ב-ACSF המחומם והפיצו את ה-ACSF במהירות של כמיליליטר לדקה.מקם את האף עם המטרה 25 פעמים טבילת מים לתוך חדר ההדמיה. מסך עבור תאים מסומנים בעלי תווית של עניין באמצעות אור epifluorescent, ולהתאים את עוצמת ההדמיה כדי ללכוד תכונות דנדריטיות של עניין. באמצעות טבלת בדיקת מידע המזהה הן פיקסלים רוויים יתר על המידה והן פיקסלים לא רוויים, התאם את עוצמת הלייזר כך שלא יהיו פיקסלים רוויים יתר על המידה.רכשו את נפח ההדמיה התלת-ממדית וחזרו על הרכישה בקצב הפריימים הרצוי. ניתן לכוונן את נפח ההדמיה בין כל נקודת זמן כדי לפצות על סחף לדוגמה. יבא את סדרת התמונות, תוך פיצול התמונות לפי זמן.שמור את כל נקודות הזמן באופן ידני או על-ידי הפעלת תוסף מאקרו. צור פונקציית התפשטות נקודה תיאורטית באמצעות תוסף ImageJ על-ידי לחיצה על Defraction PSF 3D, צמצם מספרי של עדשה, אורך גל של פליטת פלואורופור, גודל פיקסלים ומרווח Z נדרשים כדי ליצור PSF מדויק. בחר תוספים, פקודות מאקרו ופעל כדי לבצע פירוק איטרטיבי מקביל של אצווה עבור כל נקודות הזמן באמצעות המאקרו שסופק.יבא את כל נקודות הזמן המנותקות כערימה על-ידי לחיצה על קובץ, ייבוא ולאחר מכן רצף תמונות. המר את הערימה לערימת יתר על-ידי לחיצה על תמונה, ערימות יתר ולאחר מכן ערימות לערימת יתר. הוסיפו את מספר פרוסות Z ומסגרות הזמן, ולאחר מכן תקןו את הסחף התלת-ממדי באמצעות תוסף הסחף התלת-ממדי הנכון.שמור את ערימת העל המתוקנת של הסחף התלת-ממדי והמרה את התמונה בחזרה לערימה רגילה על-ידי לחיצה על תמונה, ערימות-על, ערימות יתר, ערימות, ערימות, ערימות וערימות מפצל. כדי שמספר ערמות המשנה שיש לפצל, הזן את מספר נקודות הזמן. השתמש בעיבוד אצווה כדי ליצור הקרנה מרבית עבור כל נקודות הזמן.יבא את רצף התמונה לשגות זמן על-ידי לחיצה על קובץ, ייבוא ולאחר מכן רצף תמונות. ולהשתמש בכלי ImageJ קונבנציונליים לניתוח הרצוי של וידאו דו מימדי מפורק ופוסט מעובד, וידאו 3D ברזולוציה גבוהה של דנדריטים תא starburst פיתוח נרכש, טוהר, ותוקן עבור סחיפה 3D. תחזיות מקסימליות של מטוס Z הופקו כדי ליצור קטעי וידאו דו-ממדיים לניתוח, המציגים אזור של עידון דנדריטי ואזור של צמיחה דנדריטית.3D deconvolution של כל נקודת זמן הגדיל את הרזולוציה של תחזיות פילופודיה בסדר של תא amacrine כוכב P6 יחיד לפני ואחרי deconvolution עם ImageJ. תקופות זיהום AAV ממושכות לא בהכרח להוביל אות פלואורסצנטי מוגבר כפי שמוצג על ידי רמות דומות של ביטוי חלבון בחמישה ו 11 ימים לאחר ההזרקה. הפחתת הסחף מדגם במהלך הדמיה חשובה.סחיפה ממוזערת על ידי שמירה על טמפרטורת הדמיה עקבית ועל ידי מיקום הולם של המשקל על המדגם. אם מתרחשת דריפט, רכישה ידנית של סדרת הזמן מאפשרת התאמה של אמצעי האחסון להדמיה בין מסגרות. פעולה זו מבטיחה את התכונות של עניין להישאר במסגרת.פרוטוקול זה מייצר קטעי וידאו תלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה, פירוק ותיקון נסחף של נוריטים מתפתחים. קטעי וידאו כאלה מובילים להבנה טובה יותר של חיווט נוירונים ונדרשים לקדם שיטות ניתוח חישוביות של מורפוגנזה 3D. תוכנות מעקב ומעקב אוטומטיות טובות יותר נדרשות כדי להשיג ניתוח תפוקה גבוהה של פיתוח neurite.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

הזרקה תוך גולגולתי של Adeno הקשורים וקטורים ויראליים

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

חיתוך רוחב עצב מוטורי וזמן לשגות הדמיה של התנהגויות תא גלייה בדג הזברה לחיות

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subnial Adeno הקשורים וירוסים 9 (AAV9) וקטור משלוח ב עכברים למבוגרים

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

שיטות וטיפים על עירוי לוריד של Adeno-הקשורים וירוס חולדות והערכה של מערכת העצבים המרכזית התמרה חושית

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

ויזואליזציה והדמיה בשידור חי של Organelles אוליגודנדרוציטים בפרוסות Organotypic המוח באמצעות וירוס Adeno-הקשורים ומיקרוסקופיה קונפוקלית

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

ניתוח כמותי של Arborization דנדריטים עצביים מורכבות בדרוזופילה

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...