Name: time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

हम मैडिसन ग्रे को मुझे एक हाथ देने के लिए धन्यवाद देते हैं जब मेरे पास कोई नहीं था। इस शोध को एक NSERC डिस्कवरी ग्रांट (RGPIN-2016-06128), न्यूरोसाइंस में एक स्लोन फैलोशिप और कनाडा रिसर्च चेयर टियर 2 (जेएलएल के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था। एस इंग-एस्टेव्स को विजन साइंस रिसर्च प्रोग्राम और एनएसईआरसी स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति-डॉक्टरेट द्वारा समर्थित किया गया था।

नोट: यह प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक दिनों (चित्रा 1A) के बीच वायरल ट्रांसडक्शन के लिए 4-5 दिनों की न्यूनतम अवधि के साथ 2 दिनों तक फैला हुआ है। पशु प्रयोगों को बीमार बच्चों के लिए अस्पताल (टोरंटो, कनाडा) ?...

यह वीडियो एक प्रयोगात्मक पाइपलाइन को दर्शाता है जो मौजूदा आनुवंशिक उपकरणों का उपयोग कॉन्फोकल लाइव-इमेजिंग के साथ रेटिना न्यूरॉन्स के विकास की डेंड्राइट गतिशीलता की छवि के लिए करता है। इसके अलावा प्र...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45185-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45186-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HABG01 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 50 &#215; 15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470313-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene disposable transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tip paint brush, size 3/0</td>
			<td>Conventional art supply store</td>
			<td></td>
			<td>Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-imaging incubation system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber polyethylene tubing, PE-160 10&#39;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel heater controller, Model TC-344C</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater controller cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CC-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large bath incubation chamber with slice support</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample anchor (Harps)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0260</td>
			<td>Sample anchor must be compatible with incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sloflo In-line Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Microliter Syringe Series 700, Removable Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)&#160;</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2453</td>
			<td>Addgene Plasmid #45185&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 
			1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2454</td>
			<td>Addgene Plasmid #45186</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF Dye content &#8805;85 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tattoo paste</td>
			<td>Ketchum MFG Co</td>
			<td>329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>PV-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>Supplier may vary depending on region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH35317.604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>Open source</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations

तंत्र की खोज करना जो डेंड्राइटिक आर्बर्स को पैटर्न करता है, विकास के दौरान डेंड्राइट्स को विज़ुअलाइज़ करने, छवि बनाने और विश्लेषण करने के तरीकों की आवश्यकता होती है। माउस रेटिना न्यूरोनल मॉर्फोजेनेसिस और कनेक्टिविटी के सेल प्रकार-विशिष्ट तंत्र की जांच के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है। रेटिना उपप्रकारों का संगठन और संरचना अच्छी तरह से परिभाषित है, और विकास के दौरान विशिष्ट प्रकारों तक पहुंचने के लिए आनुवंशिक उपकरण उपलब्ध हैं। कई रेटिना सेल प्रकार भी अपने डेंड्राइट्स और / या अक्षतंतुओं को संकीर्ण परतों तक सीमित करते हैं, जो समय-अंतराल इमेजिंग की सुविधा प्रदान करता है। माउस रेटिना स्पष्टीकरण संस्कृतियों को confocal या multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर लाइव सेल इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित कर रहे हैं, लेकिन अस्थायी और संरचनात्मक संकल्प के साथ इमेजिंग डेंड्राइट गतिशीलता के लिए अनुकूलित तरीकों की कमी है। यहां प्रस्तुत किया गया क्रे-लोक्स सिस्टम द्वारा चिह्नित विशिष्ट रेटिना आबादी के विकास को विरल रूप से लेबल और छवि बनाने की एक विधि है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) यहां उपयोग किए जाते हैं, जो झिल्ली-लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन को क्रे-निर्भर तरीके से व्यक्त करते हैं। नवजात चूहों में एएवी की इंट्राओकुलर डिलीवरी 4-5 दिनों के बाद इंजेक्शन (डीपीआई) द्वारा लक्षित सेल प्रकारों के फ्लोरोसेंट लेबलिंग का उत्पादन करती है। झिल्ली फ्लोरोसेंट सिग्नल confocal इमेजिंग द्वारा पता लगाने योग्य हैं और ठीक शाखा संरचनाओं और गतिशीलता को हल करते हैं। 2-4 घंटे तक फैले उच्च गुणवत्ता वाले वीडियो को इमेजिंग रेटिना फ्लैट-माउंट से प्राप्त किया जाता है जो ऑक्सीजन युक्त कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ) के साथ फैलता है। इसके अलावा प्रदान की गई deconvolution और तीन आयामी (3 डी) बहाव सुधार के लिए एक छवि postprocessing पाइपलाइन है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग बरकरार रेटिना में कई सेलुलर व्यवहारों को कैप्चर करने और न्यूराइट मॉर्फोजेनेसिस को नियंत्रित करने वाले उपन्यास कारकों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। रेटिना में सीखी गई कई विकासात्मक रणनीतियां केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में कहीं और तंत्रिका सर्किट के गठन को समझने के लिए प्रासंगिक होंगी।

उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, स्टारबर्स्ट सेल डेंड्राइट्स के विकास का एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी वीडियो अधिग्रहित किया गया था, विघटित किया गया था, और 3 डी बहाव के लिए सही किया गया था। Z-plane अधिकतम अनुम?...

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Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

यहां, हम प्रसवोत्तर माउस रेटिना में न्यूराइट मॉर्फोजेनेसिस की जांच के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो समय-अंतराल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा स्पष्टीकरण देता है। हम रेटिना सेल प्रकारों के विरल लेबलिंग और अधिग्रहण के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं और पुनः संयोजक एडेनो-संबद्ध वायरस वैक्टर का उपयोग करके उनकी ठीक प्रक्रियाएं जो झिल्ली-लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन को क्रे-निर्भर तरीके से व्यक्त करती हैं।

आनुवंशिक रूप से लक्षित रेटिना सेल आबादी के विरल एडेनो-एसोसिएटेड वायरस लेबलिंग का उपयोग करके न्यूरोनल आर्बराइजेशन का टाइम-लैप्स इमेजिंग

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

एडिनो - जुड़े वायरल vectors के intracranial इंजेक्शन

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

प्रसव के बाद मस्तिष्क में एक उच्च संकल्प Neuronal प्रवासन के समय चूक इमेजिंग के लिए Organotypic स्लाइस परख

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

इमेजिंग Neuronal प्रतिक्रियाएँ vomeronasal अंग के स्लाइस की तैयारी में एक आनुवंशिक एन्कोडेड कैल्शियम सेंसर व्यक्त

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

वयस्क माउस अग्रमस्तिष्क के तीव्र स्लाइस में समय चूक Neuroblast प्रवासन की इमेजिंग

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

मोटर तंत्रिका transection और लाइव Zebrafish में Glial सेल व्यवहार के समय चूक इमेजिंग

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

माउस Cochlear explants की लंबी अवधि के समय चूक इमेजिंग

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

उपशोषक एडोनो-संबंधित वायरस 9 (एएवी 9) वयस्क चूहे में वेक्टर डिलिवरी

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Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

तरीकों और Adeno के नसों में प्रशासन के लिए युक्तियां-चूहों और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र Transduction के मूल्यांकन से जुड़े वायरस

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Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

दृश्य और Organotypic मस्तिष्क Adeno-जुड़े वायरस और फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग स्लाइस में Oligodendrocyte Organelles के लाइव इमेजिंग

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

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Drosophila में न्यूरॉनी वृक्ष Arborization जटिलता का मात्रात्मक विश्लेषण

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...