Name: time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Ringraziamo Madison Gray per avermi dato una mano quando non ne avevo. Questa ricerca è stata supportata da un NSERC Discovery Grant (RGPIN-2016-06128), una Sloan Fellowship in Neuroscience e una Canada Research Chair Tier 2 (a J.L.L). S. Ing-Esteves è stato supportato dal Vision Science Research Program e dal NSERC Postgraduate Scholarships-Doctorals.

NOTA: Questo protocollo si estende su 2 giorni con un periodo minimo di 4-5 giorni per la trasduzione virale tra i giorni sperimentali (Figura 1A). Gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care per l'uso degli animali nella ricerca e nella cura degli animali da laboratorio secondo protocolli approvati dal Laboratory of Animal Services Animal Use and Care Committee presso l'Hospital for Sick Children (Toronto, Canada)....

Questo video dimostra una pipeline sperimentale che utilizza gli strumenti genetici esistenti per visualizzare le dinamiche dendrite dello sviluppo di neuroni retinici con imaging vivo confocale. Sono state dimostrate anche iniezioni intraoculari di AAV Cre-dipendenti che codificano proteine fluorescenti mirate alla membrana nei topi neonatali. Le singole cellule di popolazioni geneticamente mirate sono marcate brillantemente già a 4-5 dpi. I supporti piatti retinici sono stati preparati per le camere di imaging standar...

I dendriti dei neuroni retinici formano schemi intricati, ma specifici, che influenzano la loro funzione all'interno dei circuiti neurali. Nella retina dei vertebrati, diversi tipi di cellule gangliari retiniche (RGC) e interneuroni a cellule amacrine portano morfologie dendritiche uniche che differiscono per dimensioni del pergolato, posizione, lunghezza del ramo e densità1. Durante lo sviluppo postnatale, gli RGC e le cellule amacrine estendono i processi dendritici esuberanti in un neuropil chiamato strato plessiforme interno (IPL), dove ricevono input di cellule bipolari che trasmettono segnali fotorecettori2. Come catturato dall'imaging time-lapse di popolazioni retiniche marcate fluorescentemente in larve di pulcino o zebrafish, la morfogenesi dei dendrite è altamente dinamica3,4,5. In pochi giorni, i pergole dendritiche si espandono, rimodellano e si ramificano in stretti sottostrati dell'IPL, dove si sinapsino con partner selezionati. I pergole mostrano diverse dinamiche strutturali rispetto allo sviluppo, con cambiamenti nei tassi relativi di aggiunta di rami, retrazione e stabilizzazione. I dendriti di amacrina e RGC mostrano anche diversi comportamenti di crescita e rimodellamento che potrebbero riflettere l'arborizzazione specifica del tipo. Tuttavia, questi studi hanno monitorato ampie popolazioni di amacrine o RGC e si sono concentrati sul targeting laminare, che è solo un aspetto della morfologia.
I meccanismi che producono la vasta diversità morfologica osservata tra i sottotipi di retina sono poco conosciuti. L'obiettivo di questo gruppo era quello di sviluppare un metodo per catturare la dinamica dei dendriti e il rimodellamento del pergolato di sottotipi retinici definiti nei topi. L'identificazione dei meccanismi specifici del tipo di cellula del pattern dendrite richiede metodi per visualizzare e misurare i comportamenti dei dendrite delle cellule di interesse. Le colture organotipiche di retine di topo sono adatte per studi di imaging di cellule vive utilizzando la microscopia confocale o multifotonica. Le retine in via di sviluppo vengono sezionate e montate in un impianto piatto che può essere ripreso per diverse ore in una camera di registrazione o coltivato in pochi giorni con effetti limitati sul circuito6,7. I neuroni retinici vivi possono essere etichettati con una varietà di tecniche, tra cui il riempimento del colorante mediante elettrodi, l'elettroporazione, la somministrazione biolistica di particelle rivestite con coloranti lipofili o plasmidi che codificano proteine fluorescenti (ad esempio, Gene Gun), nonché etichette cellulari geneticamente codificate7,8,9,10 . Tuttavia, questi approcci sono inefficienti per l'imaging della dinamica dei dendriti di specifici sottotipi di retina. Ad esempio, i metodi di riempimento dei coloranti sono a bassa produttività e richiedono apparecchiature di elettrofisiologia ed etichette genetiche aggiuntive per indirizzare in modo affidabile le cellule di interesse. Inoltre, i forti segnali di fluorescenza nel soma possono oscurare i dendriti vicini.
I metodi di consegna dei geni biolistici possono etichettare simultaneamente dozzine di cellule, ma i passaggi che coinvolgono la consegna di particelle ad alta pressione e l'incubazione notturna della retina isolata possono compromettere la fisiologia cellulare e la crescita dendritica. Questo documento propone che i recenti strumenti genetici possano essere impiegati per catturare le prime dinamiche dei dendriti con il tipo di cellula e la risoluzione strutturale, dati i seguenti criteri sperimentali. In primo luogo, per risolvere i rami sottili e i filopodi che dominano i pergolati in via di sviluppo, il metodo dovrebbe etichettare i neuroni con proteine luminose e fluorescenti che riempiono i processi nell'intero pergolato. L'etichettatura a fluorescenza non deve sbiadire a causa del fotosbiancamento durante il periodo di imaging. È stata generata una varietà di varianti proteiche fluorescenti e confrontate per l'idoneità per l'imaging in vivo/ex vivo11 in base alla luminosità e alla fotostabilità. In secondo luogo, le proteine fluorescenti (XFP) devono essere espresse a livelli sufficientemente elevati dal primo stadio della morfogenesi della dendrite, in modo che non si perda la stretta finestra di sviluppo. Nelle analisi dei timepoint statici nella retina del topo, lo sviluppo di dendrite avviene durante la prima settimana postnatale e comprende fasi di crescita, rimodellamento e stabilizzazione10,12,13,14,15. In terzo luogo, il metodo dovrebbe portare a un'etichettatura selettiva o ad una maggiore probabilità di etichettatura della sottopopolazione neuronale di interesse. In quarto luogo, l'etichettatura della sottopopolazione bersaglio deve essere sufficientemente scarsa in modo che l'intero pergolato neuronale possa essere identificato e rintracciato. Sebbene i sottotipi di RGC e amacrina possano essere distinti per le loro caratteristiche morfologiche mature e i modelli di stratificazione IPL16,17,18,19,20, la sfida è identificare i sottotipi durante lo sviluppo basati su strutture immature. Questo compito è facilitato dall'espansione di strumenti transgenici per etichettare specifici tipi di cellule retiniche durante lo sviluppo.
Le linee di topo transgeniche e knock-in in cui l'espressione cellulare e temporale di proteine fluorescenti o Cre è determinata da elementi regolatori genici sono ampiamente utilizzate per studiare i tipi di cellule retiniche13,21,22,23. Osservazioni chiave sui modelli specifici del sottotipo di sviluppo di dendrite provengono da studi su retine di topi transgenici a timepoint statici10,14,24,25. Il sistema Cre-Lox, in particolare, consente una squisita manipolazione genica e il monitoraggio dei sottotipi utilizzando una varietà di reporter, sensori e attivatori optogenetici dipendenti dalla ricombinasi. Questi strumenti hanno portato alla scoperta di programmi molecolari specifici del sottotipo e proprietà funzionali che sono alla base dell'assemblaggio del circuito retinico26,27,28,29,30. Tuttavia, devono ancora essere sfruttati per studiare la dinamica dei dendriti specifici del sottotipo nella retina del topo. L'etichettatura a bassa densità può essere ottenuta combinando le linee di topo Cre con i transgeni introdotti dall'elettroporazione o dagli AAV ricombinanti. Se disponibili, possono essere utilizzate anche linee Cre inducibili dal tamoxifene o strategie genetiche intersezionali. Infine, la cellula deve essere marcata in modo minimamente invasivo e fotografata utilizzando parametri di acquisizione in modo da non compromettere il tessuto o interferire con la funzione cellulare richiesta per la morfogenesi dei dendriti.
Qui viene presentato un metodo per applicare strumenti transgenici e microscopia confocale per studiare la dinamica dei dendriti negli espianti retinici di topo vivo. Le linee di topo transgenico Cre sono state combinate con vettori AAV che esprimono proteine fluorescenti sulla ricombinazione cre, che consente l'etichettatura sparsa delle cellule retiniche di interesse. Gli AAV disponibili in commercio vengono consegnati alla retina neonatale mediante iniezioni intravitreali. Questo documento dimostra che gli AAV producono un'espressione fluorescente significativamente elevata e specifica del tipo di cellula di 4 dpi, consentendo l'accesso ai punti temporali postnatali. Per illustrare questo approccio, l'interneurone colinergico "starburst" amacrina è stato etichettato consegnando Brainbow AAV in topi neonatali che esprimono il sito di ingresso del ribosoma interno alla colina acetilsi (ChAT) (IRES)-Cre transgene, che è attivo nella retina postnatale precoce31,32. Le cellule amacrine Starburst sviluppano una morfologia stereotipata e radiale del pergolato che è modellata dall'auto-evitamento della dendrite mediata dalle protocadherine raggruppate33,34. Questo documento mostra che la risoluzione dei dendriti starburst e dei filopodi è significativamente migliorata dagli XFP alla membrana plasmatica con l'aggiunta del motivo CAAX che subisce la farnesilazione, come usato per gli AAV Brainbow31. Infine, sono stati determinati protocolli di imaging e post-elaborazione time-lapse che producono immagini di alta qualità suscettibili di ricostruzione di dendrite e quantificazione morfometrica. Questo protocollo può essere utilizzato per identificare i fattori che controllano la morfogenesi dei dendriti e per catturare diversi comportamenti cellulari nella retina intatta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45185-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45186-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HABG01 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 50 &#215; 15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470313-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene disposable transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tip paint brush, size 3/0</td>
			<td>Conventional art supply store</td>
			<td></td>
			<td>Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-imaging incubation system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber polyethylene tubing, PE-160 10&#39;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel heater controller, Model TC-344C</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater controller cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CC-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large bath incubation chamber with slice support</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample anchor (Harps)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0260</td>
			<td>Sample anchor must be compatible with incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sloflo In-line Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Microliter Syringe Series 700, Removable Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)&#160;</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2453</td>
			<td>Addgene Plasmid #45185&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 
			1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2454</td>
			<td>Addgene Plasmid #45186</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF Dye content &#8805;85 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tattoo paste</td>
			<td>Ketchum MFG Co</td>
			<td>329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>PV-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>Supplier may vary depending on region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH35317.604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>Open source</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations

La scoperta di meccanismi che modellano i pergole dendritiche richiede metodi per visualizzare, immaginare e analizzare i dendriti durante lo sviluppo. La retina del topo è un potente sistema modello per lo studio dei meccanismi specifici del tipo cellulare della morfogenesi neuronale e della connettività. L'organizzazione e la composizione dei sottotipi di retina sono ben definite e sono disponibili strumenti genetici per accedere a tipi specifici durante lo sviluppo. Molti tipi di cellule retiniche vincolano anche i loro dendriti e / o assoni a strati stretti, il che facilita l'imaging time-lapse. Le colture di espianto della retina del topo sono adatte per l'imaging di cellule vive utilizzando la microscopia confocale o multifotonica, ma mancano metodi ottimizzati per l'imaging della dinamica della dendrite con risoluzione temporale e strutturale. Qui viene presentato un metodo per etichettare e visualizzare scarsamente lo sviluppo di specifiche popolazioni retiniche caratterizzate dal sistema Cre-Lox. I virus adeno-associati disponibili in commercio (AAV) qui utilizzati hanno espresso proteine fluorescenti mirate alla membrana in modo Cre-dipendente. La somministrazione intraoculare di AAV nei topi neonatali produce l'etichettatura fluorescente dei tipi di cellule mirate entro 4-5 giorni dall'iniezione (dpi). I segnali fluorescenti a membrana sono rilevabili mediante imaging confocale e risolvono strutture e dinamiche di rami fini. Video di alta qualità della durata di 2-4 ore vengono acquisiti dall'imaging di supporti piatti retinici perfusi con liquido cerebrospinale artificiale ossigenato (aCSF). Viene inoltre fornita una pipeline di post-elaborazione delle immagini per la deconvoluzione e la correzione tridimensionale (3D) della deriva. Questo protocollo può essere utilizzato per catturare diversi comportamenti cellulari nella retina intatta e per identificare nuovi fattori che controllano la morfogenesi dei neuriti. Molte strategie di sviluppo apprese nella retina saranno rilevanti per comprendere la formazione di circuiti neurali altrove nel sistema nervoso centrale.

Utilizzando il protocollo di cui sopra, è stato acquisito, deconvoluto e corretto un video 3D ad alta risoluzione dello sviluppo di dendriti di cellule starburst. Sono state prodotte proiezioni massime del piano Z per realizzare video 2D per l'analisi (Video supplementare 1, Figura 5A). La deconvoluzione 3D di ogni punto temporale ha aumentato la risoluzione delle proiezioni di filopodi fini (Figura 5B, C). Le protrusioni sotti...

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Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Qui, presentiamo un metodo per studiare la morfogenesi dei neuriti negli espianti retinici postnatali di topo mediante microscopia confocale time-lapse. Descriviamo un approccio per l'etichettatura sparsa e l'acquisizione di tipi di cellule retiniche e dei loro processi fini utilizzando vettori virali adeno-associati ricombinanti che esprimono proteine fluorescenti mirate alla membrana in modo Cre-dipendente.

Imaging time-lapse dell'arborizzazione neuronale utilizzando l'etichettatura del virus adeno-associato sparso di popolazioni di cellule retiniche geneticamente mirate

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

L'etichettatura e la visualizzazione di singole cellule di pergole dendritiche o assonali sono necessarie per studiare la morfogenesi neuronale. Etichettando i pergolati in via di sviluppo in modo minimamente invasivo, il tessuto retinico rimane sano e adatto per l'imaging dal vivo confocale prolungato. Il vantaggio principale di questo metodo è la capacità di visualizzare singoli pergole con proteine fluorescenti multicolore entro quattro giorni dall'iniezione.Ciò rende possibile lo studio delle morfologie del pergolato neonatale. Questo protocollo di imaging e analisi di iniezione può essere utilizzato per studiare le morfologie neuronali in tutto il sistema nervoso centrale. La selezione Cre appropriata e la posizione di iniezione devono essere determinate per indirizzare la popolazione cellulare di interesse.Iniziare selezionando una linea di topo Cre per etichettare le popolazioni di cellule retiniche di interesse. Ottenere il virus AAV ricombinasi-dipendente che codifica per proteine fluorescenti. Per un'etichettatura ottimale dei processi fini, selezionare vettori che esprimono proteine fluorescenti modificate che prendono di mira la membrana plasmatica.Per l'aliquota AAV su ghiaccio, e preparare una diluizione da uno a quattro AAV usando soluzione salina sterile o PBS. Per visualizzare le iniezioni, colorare la soluzione di blu aggiungendo circa un microlitro di soluzione colorante Fast Green FCF allo 0,02% per ogni 15 microlitri di diluizione AAV. Sterilizzare l'area di iniezione con etanolo al 70%.Riempire la micropipetta con la diluizione AAV utilizzando una microsiringa. Sotto uno stereomicroscopio, rompere la punta della micropipetta con un ago calibro 30 per aprire il sigillo alla punta. Dopo aver anestetizzato i topi neonatali, tatuare le zampe con inchiostro per tatuaggi usando un ago calibro 30 per identificare gli animali.Raccogli ritagli di coda per l'isolamento e la genotipizzazione del DNA. Tamponare la pelle sovrastante gli occhi con il 70% di etanolo. Utilizzare un ago da 30 gauge per aprire la palpebra fusa mentre si applica una leggera pressione con le dita per aprire l'occhio.Fai un piccolo foro attraverso la cornea alla giunzione della sclera corneale. Inserire la micropipetta di vetro nel foro e premere il pedale del micro iniettore due o quattro volte per iniettare l'AAV nello spazio intravitreale. Rimuovere lentamente la micropipetta e confermare l'iniezione di AAV visualizzando il colorante blu nella pupilla.Dopo aver preparato l'aCSF retinico come descritto nel manoscritto di testo, ossigenare l'aCSF retinico gorgogliando con carbogeno per un minimo di 15 minuti, quindi regolare il pH a 7,4. Incorporare una capsula di Petri di 60 millimetri di diametro in un vassoio del ghiaccio e riempirla con aCSF retinico ossigenato. Posizionare la capsula di Petri riempita sotto uno stereomicroscopio.Quindi, tagliare il lembo palpebrale del topo eutanasizzato per esporre l'occhio. Utilizzare pinze smussate per enucleare gli occhi e trasferirli nell'aCSF retinico freddo posto sotto lo stereomicroscopio. Sotto lo stereomicroscopio, stabilizzare l'occhio stringendo il nervo ottico usando la pinza numero cinque di Dumont e praticare un foro al centro della cornea con un ago di calibro 30, quindi inserire una punta delle micro forbici nel foro per fare un'incisione dal foro alla fine della cornea.Ripetete per creare quattro fette nelle direzioni cardinali, creando quattro lembi. Afferrare e tirare i due lembi adiacenti, staccando delicatamente la sclera dalla retina per tutti i lembi della cornea. Quindi rimuovere la lente dalla coppa retinica usando la pinza.Infine, utilizzare micro forbici per eseguire quattro incisioni radiali dal bordo della retina verso il nervo ottico, creando quattro petali uguali. Se si utilizzano filtri a membrana MCE grigi di grande diametro per il montaggio, tagliare il disco in quadranti di circa un centimetro di diametro, quindi posizionare il disco MCE al centro di una carta da filtro bianca più grande. Usando due pennelli tre per zero, capovolgere una tazza retinica su un pennello con la cellula gangliare retinica rivolta verso il basso.Sollevare delicatamente la retina dall'aCSF, assicurandosi che la tensione dell'acqua non strappi la retina. Mentre si tiene ancora il pennello con la retina, spostare la capsula di Petri contenente aCSF e posizionare la carta da filtro bianca con la membrana MCE sotto lo stereoscopio. Utilizzando una pipetta di trasferimento, posizionare una goccia di aCSF al centro della carta da filtro MCE.Far fluttuare la retina nella goccia aCSF creata dalla tensione superficiale e dalla membrana MCE carica. Utilizzare pennelli per posizionare la retina all'interno della goccia con la cellula gangliare retinica rivolta verso l'alto, quindi aprire i quattro petali. Una volta posizionato, creare un ponte d'acqua tra il pennello e la carta da filtro bianca per rompere la tensione superficiale della goccia.Assemblare la camera di incubazione per immagini dal vivo e riempirla con aCSF ossigenato. Accendere la pompa e il regolatore di temperatura, assicurandosi che la temperatura non superi i 34 gradi Celsius. Può richiedere fino a un'ora per stabilizzare la temperatura della camera.Si consiglia di impostare la camera di incubazione prima di iniziare la dissezione retinica. La temperatura stabile della camera aiuta a ridurre la deriva del campione. Per trasferire il tumulo piatto retinico nella camera di perfusione, arrestare la pompa e rimuovere l'aCSF che si trova nella camera.Quindi posizionare il disco MCE con il supporto piatto retinico nella camera di incubazione. Pre-bagnare un peso del campione per rompere la tensione superficiale, quindi posizionarlo sul supporto piatto assicurando che il peso del campione sia posizionato sulla carta MCE per ridurre la deriva del campione. Riempire la camera con l'aCSF riscaldato e far circolare l'aCSF a circa un millilitro al minuto.Posizionare il nasello con l'obiettivo di immersione in acqua 25 volte nella camera di imaging. Scherma le cellule di interesse etichettate utilizzando la luce epifluorescente e regola il volume di imaging per catturare le caratteristiche dendritiche di interesse. Utilizzando una tabella di ricerca che identifica sia i pixel sovrasaturi che quelli sottosaturi, regolare la potenza del laser in modo che nessun pixel sia sovrasaturato.Acquisisci il volume di imaging 3D e ripeti l'acquisizione alla frequenza fotogrammi desiderata. Il volume di imaging può essere regolato tra ogni punto temporale per compensare la deriva del campione. Importare la serie di immagini, dividendo le immagini per tempo.Salva tutti i punti temporali manualmente o eseguendo un plug-in macro. Creare una funzione teorica di diffusione del punto utilizzando il plug-in ImageJ facendo clic su Deffrazione PSF 3D, l'apertura numerica dell'obiettivo, la lunghezza d'onda di emissione del fluoroforo, la dimensione dei pixel e la spaziatura Z sono necessarie per creare una PSF accurata. Selezionare plug-in, macro ed eseguire per eseguire la deconvoluzione iterativa parallela batch per tutti i punti temporali utilizzando la macro fornita.Importate tutti i punti temporali deconvoluti come stack facendo clic su file, importa, quindi su sequenza immagine. Convertire lo stack in un hyperstack facendo clic su image, hyperstacks, quindi stacks in hyperstack. Aggiungi il numero di Z-slice e intervalli di tempo, quindi correggi la deriva 3D utilizzando il plug-in 3D drift corretto.Salva l'hyperstack corretto con deriva 3D e riconverti l'immagine in uno stack normale facendo clic su image, hyperstacks, hyperstack to stack, quindi dividi i punti temporali facendo clic su image, stacks, tools e stacks splitter. Per il numero di sottostack da dividere, immettere il numero di punti temporali. Utilizzare l'elaborazione batch per creare una proiezione massima per tutti i punti temporali.Importare la sequenza di immagini time lapse facendo clic su file, importa, quindi sequenza di immagini. E utilizzare gli strumenti ImageJ convenzionali per l'analisi desiderata di video bidimensionali deconvoluti e post-elaborati, Un video 3D ad alta risoluzione dello sviluppo di dendriti di cellule starburst è stato acquisito, deconvolto e corretto per la deriva 3D. Sono state prodotte proiezioni massime del piano Z per realizzare video 2D per l'analisi, mostrando un'area di raffinamento dendritico e un'area di escrescenza dendritica.La deconvoluzione 3D di ogni punto temporale ha aumentato la risoluzione delle proiezioni di filopodi fini di una singola cellula amacrina starburst P6 prima e dopo la deconvoluzione con ImageJ. Periodi prolungati di infezione da AAV non portano necessariamente ad un aumento del segnale fluorescente, come dimostrato da livelli simili di espressione proteica a cinque e 11 giorni dopo l'iniezione. Ridurre la deriva del campione durante l'imaging è importante.La deriva è ridotta al minimo mantenendo una temperatura di imaging costante e posizionando in modo appropriato il peso sul campione. Se si verifica una deriva, l'acquisizione manuale delle serie temporali consente di regolare il volume dell'immagine tra i fotogrammi. Ciò garantisce che le caratteristiche di interesse rimangano nel frame.Questo protocollo produce video 3D ad alta risoluzione, deconvoluti e corretti alla deriva di neuriti in via di sviluppo. Tali video portano a una migliore comprensione del cablaggio dei neuroni e sono necessari per far progredire i metodi di analisi computazionale della morfogenesi 3D. Sono necessari migliori software di tracciamento e tracciamento automatici per ottenere un'analisi ad alto rendimento dello sviluppo di neuriti.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Iniezione intracranica di adeno-associato vettori virali

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Ricerca

Neuroscienze

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Le risposte di imaging neuronale in preparazione Fetta di organo vomeronasale Esprimere un sensore di calcio geneticamente codificato

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Nerve transezione e Time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo Zebrafish

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subito Adeno associato Virus 9 (AAV9) Consegna vettoriale nei topi adulti

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Metodi e consigli per la somministrazione endovenosa di Virus Adeno-associato ai ratti e valutazione di trasduzione del sistema nervoso centrale

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualizzazione e Live Imaging del Oligodendrocyte organelli in fettine di cervello Organotypic utilizzando Virus Adeno-associati e microscopia confocale

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Analisi quantitativa di un neurone Arborization dentritico complessità in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...