Name: time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

マディソン・グレイが、私が何も持っていなかったときに手を差し伸べてくれたことに感謝します。この研究は、NSERCディスカバリーグラント(RGPIN-2016-06128)、神経科学のスローンフェローシップ、カナダ研究委員長ティア2(J.L.L.)の支援を受けました。S. Ing-Estevesは、Vision Science Research ProgramとNSERC Postgraduate Scholarships-Doctoralの支援を受けました。

注:このプロトコルは2日間にわたり、実験日間のウイルス形質導入の最小期間は4〜5日間です(図1A)。動物実験は、病気の子供のための病院(トロント、カナダ)の動物サービス実験所動物の使用およびケア委員会によって承認されたプロトコルに基づいて、研究および実験動物ケアにおける動物の使用に関するカナダ動物ケアガイドライン評議会に従って行われます。
<...

このビデオは、既存の遺伝的ツールを利用して、共焦点ライブイメージングで網膜ニューロンを発達させる樹状突起ダイナミクスを画像化する実験パイプラインを示しています。また、膜標的蛍光タンパク質をコードするCre依存性AAVの新生児マウスへの眼内注射も実証されている。遺伝的に標的化された集団の単一細胞は、早くも4〜5dpiと明るく標識されている。網膜フラットマウントは、?...

網膜ニューロンの樹状突起は、神経回路内での機能に影響を与える複雑でありながら特異的なパターンを形成する。脊椎動物の網膜では、多様なタイプの網膜神経節細胞(RGC)とアマクリン細胞介在ニューロンが、樹木の大きさ、位置、枝長、密度が異なる独自の樹状突起形態を持っています1。出生後の発達中、RGCとアマクリン細胞は、熱狂的な樹状突起を内側プレキシフォーム層(IPL)と呼ばれるニューロピルに拡張し、そこでバイポーラ細胞入力を受け取り、光受容体シグナルを伝達します2。ヒナまたはゼブラフィッシュの幼虫における蛍光標識網膜集団のタイムラプス画像化によってキャプチャされるように、樹状突起形態形成は非常に動的である3,4,5。数日のうちに、樹状樹木はIPLの狭いサブレイヤーに拡大、改造、および影響し、そこで選択されたパートナーとシナプスします。樹木は、枝の追加、後退、および安定化の相対的な速度の変化を伴う、発達にわたって異なる構造ダイナミクスを示す。アマクリンおよびRGC樹状突起はまた、タイプ特異的樹木化を反映する可能性のある異なる外生およびリモデリング挙動を示す。しかし、これらの研究は、広範なアマクリンまたはRGC集団を追跡し、形態学の1つの側面にすぎない層状標的化に焦点を当てた。
網膜サブタイプ全体で観察された広大な形態学的多様性を生み出すメカニズムは、ほとんど理解されていない。このグループの目的は、マウスにおける定義された網膜サブタイプの樹状突起ダイナミクスおよび樹木リモデリングを捕捉する方法を開発することであった。樹状突起パターニングの細胞型特異的メカニズムを同定するには、目的の細胞の樹状突起挙動を視覚化および測定する方法が必要である。マウス網膜の有機型培養は、共焦点顕微鏡または多光子顕微鏡を用いた生細胞イメージング研究によく適している。発達中の網膜は解剖され、平坦な外植体に装着され、記録チャンバーで数時間画像化することも、回路への影響が限定的な状態で数日間にわたって培養することもできます6,7。生きた網膜ニューロンは、電極による色素充填、エレクトロポレーション、親油性色素でコーティングされた粒子のバイオリスト送達、蛍光タンパク質をコードするプラスミド(例えば、Gene Gun)、ならびに遺伝的にコードされた細胞標識7、8、9、10を含む様々な技術によって標識することができる7、8、9、10.しかし、これらのアプローチは、特定の網膜サブタイプの樹状突起ダイナミクスを画像化するのに非効率的である。例えば、色素充填法はスループットが低く、目的の細胞を確実に標的とするために電気生理学装置と追加の遺伝子標識が必要です。さらに、ソーマの強い蛍光シグナルは、近くの樹状突起を不明瞭にする可能性があります。
バイオリスティック遺伝子送達法は、数十個の細胞を同時に標識することができるが、高圧粒子送達および単離された網膜の一晩インキュベーションを含むステップは、細胞生理機能および樹状突起伸長を損なう可能性がある。本稿では、以下の実験基準により、初期の樹状突起ダイナミクスを細胞型と構造分解能で捉えるために、最近の遺伝的ツールを利用できることを提案している。まず、発達中の樹木園を支配する微細な枝および糸状体を解くために、この方法は、樹木全体のプロセスを満たす明るく蛍光タンパク質でニューロンを標識すべきである。蛍光標識は、イメージング期間中のフォトブリーチングのために退色してはならない。様々な蛍光タンパク質変異体が生成され、輝度と光安定性に基づいて、in vivo/ex vivoイメージング11への適合性について比較されています。第二に、蛍光タンパク質(XFP)は、狭い発生窓が見逃されないように、樹状突起形態形成の初期段階によって十分に高いレベルで発現されなければならない。マウス網膜の静的な時点の分析では、樹状突起の発生は出生後最初の週に起こり、外生、リモデリング、および安定化の段階を含む10,12,13,14,15。第3に、この方法は、選択的標識、または関心のあるニューロン亜集団の標識化の確率の増加につながるはずである。第四に、標的亜集団の標識は、ニューロンアーバー全体を同定および追跡できるように、十分に疎でなければならない。RGCおよびアマクリンサブタイプは、成熟した形態学的特徴およびIPL層別化パターン16,17,18,19,20によって区別することができるが、課題は未成熟構造に基づいて開発中にサブタイプを同定することである。この作業は、発生中に特定の網膜細胞型を標識するためのトランスジェニックツールの拡大によって促進される。
蛍光タンパク質またはCreの細胞的および時間的発現が遺伝子調節要素によって決定されるトランスジェニックおよびノックインマウス系統は、網膜細胞型を研究するために広く使用されている13,21,22,23。樹状突起発生のサブタイプ特異的パターンに関する主要な観察は、静的な時点におけるトランスジェニックマウス網膜の研究から来ている10,14,24,25。特にCre-Loxシステムは、さまざまなリコンビナーゼ依存性レポーター、センサー、および光遺伝学的アクチベーターを使用して、サブタイプの絶妙な遺伝子操作およびモニタリングを可能にします。これらのツールは、網膜回路アセンブリの根底にあるサブタイプ特異的分子プログラムと機能特性の発見をもたらしました26,27,28,29,30。しかし、マウス網膜におけるサブタイプ特異的樹状突起ダイナミクスの研究にはまだ活用されていない。低密度標識は、Creマウス系統とエレクトロポレーションまたは組換えAAVによって導入された導入遺伝子を組み合わせることによって達成することができる。利用可能な場合、タモキシフェン誘導性クレラインまたは交差遺伝子戦略も使用することができる。最後に、細胞は低侵襲の方法で標識され、組織を損なわないように、または樹状突起形態形成に必要な細胞機能を妨げないように、取得パラメータを使用して画像化されるべきである。
ここでは、生きたマウス網膜外植体における樹状突起ダイナミクスを調べるために、トランスジェニックツールおよび共焦点顕微鏡法を適用する方法を提示する。Creトランスジェニックマウス系統は、Cre組換え時に蛍光タンパク質を発現するAAVベクターと組み合わされており、これにより、目的の網膜細胞のまばらな標識が可能になる。市販のAAVは硝子体内注射によって新生児網膜に送達される。この論文は、AAVが4dpiで有意に高い細胞型特異的蛍光発現を産生し、出生後の時点へのアクセスを可能にすることを実証する。このアプローチを説明するために、コリン作動性「スターバースト」アマクリンインターニューロンを、出生後早期網膜で活性であるコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)-内部リボソーム侵入部位(IRES)-Cre導入遺伝子を発現する新生児マウスにおいてBrainbow AAVを送達することによって標識した31,32。スターバーストアマクリン細胞は、クラスター化されたプロトカドヘリンによって媒介される樹状突起自己回避によって形作られたステレオタイプ化された放射状のアーバー形態を発達させる33,34。本論文は、Brainbow AAVs31に用いられているように、ファルネシル化を受けるCAAXモチーフを添加することにより、原形質膜にXFPsによってスターバースト樹状突起と糸状体形成の分解能が有意に向上することを示している。最後に、デンドライト再構成および形態測定定量化に適した高品質の画像を生成するタイムラプスイメージングおよび後処理プロトコルが決定された。このプロトコルは、樹状突起の形態形成を制御する因子を同定し、無傷の網膜におけるいくつかの細胞挙動を捕捉するために使用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45185-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45186-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HABG01 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 50 &#215; 15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470313-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene disposable transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tip paint brush, size 3/0</td>
			<td>Conventional art supply store</td>
			<td></td>
			<td>Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-imaging incubation system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber polyethylene tubing, PE-160 10&#39;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel heater controller, Model TC-344C</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater controller cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CC-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large bath incubation chamber with slice support</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample anchor (Harps)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0260</td>
			<td>Sample anchor must be compatible with incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sloflo In-line Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Microliter Syringe Series 700, Removable Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)&#160;</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2453</td>
			<td>Addgene Plasmid #45185&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 
			1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2454</td>
			<td>Addgene Plasmid #45186</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF Dye content &#8805;85 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tattoo paste</td>
			<td>Ketchum MFG Co</td>
			<td>329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>PV-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>Supplier may vary depending on region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH35317.604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>Open source</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations

樹状樹木をパターン化するメカニズムを発見するには、開発中に樹状突起を視覚化、画像化、解析する方法が必要です。マウス網膜は、ニューロンの形態形成および接続性の細胞型特異的メカニズムの調査のための強力なモデルシステムである。網膜サブタイプの組織と構成は明確に定義されており、遺伝的ツールは開発中に特定のタイプにアクセスするために利用可能です。多くの網膜細胞タイプはまた、樹状突起および/または軸索を狭い層に拘束し、タイムラプスイメージングを容易にする。マウス網膜外植体培養は、共焦点顕微鏡または多光子顕微鏡を用いた生細胞イメージングには適しているが、樹状突起ダイナミクスを時間的および構造的分解能でイメージングするために最適化された方法は欠けている。ここで提示されるのは、Cre-Loxシステムによってマークされた特定の網膜集団の発達をまばらに標識し、画像化する方法です。ここで用いた市販のアデノ随伴ウイルス(AAV)は、膜標的蛍光タンパク質をCre依存的に発現させた。新生児マウスにおけるAAVの眼内送達は、注射後4〜5日(dpi)までに標的細胞型の蛍光標識を生じる。膜蛍光シグナルは共焦点イメージングによって検出可能であり、微細な分岐構造およびダイナミクスを分解する。2~4時間にわたる高品質のビデオは、酸素化人工脳脊髄液(aCSF)を灌流した画像網膜フラットマウントから取得されます。また、デコンボリューションと3次元(3D)ドリフト補正のための画像後処理パイプラインも提供されます。このプロトコルは、無傷の網膜におけるいくつかの細胞挙動を捕捉し、神経突起形態形成を制御する新規因子を同定するために使用することができる。網膜で学んだ多くの発達戦略は、中枢神経系の他の場所にある神経回路の形成を理解するのに適切であろう。

上記のプロトコルを使用して、スターバースト細胞樹状突起を発達させる高解像度の3Dビデオを取得し、デコンボリングし、3Dドリフトについて補正した。Z平面最大投影は、解析用の2Dビデオを作成するために作成されました(補足ビデオ1、 図5A)。各時点の3Dデコンボリューションは、微細な糸状突起の分解能を増加させた(図5B、...

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Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

ここでは、出生後のマウス網膜外植体における神経突起形態形成をタイムラプス共焦点顕微鏡により調べる方法を提示する。我々は、膜標的蛍光タンパク質を Cre依存的に発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた網膜細胞型の疎標識および取得およびそれらの微細プロセスのためのアプローチを説明する。

遺伝子標的網膜細胞集団のスパースアデノ随伴ウイルス標識を用いた神経樹木化のタイムラプスイメージング

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

樹状樹木または軸索樹木の単一細胞標識および可視化は、ニューロン形態形成を研究するために必要である。低侵襲の方法で発達中の樹木を標識することにより、網膜組織は健康を維持し、長期の共焦点ライブイメージングに適しています。この方法の主な利点は、注射後4日以内に多色蛍光タンパク質で個々の樹木を視覚化できることです。これにより、新生児の樹木の形態を研究することが可能になります。この注射イメージングおよび解析プロトコルは、中枢神経系全体のニューロン形態を研究するために使用することができる。適切なCre選択および注入場所は、目的の細胞集団を標的とするために決定されなければならない。まず、Creマウスラインを選択して、目的の網膜細胞集団を標識します。蛍光タンパク質をコードするリコンビナーゼ依存性AAVウイルスを取得する。微細プロセスの最適な標識のために、原形質膜を標的とする修飾蛍光タンパク質を発現するベクターを選択する。氷上のAAVアリコートについて、滅菌生理食塩水またはPBSを用いて1〜4個のAAV希釈液を調製した。注射を視覚化するには、15マイクロリットルのAAV希釈ごとに約1マイクロリットルの0.02%Fast Green FCF染料溶液を加えて、溶液を青色に着色します。注射領域を70%エタノールで滅菌する。マイクロシリンジを用いてAAV希釈液でマイクロピペットをバックフィルする。実体顕微鏡下で、マイクロピペットチップを30ゲージの針で破り、先端のシールを解除します。新生児マウスを麻酔した後、30ゲージの針を使用して足パッドにタトゥーインクを入れ墨し、動物を識別します。DNA単離とジェノタイピングのために尾の切り抜きを収集します。目の上にある皮膚を70%エタノールで拭きます。30ゲージの針を使用して融合したまぶたを開き、指で軽い圧力をかけて目を開きます。角膜強膜接合部の角膜に小さな穴をあけます。ガラス製マイクロピペットを穴に挿入し、マイクロインジェクターフットペダルを2~4回押して、AAVを硝子体内空間に注入します。マイクロピペットをゆっくりと取り出し、瞳孔内の青色色素を可視化してAAV注入を確認します。本文原稿に記載されているように網膜aCSFを調製した後、カルボーゲンで最低15分間バブリングすることによって網膜aCSFを酸素化し、次いでpHを7.4に調整する。直径60ミリメートルのペトリ皿をアイストレイに埋め込み、酸素化網膜aCSFで満たします。充填したシャーレを実体顕微鏡下に置く。次に、安楽死させたマウスのまぶたのフラップを切って目を露出させます。鈍い鉗子を使用して目を除核させ、実体顕微鏡下に置かれた冷たい網膜aCSFに移します。実体顕微鏡下で、デュモン数5鉗子で視神経を挟み、角膜中央に30ゲージの針で穴をあけて目を安定させ、マイクロハサミの先端を穴に差し込み、穴から角膜の端まで切開します。この手順を繰り返して、基本方向に 4 つのスライスを作成し、フラップを 4 つ作成します。隣接する2つのフラップをつかんで引き離し、すべての角膜フラップのために網膜から強膜を静かに剥離します。その後、鉗子を使用して網膜カップからレンズを取り外します。最後に、マイクロハサミを使用して網膜の端から視神経に向かって4つの橈骨切開を行い、4つの等しい花弁を作成します。取り付けに大口径グレーのMCEメンブレンフィルターを使用する場合は、ディスクを直径約1センチの象限に切断し、MCEディスクを大きな白いろ紙の中央に置きます。2つのサイズ3×ゼロのペイントブラシを使用して、網膜神経節細胞を裏にしたペイントブラシに1つの網膜カップを反転させます。網膜をaCSFから静かに持ち上げ、水張力が網膜を引き裂かないようにします。網膜でペイントブラシを握ったまま、aCSFを含むペトリ皿を邪魔にならないように動かし、MCE膜の付いた白いろ紙をステレオスコープの下に置きます。トランスファーピペットを用いて、MCEろ紙の中央にaCSFの液滴を置く。表面張力によって作成されたaCSF液滴に網膜を浮遊させ、MCE膜を荷電させた。ペイントブラシを使用して、網膜神経節細胞側を上にして液滴内の網膜を配置し、4つの花びらを広げます。配置したら、ペイントブラシと白いろ紙の間に水橋を作り、液滴の表面張力を壊します。ライブイメージングインキュベーションチャンバーを組み立て、酸素化aCSFで満たします。ポンプと温度コントローラの電源を入れ、温度が摂氏34度を超えないようにします。チャンバーの温度が安定するまでに最大1時間かかることがあります。網膜解剖を開始する前にインキュベーションチャンバーを設置することをお勧めします。安定したチャンバ温度は、サンプルドリフトの低減に役立ちます。網膜平らなマウンドを灌流チャンバーに移すには、ポンプを停止し、チャンバー内にあるaCSFを除去する。次に、網膜フラットマウントを備えたMCEディスクをインキュベーションチャンバに入れます。サンプル重量をプリウェットして表面張力を損ない、それをフラットマウントの上に置き、サンプル重量がMCE紙上に置かれるようにしてサンプルドリフトを低減します。チャンバーに加温したaCSFを補充し、毎分約1ミリリットルでaCSFを循環させる。ノーズピースを25回水浸漬対物レンズでイメージングチャンバ内に配置します。エピ蛍光光を用いて目的の標識細胞をスクリーニングし、目的の樹状突起を捕捉するように画像化体積を調整した。過飽和ピクセルと過飽和ピクセルの両方を識別するルックアップテーブルを使用して、ピクセルが過飽和にならないようにレーザー出力を調整します。3Dイメージングボリュームを取得し、目的のフレームレートで取得を繰り返します。イメージングボリュームは、サンプルドリフトを補償するために各時点間で調整することができます。画像系列をインポートし、画像を時間単位で分割します。すべてのタイムポイントを手動で保存するか、マクロプラグインを実行して保存します。正確な PSF を作成するには、[屈折 PSF 3D] をクリックして ImageJ プラグインを使用して理論上の点像分布関数を作成します。正確な PSF を作成するには、レンズの開口数、蛍光色素の放射波長、ピクセル サイズ、および Z 間隔が必要です。プラグイン、マクロを選択し、提供されているマクロを使用して、すべての時点に対してバッチ並列反復デコンボリューションを実行します。デコンボリューションされたすべてのタイムポイントをスタックとしてインポートするには、ファイル、インポート、イメージシーケンスの順にクリックします。スタックをハイパースタックに変換するには、[画像]、[ハイパースタック]、[スタック]の順にクリックします。Zスライスと時間枠の数を追加し、正しい3Dドリフトプラグインを使用して3Dドリフトを修正します。3D ドリフト補正されたハイパースタックを保存し、画像、ハイパースタック、ハイパースタックをクリックして画像を通常のスタックに変換し直し、画像、スタック、ツール、スタックスプリッターをクリックしてタイムポイントを分割します。分割するサブスタックの数には、タイムポイントの数を入力します。バッチ処理を使用して、すべての時点の最大投影法を作成します。タイムラプス画像シーケンスを読み込むには、[ファイル]、[インポート]、[画像シーケンス]の順にクリックします。そして、従来のImageJツールを使用して、デコンボリングおよびポストプロセッシングされた2次元ビデオの所望の分析を行い、スターバースト細胞樹状突起を発達させる高解像度の3Dビデオを取得し、デコンボリングし、3Dドリフトについて補正した。Z平面最大投影は、樹状突起の微細化の領域と樹枝状の伸長の領域を示す、解析用の2Dビデオを作成するために生成されました。各時点の3Dデコンボリューションは、ImageJによるデコンボリューションの前後に、単一のP6スターバーストアマクリンセルの微細な糸状体投影の分解能を増加させた。AAV感染期間の延長は、注射後5日および11日でのタンパク質発現の同様のレベルによって示されるように、必ずしも蛍光シグナルの増加をもたらさない。イメージング中のサンプルドリフトを低減することが重要です。ドリフトは、一貫したイメージング温度を維持し、サンプル上の重量を適切に配置することによって最小限に抑えられます。ドリフトが発生した場合、時系列を手動で取得すると、フレーム間のイメージングボリュームを調整できます。これにより、対象のフィーチャがフレーム内に残ります。このプロトコルは、発達中の神経突起の高解像度、デコンボレーション、およびドリフト補正された3Dビデオを生成します。このような映像は、ニューロン配線の理解を深めることにつながり、3次元形態形成の計算解析手法を進めるために必要とされています。神経突起発生の高スループット解析を実現するためには、より優れた自動トレースおよびトラッキングソフトウェアが必要です。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

アデノ随伴ウイルスベクターの頭蓋内注射

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

遺伝的にコードされたカルシウムセンサーを発現する鋤鼻器のスライス標本のイメージング神経細胞応答

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

モーター神経切断とライブゼブラフィッシュにおけるグリア細胞の挙動のタイムラプスイメージング

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

マウス蝸牛外植片の長期的タイムラプスイメージング

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

成体マウスにおける子宮頸部アデノ随伴ウイルス9（AAV9）ベクター送達

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

メソッドおよびアデノ随伴ウイルス ラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

可視化とアデノ随伴ウイルスと共焦点顕微鏡を用いた脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト オルガネラのライブ イメージング

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

ショウジョウバエのニューロン樹状分枝複雑さの定量解析

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...