Name: time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

매디슨 그레이가 내가 아무 것도 가지고 있지 않았을 때 나에게 손을 줘서 고맙다. 이 연구는 NSERC 디스커버리 그랜트 (RGPIN-2016-06128), 신경 과학의 슬론 펠로우십 및 캐나다 연구 위원장 Tier 2 (J.L.L.L)의 지원을 받았습니다. S. Ing-Esteves는 Vision Science Research Program과 NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral의 지원을 받았습니다.

참고: 이 프로토콜은 실험일 사이의 바이러스 형질도입에 대해 최소 4-5일의 기간으로 2일에 걸쳐 있습니다(그림 1A). 동물 실험은 아픈 어린이를위한 병원 (토론토, 캐나다)의 동물 서비스 동물 사용 및 관리위원회의 실험실에서 승인 한 프로토콜에 따라 연구 및 실험실 동물 관리에서 동물 사용에 대한 캐나다 동물 관리 지침에 따라 수행됩니다.
1. 신생아 ...

이 비디오는 기존의 유전 도구를 사용하여 공초점 라이브 이미징으로 망막 뉴런을 개발하는 수상 돌기 역학을 이미지화하는 실험 파이프 라인을 보여줍니다. 또한 신생아 마우스에 막 표적화된 형광 단백질을 코딩하는 Cre 의존성 AAVs의 안구 내 주사가 입증되었다. 유전적으로 표적화된 집단의 단일 세포는 4-5 dpi만큼 일찍 밝게 표지된다. 망막 플랫-마운트는 라이브 셀 공초점 이미징을 수행하기 ?...

망막 뉴런의 덴드라이트는 신경 회로 내에서 기능에 영향을 미치는 복잡하지만 구체적인 패턴을 형성합니다. 척추동물 망막에서 다양한 유형의 망막 신경절 세포(RGCs)와 아마크린 세포 인터뉴런은 arbor 크기, 위치, 가지 길이 및 밀도가 다른 독특한 수지상 형태를 띠고 있습니다1. 산후 발달 동안, RGCs와 amacrine 세포는 광수용체 신호를 전달하는 양극성 세포 입력을 수신하는 내부 플렉시폼 층 (IPL)이라고 불리는 뉴로필로 풍성한 수지상 과정을 확장합니다2. 병아리 또는 제브라피쉬 유충에서 형광으로 표지된 망막 개체군의 타임랩스 영상에 의해 포착된 바와 같이, 수상 돌기 형태형성은 매우 역동적이다3,4,5. 며칠 내에 수지상 arbors는 IPL의 좁은 하위 계층으로 확장, 리모델링 및 확대되어 일부 파트너와 시냅스합니다. arbors는 개발에 걸쳐 다른 구조적 역학을 나타내며, 지점 추가, 철회 및 안정화의 상대적 비율의 변화와 함께 나타납니다. Amacrine 및 RGC 수상 돌기는 또한 유형 별 수목을 반영 할 수있는 다른 성장 및 리모델링 동작을 나타냅니다. 그러나 이러한 연구는 광범위한 amacrine 또는 RGC 개체군을 추적하고 형태학의 한 측면 인 층류 타겟팅에 중점을 두었습니다.
망막 아형에서 관찰되는 광대한 형태학적 다양성을 생성하는 메커니즘은 잘 이해되지 않는다. 이 그룹의 목적은 수지상 역학을 포착하고 마우스에서 정의 된 망막 아형의 아형을 리모델링하는 방법을 개발하는 것이 었습니다. 수상 돌기 패터닝의 세포 유형 별 메커니즘을 식별하려면 관심있는 세포의 수상 돌기 행동을 시각화하고 측정하는 방법이 필요합니다. 마우스 망막의 유기형 배양은 공초점 또는 다중 광자 현미경을 사용하는 살아있는 세포 이미징 연구에 매우 적합합니다. 개발 중인 망막은 해부되어 평평한 외래편에 장착되며, 이 외식재는 기록 챔버에서 몇 시간 동안 영상화되거나 회로에 제한된 영향을 미치는 며칠 동안 배양될 수 있습니다6,7. 살아있는 망막 뉴런은 전극에 의한 염료 충전, 전기천공, 형광 단백질을 코딩하는 친유성 염료 또는 플라스미드로 코팅된 입자의 생체목록 전달(예를 들어, 진건) 및 유전적으로 코딩된 세포 표지7,8,9,10을 포함하는 다양한 기술에 의해 표지될 수 있다. . 그러나, 이러한 접근법은 특정 망막 아류형의 수상 돌기 역학을 이미징하는 데 비효율적이다. 예를 들어, 염료 충전 방법은 처리량이 낮으며 관심있는 세포를 안정적으로 타겟팅하기 위해 전기 생리학 장치 및 추가 유전자 표지가 필요합니다. 더욱이, 소마의 강한 형광 신호는 근처의 덴드라이트를 흐리게 할 수 있다.
생체 목록 유전자 전달 방법은 동시에 수십 개의 세포를 표지 할 수 있지만 고압 입자 전달 및 분리 된 망막의 하룻밤 배양과 관련된 단계는 세포 생리학 및 수지상 증식을 손상시킬 수 있습니다. 이 논문은 최근의 유전 도구를 사용하여 다음과 같은 실험 기준을 고려할 때 세포 유형 및 구조적 분해능으로 초기 수상 돌기 역학을 포착 할 수 있다고 제안합니다. 첫째, 발달하는 arbors를 지배하는 미세한 가지와 filopodia를 해결하기 위해이 방법은 전체 arbor의 과정을 채우는 밝고 형광 단백질로 뉴런을 표지해야합니다. 형광 표지는 이미징 기간 동안 광표백으로 인해 퇴색해서는 안됩니다. 다양한 형광 단백질 변이체가 생성되고 밝기 및 광안정성에 기초한 생체내/생체외 영상화11에 대한 적합성에 대해 비교되었다. 둘째, 형광 단백질 (XFPs)은 수상 돌기 형태 형성의 초기 단계에 의해 충분히 높은 수준으로 발현되어야하므로 좁은 발달 창을 놓치지 않아야합니다. 마우스 망막의 정적 시간대 분석에서 수상 돌기 발달은 출생 후 첫 주 동안 발생하며 성장, 리모델링 및 안정화 단계를 포함합니다10,12,13,14,15. 셋째, 상기 방법은 선택적 표지 또는 관심있는 뉴런 하위집단의 표지 가능성 증가로 이어져야 한다. 넷째, 표적 하위집단의 표지는 전체 뉴런 아버가 확인되고 추적될 수 있도록 충분히 희박해야 한다. RGC 및 amacrine 아류형은 성숙한 형태학적 특성 및 IPL 계층화 패턴16,17,18,19,20에 의해 구별될 수 있지만, 과제는 미성숙 구조를 기반으로 개발 중에 아형을 식별하는 것이다. 이 작업은 개발 중에 특정 망막 세포 유형을 표지하는 트랜스제닉 도구의 확장에 의해 촉진됩니다.
형광 단백질 또는 Cre의 세포 및 시간적 발현이 유전자 조절 요소에 의해 결정되는 형질전환 및 녹-인 마우스 라인은 망막 세포 유형13,21,22,23을 연구하는데 널리 사용된다. 수상 돌기 발달의 아형 특이적 패턴에 대한 주요 관찰은 정적 시점 10,14,24,25에서 트랜스제닉 마우스 망막에 대한 연구에서 나왔다. 특히 Cre-Lox 시스템은 다양한 재조합효소 의존성 리포터, 센서 및 광유전학적 활성화제를 사용하여 아형의 절묘한 유전자 조작 및 모니터링을 가능하게 한다. 이러한 도구는 망막 회로 어셈블리의 기초가되는 아형 특정 분자 프로그램 및 기능적 특성의 발견으로 이어졌습니다.26,27,28,29,30. 그러나, 그들은 아직 마우스 망막에서 아형 특이적 수상 돌기 역학을 연구하는 데 활용되지 않았습니다. 저밀도 표지는 Cre 마우스 라인을 전기천공 또는 재조합 AAVs에 의해 도입된 전이유전자와 조합함으로써 달성될 수 있다. 이용 가능한 경우, 타목시펜-유도성 Cre 라인 또는 교차 유전자 전략이 또한 사용될 수 있다. 마지막으로, 세포는 최소 침습적 방식으로 표지되어야 하고, 조직을 손상시키거나 수상 돌기 형태형성에 필요한 세포 기능을 방해하지 않도록 획득 파라미터를 사용하여 영상화되어야 한다.
여기에 제시된 방법은 살아있는 마우스 망막 외식편에서 수상 돌기 역학을 조사하기 위해 트랜스제닉 도구 및 공초점 현미경을 적용하는 방법이다. Cre 트랜스제닉 마우스 라인은 Cre 재조합시 형광 단백질을 발현하는 AAV 벡터와 결합되었으며, 이는 관심있는 망막 세포의 희소 표지를 허용한다. 상업적으로 이용가능한 AAVs는 유리체내 주사에 의해 신생아 망막으로 전달된다. 이 논문은 AAV가 4dpi만큼 상당히 높고 세포 유형 별 형광 발현을 생성하여 출생 후 시점에 액세스 할 수 있음을 보여줍니다. 이러한 접근법을 예시하기 위해, 콜린성 "스타버스트" 아마크린 인터뉴런은 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (ChAT)-내부 리보솜 진입 부위 (IRES)-Cre 전이유전자를 발현하는 신생아 마우스에 Brainbow AAV를 전달함으로써 표지되었으며, 이는 산후 망막31,32에서 활성화된다. 스타버스트 아마크린 세포는 군집된 프로토카데린33,34에 의해 매개되는 수상 돌기 자기 회피에 의해 형성되는 고정관념 및 방사형 아버 형태를 개발한다. 이 논문은 Brainbow AAVs31에 사용되는 파네 실화를 겪는 CAAX 모티프를 추가하여 XFPs에 의해 원형질막에 스타 버스트 수상 돌기 및 필로 포디아의 해상도가 크게 향상되었음을 보여줍니다. 마지막으로, 타임랩스 이미징 및 후처리 프로토콜은 수상 돌기 재구성 및 형태 정량화에 적합한 고품질 이미지를 생성하는 것으로 결정되었습니다. 이 프로토콜은 수상 돌기 형태 형성을 조절하는 요인을 확인하고 손상되지 않은 망막에서 여러 세포 행동을 포착하는 데 사용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45185-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45186-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HABG01 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 50 &#215; 15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470313-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene disposable transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tip paint brush, size 3/0</td>
			<td>Conventional art supply store</td>
			<td></td>
			<td>Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-imaging incubation system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber polyethylene tubing, PE-160 10&#39;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel heater controller, Model TC-344C</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater controller cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CC-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large bath incubation chamber with slice support</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample anchor (Harps)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0260</td>
			<td>Sample anchor must be compatible with incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sloflo In-line Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Microliter Syringe Series 700, Removable Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)&#160;</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2453</td>
			<td>Addgene Plasmid #45185&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 
			1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2454</td>
			<td>Addgene Plasmid #45186</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF Dye content &#8805;85 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tattoo paste</td>
			<td>Ketchum MFG Co</td>
			<td>329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>PV-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>Supplier may vary depending on region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH35317.604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>Open source</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations

수지상 arbors를 패턴화하는 메커니즘을 발견하려면 개발 중에 수상 돌기를 시각화, 이미지 및 분석하는 방법이 필요합니다. 마우스 망막은 신경 형태 형성 및 연결성의 세포 유형 특이적 메커니즘의 조사를 위한 강력한 모델 시스템이다. 망막 아형의 조직과 구성은 잘 정의되어 있으며, 유전 도구는 개발 중에 특정 유형에 접근 할 수 있습니다. 많은 망막 세포 유형은 또한 그들의 수상 돌기 및 / 또는 축삭을 좁은 층으로 제한하여 시간 경과 이미징을 용이하게합니다. 마우스 망막 외래 배양물은 공초점 또는 다중 광자 현미경을 사용한 살아있는 세포 이미징에 매우 적합하지만 시간적 및 구조적 해상도로 수상 돌기 역학을 이미징하는 데 최적화 된 방법은 부족합니다. 여기에 제시된 것은 Cre-Lox 시스템에 의해 표시된 특정 망막 집단의 발달을 희박하게 라벨링하고 이미지화하는 방법입니다. 여기에서 사용되는 상업적으로 입수가능한 아데노-관련 바이러스 (AAVs)는 Cre-의존성 방식으로 막 표적화된 형광 단백질을 발현한다. 신생아 마우스에서 AAVs의 안구 내 전달은 주사 후 4-5 일 (dpi)에 의해 표적화 된 세포 유형의 형광 표지를 생성합니다. 막 형광 신호는 공초점 이미징으로 검출 할 수 있으며 미세 분지 구조와 역학을 해결합니다. 2-4 시간에 걸친 고품질 비디오는 산소화 된 인공 뇌척수액 (aCSF)이 관류하는 망막 플랫 마운트를 이미징하여 획득합니다. 또한 디컨볼루션 및 3차원(3D) 드리프트 보정을 위한 이미지 후처리 파이프라인도 제공됩니다. 이 프로토콜은 손상되지 않은 망막에서 여러 세포 행동을 포착하고 신경돌기 형태 형성을 조절하는 새로운 요인을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 망막에서 배운 많은 발달 전략은 중추 신경계의 다른 곳에서 신경 회로의 형성을 이해하는 데 관련이 있습니다.

위의 프로토콜을 사용하여 스타버스트 셀 수상 돌기를 개발하는 고해상도 3D 비디오를 획득, 디컨볼브 및 3D 드리프트에 맞게 수정했습니다. Z-평면 최대 프로젝션은 분석을 위한 2D 비디오를 만들기 위해 제작되었다(보충 비디오 1, 도 5A). 각 시점의 3D 디컨볼루션은 미세한 필로포디아 투영의 분해능을 증가시켰다(그림 5B,C). 미?...

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Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

여기에서, 우리는 시간 경과 공초점 현미경에 의해 산후 마우스 망막 외식편에서 신경돌기 형태 형성을 조사하는 방법을 제시한다. 우리는 Cre 의존성 방식으로 막 표적화된 형광 단백질을 발현하는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터를 사용하는 망막 세포 유형의 희소 표지 및 획득 및 이들의 미세 공정에 대한 접근법을 기술한다.

유전자 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노-연관 바이러스 표지를 이용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

수지상 또는 축삭 아버의 단일 세포 표지 및 시각화는 신경 형태 형성을 연구하는 데 필요합니다. 최소 침습적 방식으로 발달하는 arbors를 라벨링함으로써, 망막 조직은 건강하게 유지되고 장기간의 공초점 라이브 이미징에 적합합니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 주사 후 나흘 이내에 다색 형광 단백질로 개별 arbors를 시각화 할 수 있다는 것입니다.이것은 신생아 arbor 형태학을 연구하는 것을 가능하게합니다. 이 주사 이미징 및 분석 프로토콜은 중추 신경계 전반에 걸친 신경 형태를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 적절한 Cre 선택 및 주입 위치는 관심있는 세포 집단을 표적으로 하기 위해 결정되어야 한다.먼저 Cre 마우스 라인을 선택하여 관심 있는 망막 세포 집단에 라벨을 붙인다. 형광 단백질을 코딩하는 재조합효소 의존성 AAV 바이러스를 얻는다. 미세 공정의 최적 표지를 위해, 원형질막을 표적화하는 변형된 형광 단백질을 발현하는 벡터를 선택하십시오.얼음 상의 AAV 분취량을 위해, 멸균 식염수 또는 PBS를 사용하여 하나 내지 네 개의 AAV 희석액을 준비한다. 주사제를 시각화하려면 AAV 희석액 15 마이크로리터마다 약 1 마이크로리터의 0.02%Fast Green FCF 염료 용액을 첨가하여 용액을 파란색으로 채색하십시오. 주사 부위를 70 % 에탄올로 멸균하십시오.마이크로사이린지를 사용하여 AAV 희석액으로 마이크로피펫을 백필한다. 스테레오 현미경으로 마이크로 피펫 팁을 30게이지 바늘로 부수어 팁의 밀봉을 풉니다. 신생아 마우스를 마취 한 후 30 게이지 바늘을 사용하여 문신 잉크로 발 패드를 문신하여 동물을 식별하십시오.DNA 분리 및 유전자형을 위한 꼬리 클리핑을 수집합니다. 70 % 에탄올로 눈 위에 놓인 피부를 면도합니다. 30게이지 바늘을 사용하여 융합된 눈꺼풀을 열고 손가락으로 가벼운 압력을 가하여 눈을 뜨게 합니다.각막 공막 접합부에서 각막을 통해 작은 구멍을 뚫습니다. 유리 마이크로 피펫을 구멍에 넣고 마이크로 인젝터 풋 페달을 두 번에서 네 번 눌러 AAV를 유리체내 공간에 주입하십시오. 마이크로피펫을 천천히 제거하고 동공에서 청색 염료를 시각화하여 AAV 주입을 확인하였다.텍스트 원고에 기재된 바와 같이 망막 aCSF를 준비한 후, 최소 15분 동안 카르보겐으로 버블링하여 망막 aCSF를 산소화한 다음, pH를 7.4로 조정한다. 직경 60mm의 페트리 접시를 얼음 쟁반에 넣고 산소가 공급된 망막 aCSF로 채웁니다. 채워진 페트리 접시를 스테레오 현미경 아래에 놓습니다.다음으로, 안락사된 마우스의 눈꺼풀 플랩을 절단하여 눈을 노출시킨다. 무딘 포셉을 사용하여 눈을 감싸고 스테레오 현미경 아래에 놓인 차가운 망막 aCSF로 옮깁니다. 스테레오 현미경으로 Dumont 번호 다섯 포셉을 사용하여 시신경을 쥐어 안고 30 게이지 바늘로 각막 중앙에 구멍을 뚫은 다음 마이크로 가위의 한 끝을 구멍에 삽입하여 구멍에서 각막 끝까지 절개하십시오.반복하여 기본 방향으로 네 개의 슬라이스를 만들어 네 개의 플랩을 만듭니다. 인접한 두 플랩을 잡고 당겨 모든 각막 플랩에 대해 망막에서 공막을 부드럽게 벗겨냅니다. 그런 다음 포셉을 사용하여 망막 컵에서 렌즈를 제거하십시오.마지막으로, 마이크로 가위를 사용하여 망막 가장자리에서 시신경쪽으로 네 개의 방사상 절개를 만들어 네 개의 동일한 꽃잎을 만듭니다. 장착에 직경이 큰 회색 MCE 멤브레인 필터를 사용하는 경우 디스크를 약 한 센티미터 높이의 사분면으로 자른 다음 MCE 디스크를 더 큰 흰색 필터 용지의 중앙에 놓습니다. 두 개의 크기 세 개의 제로 페인트 브러시를 사용하여 망막 신경절 세포 측면을 아래로 향하게하는 페인트 브러시에 하나의 망막 컵을 뒤집습니다.aCSF에서 망막을 부드럽게 들어 올려 물 장력이 망막을 찢지 않도록하십시오. 망막이 있는 페인트 브러시를 계속 잡고 있는 상태에서 aCSF가 들어있는 페트리 접시를 움직이지 않고 MCE 멤브레인이 있는 흰색 여과지를 스테레오스코프 아래에 놓습니다. 전사 피펫을 사용하여 MCE 여과지의 중앙에 aCSF 액적을 놓습니다.망막을 표면 장력에 의해 생성된 aCSF 액적 내로 띄우고 MCE 막을 충전한다. 페인트 브러시를 사용하여 망막 신경절 세포가 위로 향하게하여 액적 안에 망막을 놓은 다음 네 개의 꽃잎을 펼치십시오. 일단 위치하면, 물방울의 표면 장력을 깨기 위해 페인트 브러시와 흰색 여과지 사이에 물 다리를 만듭니다.라이브 이미징 인큐베이션 챔버를 조립하고 산소화 된 aCSF로 채 웁니다. 펌프와 온도 컨트롤러를 켜고 온도가 섭씨 34도 이상으로 상승하지 않도록하십시오. 챔버 온도가 안정화되는 데 최대 한 시간이 걸릴 수 있습니다.망막 해부를 시작하기 전에 인큐베이션 챔버를 설치하는 것이 좋습니다. 안정적인 챔버 온도는 샘플 드리프트를 줄이는 데 도움이됩니다. 망막 편평한 마운드를 관류 챔버로 옮기려면 펌프를 멈추고 챔버 내에 있는 aCSF를 제거하십시오.그런 다음 망막 플랫 마운트가 있는 MCE 디스크를 인큐베이션 챔버에 넣습니다. 표면 장력을 깨기 위해 샘플 중량을 미리 적신 다음 플랫 마운트 위에 올려 놓고 샘플 중량이 MCE 용지에 배치되도록 하여 샘플 드리프트를 줄입니다. 따뜻한 aCSF로 챔버를 채우고 분당 약 한 밀리리터로 aCSF를 순환시킵니다.25배의 물 담그기 목적으로 노즈피스를 이미징 챔버에 위치시킵니다. 에피형광광을 사용하여 관심있는 표지된 세포를 스크린하고, 관심 있는 수지상 특징을 포착하기 위해 이미징 부피를 조정한다. 과포화 픽셀과 과포화 픽셀을 모두 식별하는 조회 테이블을 사용하여 픽셀이 과포화되지 않도록 레이저 파워를 조정합니다.3D 이미징 볼륨을 획득하고 원하는 프레임 속도로 수집을 반복합니다. 이미징 볼륨은 샘플 드리프트를 보상하기 위해 각 시점 사이에서 조정될 수 있다. 이미지 시리즈를 가져와서 이미지를 시간별로 분할합니다.수동으로 또는 매크로 플러그인을 실행하여 모든 시간 포인트를 저장하십시오. 정확한 PSF를 만들려면 Defraction PSF 3D, 렌즈 숫자 조리개, 형광단 방출 파장, 픽셀 크기 및 Z-간격을 클릭하여 ImageJ 플러그인을 사용하여 이론적인 포인트 확산 함수를 만듭니다. 제공된 매크로를 사용하여 모든 시간대에 대해 배치 병렬 반복 디컨볼루션을 수행하려면 플러그인, 매크로 및 실행을 선택하십시오.파일, 가져오기, 이미지 시퀀스를 클릭하여 모든 비convolved 시점을 스택으로 가져옵니다. 이미지, 하이퍼스택을 클릭한 다음 스택을 하이퍼스택으로 클릭하여 스택을 하이퍼스택으로 변환합니다. Z 슬라이스와 타임 프레임의 수를 추가 한 다음 올바른 3D 드리프트 플러그인을 사용하여 3D 드리프트를 수정하십시오.3D 드리프트 보정된 하이퍼스택을 저장하고 이미지, 하이퍼스택, 하이퍼스택을 스택으로 클릭하여 이미지를 일반 스택으로 변환한 다음 이미지, 스택, 도구 및 스택 스플리터를 클릭하여 시점을 분할합니다. 분할할 서브스택의 수에 대해 시점 수를 입력합니다. 일괄 처리를 사용하여 모든 시점에 대한 최대 투영을 생성합니다.파일, 가져오기, 이미지 시퀀스를 클릭하여 타임랩스 이미지 시퀀스를 가져옵니다. 그리고 디컨볼브 및 포스트 프로세싱된 이차원 비디오의 원하는 분석을 위해 기존의 ImageJ 툴을 사용하고, 스타버스트 셀 덴드라이트를 개발하는 고해상도 3D 비디오를 획득하고, 디컨볼브하고, 3D 드리프트에 대해 보정하였다. Z-평면 최대 프로젝션은 분석을 위해 2D 비디오를 제작하여 수지상 미세화 영역과 수지상 파생물 영역을 보여줍니다.각 시점의 3D 디컨볼루션은 ImageJ와의 디컨볼루션 전후의 단일 P6 스타버스트 아마크린 셀의 미세한 필로포디아 프로젝션의 해상도를 증가시켰다. AAV 감염 기간이 길어도 주사 후 5일 및 11일째에 유사한 수준의 단백질 발현으로 나타나는 바와 같이 형광 신호 증가가 반드시 증가할 필요는 없다. 이미징 중 샘플 드리프트를 줄이는 것이 중요합니다.드리프트는 일관된 이미징 온도를 유지하고 샘플 상에 중량을 적절하게 위치시킴으로써 최소화된다. 드리프트가 발생하는 경우, 시계열을 수동으로 획득하면 프레임 사이의 이미징 볼륨을 조정할 수 있습니다. 이렇게 하면 관심 있는 기능이 프레임에 남아 있습니다.이 프로토콜은 신경돌기 발달에 대한 고해상도, 디컨볼루브 및 드리프트 보정 3D 비디오를 생성합니다. 이러한 비디오는 뉴런 배선에 대한 더 나은 이해로 이어지고 3D 형태 형성의 계산 분석 방법을 발전시키는 데 필요합니다. 뉴라이트 개발에 대한 높은 처리량 분석을 달성하기 위해서는 더 나은 자동 추적 및 추적 소프트웨어가 필요합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 Intracranial 분사

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

연구

신경과학

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

성인 쥐의 Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) 벡터 전달

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

시각화 및 Adeno 관련 바이러스 및 Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 Organotypic 뇌 조각에서 Oligodendrocyte 세포의 라이브 영상

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

초파리 에서 신경 돌기 Arborization 복잡성의 정량 분석

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...