Name: time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Vi takker Madison Gray for at du ga meg en hånd da jeg ikke hadde noen. Denne forskningen ble støttet av et NSERC Discovery Grant (RGPIN-2016-06128), et sloanstipend i nevrovitenskap og en Canada Research Chair Tier 2 (til J.L.L). S. Ing-Esteves ble støttet av Vision Science Research Program og NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral.

MERK: Denne protokollen strekker seg over 2 dager med en minimumsperiode på 4-5 dager for viral transduksjon mellom eksperimentelle dager (figur 1A). Dyreforsøk utføres i samsvar med Canadian Council on Animal Care Guidelines for Use of Animals in Research and Laboratory Animal Care under protokoller godkjent av Laboratory of Animal Services Animal Use and Care Committee ved Hospital for Sick Children (Toronto, Canada).
1. Forberedelser til neonatale AAV-injeksjo...

Denne videoen demonstrerer en eksperimentell rørledning som bruker eksisterende genetiske verktøy for å bilde dendrite dynamikken i å utvikle retinal neuroner med konfiskert live-imaging. Også demonstrert er intraokulære injeksjoner av Cre-avhengige AAVs koding membran-målrettede fluorescerende proteiner i neonatal mus. Enkeltceller av genetisk målrettede populasjoner er sterkt merket så tidlig som 4-5 dpi. Retinal flat-mounts ble forberedt for standard bildekamre for å utføre live-celle konfølende avbildning...

Dendritter av retinal nevroner danner intrikate, men spesifikke, mønstre som påvirker deres funksjon i nevrale kretser. I virveldyr netthinnen, ulike typer retinal ganglion celler (RGCs) og amacrine celle interneurons bære unike dendritiske morfologier som varierer i arbor størrelse, plassering, gren lengde, og tetthet1. Under postnatal utvikling utvider RGCer og amacrine celler sprudlende dendrittiske prosesser til en neuropil kalt det indre plexiformlaget (IPL), hvor de mottar bipolare celleinnganger som overfører fotoreseptorsignaler2. Som fanget av tidsforløpavbildning av fluorescerende merkede retinalpopulasjoner hos kylling- eller sebrafisklarver, er dendritmorfogenese svært dynamisk3,4,5. I løpet av få dager utvides, ombygges og ramifiseres dendritiske arbors for å begrense underlagene til IPL, der de synapserer med utvalgte partnere. Arbors viser forskjellig strukturell dynamikk over utvikling, med endringer i relative rater av gren tillegg, tilbaketrekning og stabilisering. Amacrine og RGC dendritter viser også forskjellige utvekst- og ombyggingsvirkemåter som kan gjenspeile typespesifikk arborisering. Imidlertid sporet disse studiene brede amacrine- eller RGC-populasjoner og fokuserte på laminær målretting, som bare er ett aspekt av morfologi.
Mekanismene som produserer det enorme morfologiske mangfoldet som observeres på tvers av netthinneundertyper, er dårlig forstått. Målet med denne gruppen var å utvikle en metode for å fange dendritdynamikk og arbor ombygging av definerte retinal subtyper hos mus. Identifisering av celletypespesifikke mekanismer for dendritmønster krever metoder for å visualisere og måle dendritoppførsel av celler av interesse. Organotypiske kulturer av mus netthinner er godt egnet for levende celle bildestudier ved hjelp av konfikal eller multifoton mikroskopi. Utvikling av netthinner dissekeres og monteres i en flat utvisning som kan avbildes i flere timer i et opptakskammer eller dyrkes over noen dager med begrensede effekter på kretsløpet6,7. Levende retinal nevroner kan merkes med en rekke teknikker, inkludert fargestofffylling av elektroder, elektroporasjon, biolistisk levering av partikler belagt med lipofile fargestoffer eller plasmider som koder fluorescerende proteiner (f.eks. Gene Gun), samt genetisk kodede celleetiketter7,8,9,10 . Disse tilnærmingene er imidlertid ineffektive for avbildning av dendritdynamikk av spesifikke netthinneundertyper. For eksempel er fargestofffyllingsmetoder lav gjennomstrømning og krever elektrofysiologiapparater og ekstra genetiske etiketter for pålitelig å målrette celler av interesse. Videre kan de sterke fluorescenssignalene i soma skjule nærliggende dendritter.
Biolistiske genleveringsmetoder kan samtidig merke dusinvis av celler, men trinn som involverer høytrykkspartikkellevering og nattinkubasjon av isolert netthinne kan kompromittere cellefysiologi og dendritisk utvekst. Denne artikkelen foreslår at nyere genetiske verktøy kan brukes til å fange tidlig dendritdynamikk med celletype og strukturell oppløsning, gitt følgende eksperimentelle kriterier. For det første, for å løse de fine grenene og filopodia som dominerer utviklingen av arbors, bør metoden merke nevroner med lyse, fluorescerende proteiner som fyller prosesser i hele arboret. Fluorescensmerkingen skal ikke falme på grunn av fotobleking i bildeperioden. En rekke fluorescerende proteinvarianter er generert og sammenlignet for egnethet for in vivo/ex vivo imaging11 basert på lysstyrke og fotostabilitet. For det andre må fluorescerende proteiner (XFPer) uttrykkes på tilstrekkelig høye nivåer ved det tidligste stadiet av dendritmorfogenese, slik at det smale utviklingsvinduet ikke går glipp av. I analyser av statiske tidspunkter i musetina forekommer dendritutvikling i løpet av den første barseluken og inkluderer faser av utvekst, ombygging og stabilisering10,12,13,14,15. For det tredje bør metoden føre til selektiv merking eller økt sannsynlighet for merking av den nevronale subpopulasjonen av interesse. For det fjerde må merkingen av måldelpopulasjonen være tilstrekkelig sparsom slik at hele nevronal arbor kan identifiseres og spores. Selv om RGC og amacrine undertyper kan preges av deres modne morfologiske egenskaper og IPL stratifiseringsmønstre16,17,18,19,20, er utfordringen å identifisere undertyper under utvikling basert på umodne strukturer. Denne oppgaven forenkles ved utvidelse av transgene verktøy for å merke spesifikke netthinnecelletyper under utvikling.
Transgene og knock-in muselinjer der cellulære og temporale uttrykk for fluorescerende proteiner eller Cre bestemmes av genregulatoriske elementer er mye brukt til å studere retinal celletyper13,21,22,23. Sentrale observasjoner om subtypespesifikke mønstre for dendritutvikling har kommet fra studier av transgene mus netthinner på statiske tidspunkter10,14,24,25. Spesielt Cre-Lox-systemet muliggjør utsøkt genmanipulering og overvåking av undertyper ved hjelp av en rekke rekombinaseavhengige reportere, sensorer og optogenetiske aktivatorer. Disse verktøyene har ført til funn av subtypespesifikke molekylære programmer og funksjonelle egenskaper som ligger til grunn for retinal kretsmontering26,27,28,29,30. Imidlertid har de ennå ikke blitt utnyttet til å studere subtype-spesifikk dendritdynamikk i mus netthinnen. Merking med lav tetthet kan oppnås ved å kombinere Cre-muselinjer med transgenes introdusert av elektroporasjon eller ved rekombinante AAVer. Hvis tilgjengelig, tamoxifen-inducible Cre linjer eller interseksjonelle genetiske strategier kan også brukes. Til slutt bør cellen merkes på en minimalt invasiv måte og avbildet ved hjelp av oppkjøpsparametere for ikke å kompromittere vevet eller forstyrre cellulær funksjon som kreves for dendritmorfogenese.
Presentert her er en metode for å bruke transgene verktøy og konfokal mikroskopi for å undersøke dendritdynamikk i levende mus retinal explants. Cre transgene muselinjer har blitt kombinert med AAV-vektorer som uttrykker fluorescerende proteiner ved Cre-rekombinasjon, noe som gir mulighet for sparsom merking av retinalceller av interesse. Kommersielt tilgjengelige AAVer leveres til neonatal netthinne ved intravitreale injeksjoner. Dette dokumentet viser at AAVer produserer betydelig høyt og celletypespesifikk fluorescerende uttrykk med 4 dpi, noe som gir tilgang til postnatale tidspunkter. For å illustrere denne tilnærmingen ble den kolinerge "starburst" amacrine internuron merket ved å levere Brainbow AAV i neonatale mus som uttrykker kolin acetyltransferase (ChAT)-intern ribosome entry site (IRES)-Cre transgene, som er aktiv i den tidlige postnatale netthinnen31,32. Starburst amacrine celler utvikle en stereotyp og radial arbor morfologi som er formet av dendrite selvunngåelse formidlet av klynget protocadherins33,34. Dette papiret viser at oppløsningen av stjerneskudd dendritter og filopodia er betydelig forbedret av XFPs til plasmamembranen med tilsetning av CAAX-motivet som gjennomgår farnesylering, som brukes til Brainbow AAVs31. Til slutt er det fastslått tidsforløpavbildnings- og etterbehandlingsprotokoller som produserer bilder av høy kvalitet som kan brukes til dendritrekonstruksjon og morfometrisk kvantifisering. Denne protokollen kan brukes til å identifisere faktorer som kontrollerer dendritmorfogenese og for å fange opp flere cellulære atferd i den intakte netthinnen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45185-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45186-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HABG01 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 50 &#215; 15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470313-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene disposable transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tip paint brush, size 3/0</td>
			<td>Conventional art supply store</td>
			<td></td>
			<td>Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-imaging incubation system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber polyethylene tubing, PE-160 10&#39;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel heater controller, Model TC-344C</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater controller cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CC-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large bath incubation chamber with slice support</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample anchor (Harps)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0260</td>
			<td>Sample anchor must be compatible with incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sloflo In-line Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Microliter Syringe Series 700, Removable Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)&#160;</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2453</td>
			<td>Addgene Plasmid #45185&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 
			1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2454</td>
			<td>Addgene Plasmid #45186</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF Dye content &#8805;85 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tattoo paste</td>
			<td>Ketchum MFG Co</td>
			<td>329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>PV-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>Supplier may vary depending on region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH35317.604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>Open source</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations

Å oppdage mekanismer som mønster dendritiske arbors krever metoder for å visualisere, bilde og analysere dendritter under utvikling. Mus netthinnen er et kraftig modellsystem for undersøkelse av celletypespesifikke mekanismer for nevronal morfogenese og tilkobling. Organiseringen og sammensetningen av retinal subtyper er veldefinerte, og genetiske verktøy er tilgjengelige for å få tilgang til bestemte typer under utvikling. Mange retinal celletyper begrenser også dendrittene og/eller axonene til smale lag, noe som letter tidsforløpavbildningen. Mus netthinnen explant kulturer er godt egnet for live-celle avbildning ved hjelp av confocal eller multiphoton mikroskopi, men metoder optimalisert for avbildning dendrite dynamikken med temporal og strukturell oppløsning mangler. Presentert her er en metode for å sparsomt merke og bilde utviklingen av spesifikke netthinnepopulasjoner preget av Cre-Lox-systemet. Kommersielt tilgjengelige adeno-assosierte virus (AAVs) som brukes her uttrykte membran-målrettede fluorescerende proteiner på en Cre-avhengig måte. Intraokulær levering av AAVer hos nyfødte mus produserer fluorescerende merking av målrettede celletyper med 4-5 dager etter injeksjon (dpi). Membranfluorescerende signaler kan påvises ved konfektavbildning og løse fine grenstrukturer og dynamikk. Videoer av høy kvalitet som spenner over 2-4 timer er anskaffet fra imaging retinal flat-mounts perfused med oksygenert kunstig cerebrospinalvæske (aCSF). Også gitt er et bilde etterbehandling rørledning for dekonvolusjon og tredimensjonal (3D) drift korreksjon. Denne protokollen kan brukes til å fange opp flere cellulære atferd i den intakte netthinnen og for å identifisere nye faktorer som kontrollerer nevritt morfogenese. Mange utviklingsstrategier lært i netthinnen vil være relevante for å forstå dannelsen av nevrale kretser andre steder i sentralnervesystemet.

Ved hjelp av protokollen ovenfor ble en høyoppløselig 3D-video av å utvikle stjerneskuddcelle dendritter anskaffet, dekonvolvert og korrigert for 3D-drift. Z-plane maksimale projeksjoner ble produsert for å lage 2D-videoer for analyse (Supplementary Video 1, Figur 5A). 3D-dekonvolusjon av hvert tidspunkt økte oppløsningen av fine filopodiaprojeksjoner (figur 5B, C). Fine filopodia fremspring er en funksjon av å utvikle re...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Her presenterer vi en metode for å undersøke nevritt morfogenese i postnatal mus retinal explants ved tidsforløp konfokal mikroskopi. Vi beskriver en tilnærming for sparsommerking og oppkjøp av retinal celletyper og deres fine prosesser ved hjelp av rekombinante adeno-assosierte virusvektorer som uttrykker membran-målrettede fluorescerende proteiner på en Cre-avhengig måte.

Tidsforløpavbildning av nevronal arborisering ved hjelp av sparsom adeno-assosiert virusmerking av genetisk målrettede retinalcellepopulasjoner

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Encellet merking og visualisering av dendritiske eller axonale arbors er nødvendig for å studere nevronal morfogenese. Ved å merke utviklingen av arbors på en minimalt invasiv måte, forblir netthinnevev sunt og egnet for langvarig konfokal levende avbildning. Den største fordelen med denne metoden er evnen til å visualisere individuelle arbors med flerfargede fluorescerende proteiner innen fire dager etter injeksjon.Dette gjør det mulig å studere neonatal arbormorfologier. Denne injeksjonsavbildnings- og analyseprotokollen kan brukes til å studere nevronale morfologier over hele sentralnervesystemet. Passende cre utvalg og injeksjon plassering må bestemmes for å målrette cellepopulasjonen av interesse.Begynn med å velge en Cre-muselinje for å merke de interessemessige retinalcellepopulasjonene. Få rekombinasavhengige AAV-viruskoding av fluorescerende proteiner. For optimal merking av fine prosesser, velg vektorer som uttrykker modifiserte fluorescerende proteiner rettet mot plasmamembranen.For AAV aliquot på is, og forberede en en til fire AAV fortynning ved hjelp av steril saltvann eller PBS. For å visualisere injeksjonene, farge løsningen blå ved å legge til omtrent en mikroliter av 0,02% Fast Green FCF fargestoffløsning for hver 15 mikroliter AAV fortynning. Steriliser injeksjonsområdet med 70% etanol.Fyll mikropipetten på nytt med AAV-fortynning ved hjelp av en mikrosyring. Under et stereomikroskop bryter du mikropipettespissen med en 30-gauge nål for å forsegle spissen. Etter bedøvelse av nyfødte mus, tatovere sine pote pads med tatovering blekk ved hjelp av en 30-gauge nål for å identifisere dyrene.Samle haleklipp for DNA-isolasjon og genotyping. Vattpinne huden overlyd øynene med 70% etanol. Bruk en 30-gauge nål for å åpne det smeltede øyelokket mens du påfører lett trykk med fingrene for å åpne øyet.Stikk et lite hull gjennom hornhinnen ved hornhinnen sclera krysset. Sett glassmikropipetten inn i hullet og trykk på mikroinjektorfotpedalen to til fire ganger for å injisere AAV i det intravitreale rommet. Fjern mikropipetten langsomt og bekreft AAV-injeksjon ved å visualisere det blå fargestoffet i eleven.Etter å ha forberedt retinal aCSF som beskrevet i tekstmanuskriptet, oksygenere retinal aCSF ved å boble med carbogen i minst 15 minutter, deretter justere pH til 7.4. Legg inn en Petri-tallerken med en diameter på 60 millimeter i en isbrett og fyll den med oksygenert retinal aCSF. Legg den fylte Petri-retten under et stereomikroskop.Deretter kutter du øyelokkklaffen til den euthanized musen for å eksponere øyet. Bruk stumpe tang for å enukle øynene og overføre dem til den kalde retinal aCSF plassert under stereomikroskopet. Under stereomikroskopet stabiliserer du øyet ved å klemme synsnerven ved hjelp av Dumont nummer fem tang og stikker et hull i midten av hornhinnen med en 30 gauge nål, og sett deretter en spiss av mikrosaksen inn i hullet for å gjøre et snitt fra hullet til enden av hornhinnen.Gjenta for å lage fire skiver i kardinalretningene, og lag fire klaffer. Grip og trekk de to tilstøtende klaffene fra hverandre, forsiktig skrelle sclera fra netthinnen for alle hornhinneklaffene. Fjern deretter linsen fra netthinnekoppen ved hjelp av tangene.Til slutt, bruk mikrosaks for å lage fire radiale snitt fra kanten av netthinnen mot synsnerven, og skape fire like kronblad. Hvis du bruker grå MCE-membranfiltre med stor diameter for montering, skjærer du platen i kvadranter omtrent én centimeter over, og deretter plasserer du MCE-platen på midten av et større hvitt filterpapir. Bruk to pensler i størrelse tre x null, og vend en retinal kopp på en pensel med den retinal ganglion cellesiden ned.Løft netthinnen forsiktig ut av aCSF, og sørg for at vannspenningen ikke netthinnen. Mens du fortsatt holder penselen med netthinnen, flytter du Petri-parabolen som inneholder aCSF, ut av veien og plasserer det hvite filterpapiret med MCE-membranen under stereoskopet. Bruk en overføringspipette til å plassere en dråpe aCSF i midten av MCE-filterpapiret.Flyt netthinnen inn i aCSF-dråpen som skapes av overflatespenningen og ladet MCE-membran. Bruk pensler til å plassere netthinnen i dråpen med retinal ganglion celle side opp, deretter utfolde de fire kronbladene. Når den er plassert, lager du en vannbro mellom penselen og hvitt filterpapir for å bryte overflatespenningen på dråpen.Monter live imaging inkubasjonskammeret og fyll det med oksygenert aCSF. Slå på pumpen og temperaturregulatoren, og sørg for at temperaturen ikke stiger over 34 grader Celsius. Det kan ta opptil en time før kammertemperaturen stabiliserer seg.Det anbefales å sette opp inkubasjonskammeret før du begynner retinal avhandling. Stabil kammertemperatur bidrar til å redusere prøvedriften. For å overføre den retinal flate haugen inn i perfusjonskammeret, stopp pumpen og fjern aCSF som er i kammeret.Plasser deretter MCE-platen med den flate retinalbraketten i inkubasjonskammeret. Forslå en prøvevekt for å bryte overflatespenningen, og plasser den deretter på den flate braketten og sørg for at prøvevekten er plassert på MCE-papiret for å redusere prøvedriften. Fyll kammeret med den oppvarmede aCSF og sirkulere aCSF på omtrent en milliliter per minutt.Plasser nesestykket med det 25 ganger vann dyppemålet i bildekammeret. Skjerm for merkede celler av interesse ved hjelp av epifluorescent lys, og juster bildevolumet for å fange dendritiske egenskaper av interesse. Bruk en oppslagstabell som identifiserer både overmettede og umettede bildepunkter, og juster laserkraften slik at ingen bildepunkter er overmettet.Skaff deg 3D-bildevolumet og gjenta anskaffelsen med ønsket bildefrekvens. Bildevolumet kan justeres mellom hvert tidspunkt for å kompensere for prøvedrift. Importer bildeserien, og del bildene etter tid.Lagre alle tidspunkter manuelt eller ved å kjøre en makroplugin. Lag en teoretisk punktspredningsfunksjon ved hjelp av ImageJ-plugin ved å klikke på Brytning PSF 3D, linse numerisk blenderåpning, fluorofor utslipp bølgelengde, pikselstørrelse og Z-avstand er nødvendig for å lage en nøyaktig PSF. Velg plugins, makroer, og kjør for å utføre batch parallell iterativ dekonvolusjon for alle tidspunkter ved hjelp av den medfølgende makroen.Importer alle dekonvolverte tidspunkter som en stakk ved å klikke fil, importere og deretter bildesekvens. Konverter stakken til en hyperstakk ved å klikke på bilde, hyperstakker og deretter stabler til hyperstakk. Legg til antall Z-stykker og tidsrammer, og korriger deretter 3D-driften ved hjelp av riktig 3D-drift-plugin.Lagre den korrigerte hyperstakken for 3D-drift, og konverter bildet tilbake til en vanlig stakk ved å klikke på bilde, hyperstakker, hyperstakk for å stable, og del deretter tidspunktene ved å klikke på deling av bilder, stabler, verktøy og stabler. Angi antall tidspunkter for antall delstakker som skal deles. Bruk satsvis behandling til å opprette en maksimal projeksjon for alle tidspoeng.Importer bildesekvensen for tidsforløp ved å klikke på fil, importere og deretter bildesekvens. Og bruk konvensjonelle ImageJ-verktøy for ønsket analyse av dekonvolvert og postbehandlet todimensjonal video, En høyoppløselig 3D-video av å utvikle stjerneskuddcelle dendritter ble anskaffet, dekonvolvert og korrigert for 3D-drift. Z-plan maksimale projeksjoner ble produsert for å lage 2D-videoer for analyse, som viser et område med dendritisk raffinement og et område med dendritisk utvekst.3D-dekonvolusjon av hvert tidspunkt økte oppløsningen av fine filopodia projeksjoner av enkelt P6 starburst amacrine celle før og etter dekonvolusjon med ImageJ. Langvarige AAV-infeksjonsperioder fører ikke nødvendigvis til økt fluorescerende signal som vist ved lignende nivåer av proteinuttrykk ved fem og 11 dager etter injeksjon. Det er viktig å redusere prøvedriften under avbildning.Driften minimeres ved å opprettholde en konsekvent bildetemperatur og ved å plassere vekten på prøven på riktig måte. Hvis det oppstår drift, tillater manuell anskaffelse av tidsserien justering av bildevolumet mellom rammer. Dette sikrer at funksjonene av interesse forblir i rammen.Denne protokollen produserer høyoppløselige, dekonvolverte og driftkorrigerte 3D-videoer av utviklende nevritter. Slike videoer fører til en bedre forståelse av nevronledninger og er pålagt å fremme beregningsanalysemetoder for 3D morfogenese. Bedre automatisk sporing og sporing av programvare er nødvendig for å oppnå høy gjennomstrømningsanalyse av nevrittutvikling.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Imaging neuronal Responses i Slice Produkter av vomeronasal Organ uttrykker en Genetisk Encoded Kalsium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse Imaging av Neuroblast Migrasjon i Akutt Skiver av Adult Mouse forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Nerve transection og Time-lapse Imaging av Glial Cell atferd Live Sebrafisk

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Langsiktig Time Lapse Imaging av Mouse Cochlea eksplantater

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-assosiert Virus 9 (AAV9) Vector Levering i voksne mus

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Metoder og tupper for intravenøs administrasjon av Adeno-assosiert Virus rotter og evaluering av sentralnervesystemet signaltransduksjon

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering og Live bildebehandling av Oligodendrocyte Organelles i Organotypic hjernen skiver Adeno-assosiert Virus og AC Confocal mikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Kvantitativ analyse av Neuronal dendrittiske Arborization kompleksitet i Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...