Name: time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Agradecemos a Madison Gray por me ajudar quando eu não tinha nenhuma. Esta pesquisa foi apoiada por um NSERC Discovery Grant (RGPIN-2016-06128), uma Sloan Fellowship in Neuroscience e uma Cadeira de Pesquisa do Canadá Nível 2 (para J.L.L). S. Ing-Esteves foi apoiado pelo Vision Science Research Program e NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral.

NOTA: Este protocolo abrange 2 dias com um período mínimo de 4 a 5 dias para transdução viral entre dias experimentais (Figura 1A). Os experimentos em animais são realizados de acordo com o Conselho Canadense de Diretrizes de Cuidados com Animais para Uso de Animais em Pesquisa e Cuidados Com Animais de Laboratório sob protocolos aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado animal do Laboratório de Serviços Animais do Hospital para Crianças Doentes (Toronto, Canadá).
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Este vídeo demonstra um pipeline experimental que utiliza ferramentas genéticas existentes para a dinâmica dendrite de imagem do desenvolvimento de neurônios da retina com imagens ao vivo confocal. Também são demonstradas injeções intraoculares de AAVs dependentes de Cre codificando proteínas fluorescentes direcionadas à membrana em camundongos neonatais. Células únicas de populações geneticamente direcionadas são brilhantemente rotuladas tão cedo quanto 4-5 dpi. Os suportes planos de retina foram prepara...

Dendritos de neurônios da retina formam padrões intrincados, mas específicos, que influenciam sua função dentro de circuitos neurais. Na retina vertebrada, diversos tipos de células gânglios da retina (RGCs) e interneurônios de células amacrinas possuem morfologias dendríticas únicas que diferem em tamanho, localização, comprimento do ramo e densidade1. Durante o desenvolvimento pós-natal, RGCs e células amacrinas estendem processos dendráticos exuberantes em um neuropiloto chamado camada plexiforme interna (IPL), onde recebem entradas de células bipolares transmitindo sinais fotorreceptores2. Como capturado por imagens de lapso de tempo de populações de retina fluorescentes rotuladas em larvas de filhotes ou zebrafish, a morfogênese dendrite é altamente dinâmica3,4,5. Em poucos dias, as arbóreas dendríticas expandem, remodelam e ramificam para subcamadas estreitas do IPL, onde sinapse com parceiros selecionados. As arbors apresentam dinâmicas estruturais diferentes sobre o desenvolvimento, com alterações nas taxas relativas de adição de filiais, retração e estabilização. Os dendritos amacrinos e RGC também apresentam diferentes comportamentos de crescimento e remodelação que podem refletir arborização específica do tipo. No entanto, esses estudos acompanharam populações de amacrinas ou RGC amplas e se concentraram na segmentação laminar, que é apenas um aspecto da morfologia.
Os mecanismos que produzem a vasta diversidade morfológica observada entre os subtipos da retina são mal compreendidos. O objetivo deste grupo foi desenvolver um método para capturar a dinâmica dendrite e a remodelação de arbor de subtipos de retina definidos em camundongos. Identificar mecanismos específicos do tipo celular de padronização de dendrite requer métodos para visualizar e medir comportamentos dendrite de células de interesse. Culturas organotípicas de retinas de camundongos são adequadas para estudos de imagem de células vivas usando microscopia confocal ou multifotífera. Retinas em desenvolvimento são dissecadas e montadas em uma explanta plana que pode ser imageda por várias horas em uma câmara de gravação ou cultivada ao longo de alguns dias com efeitos limitados no circuito6,7. Os neurônios de retina ao vivo podem ser rotulados por uma variedade de técnicas, incluindo preenchimento de corante por eletrodos, eletroporação, entrega biolística de partículas revestidas com corantes lipofílicos ou plasmídeos codificando proteínas fluorescentes (por exemplo, Gene Gun), bem como rótulos de células geneticamente codificadas7,8, 9,10 . No entanto, essas abordagens são ineficientes para a dinâmica de dendrite de imagem de subtipos específicos da retina. Por exemplo, os métodos de enchimento de corantes são de baixa produtividade e requerem aparelhos de eletrofisiologia e rótulos genéticos adicionais para direcionar de forma confiável células de interesse. Além disso, os fortes sinais de fluorescência na soma podem obscurecer dendritos próximos.
Métodos de entrega de genes biolísticos podem simultaneamente rotular dezenas de células, mas etapas que envolvem a entrega de partículas de alta pressão e a incubação noturna de retina isolada podem comprometer a fisiologia celular e o crescimento dendrático. Este artigo propõe que ferramentas genéticas recentes podem ser empregadas para capturar dinâmicas dendrita precoces com tipo celular e resolução estrutural, dados os seguintes critérios experimentais. Primeiro, para resolver os ramos finos e filopodia que dominam as árvores em desenvolvimento, o método deve rotular neurônios com proteínas brilhantes e fluorescentes que preenchem processos em toda a arbor. A rotulagem de fluorescência não deve desaparecer devido ao fotobleaching durante o período de imagem. Uma variedade de variantes de proteína fluorescente foram geradas e comparadas para adequação para imagens in vivo/ex vivo11 baseadas em brilho e fotoestabilidade. Em segundo lugar, as proteínas fluorescentes (XFPs) devem ser expressas em níveis suficientemente altos pelo estágio inicial da morfogênese dendrite, de modo que a estreita janela de desenvolvimento não seja perdida. Em análises de pontos de tempo estáticos na retina do camundongo, o desenvolvimento do dendrite ocorre durante a primeira semana pós-natal e inclui fases de crescimento, remodelação e estabilização10,12,13,14,15. Em terceiro lugar, o método deve levar à rotulagem seletiva ou a uma maior probabilidade de rotulagem da subpopulação neuronal de interesse. Em quarto lugar, a rotulagem da subpopulação alvo deve ser suficientemente escassa para que toda a árvore neuronal possa ser identificada e rastreada. Embora os subtipos de RGC e amacrine possam ser distinguidos por suas características morfológicas maduras e padrões de estratificação de IPL16,17,18,19,20, o desafio é identificar subtipos durante o desenvolvimento com base em estruturas imaturas. Essa tarefa é facilitada pela expansão de ferramentas transgênicas para rotular tipos específicos de células da retina durante o desenvolvimento.
Linhas transgênicas e de camundongos em que a expressão celular e temporal de proteínas fluorescentes ou Cre é determinada por elementos regulatórios genéticos são amplamente utilizadas para estudar os tipos de células da retina13,21,22,23. Observações-chave sobre padrões específicos de desenvolvimento de dendrítos de subtipo vieram de estudos de retinas de camundongos transgênicos em momentos estáticos10,14,24,25. O sistema Cre-Lox, em particular, permite a manipulação genética requintada e o monitoramento de subtipos usando uma variedade de repórteres, sensores e ativadores optogenéticos dependentes de recombinase. Essas ferramentas levaram a descobertas de programas moleculares específicos do subtipo e propriedades funcionais que estão por trás do conjunto do circuito de retina26,27,28,29,30. No entanto, eles ainda não foram aproveitados para estudar a dinâmica dendrite específica do subtipo na retina do rato. A rotulagem de baixa densidade pode ser alcançada combinando linhas de mouse Cre com transgênicos introduzidos por eletroporação ou por AAVs recombinantes. Se disponível, linhas cre indutíveis de tamoxifen ou estratégias genéticas interseccionais também podem ser usadas. Finalmente, a célula deve ser rotulada de forma minimamente invasiva e imageada usando parâmetros de aquisição para não comprometer o tecido ou interferir com a função celular necessária para morfogênese dendrita.
Apresentado aqui é um método para aplicar ferramentas transgênicas e microscopia confocal para investigar a dinâmica do dendrite em explants de retina de rato vivo. Linhas de camundongos transgênicos cre foram combinadas com vetores AAV que expressam proteínas fluorescentes após a recombinação de Cre, o que permite rotulagem esparsa de células de interesse da retina. As AAVs disponíveis comercialmente são entregues à retina neonatal por injeções intravitreal. Este artigo demonstra que os AAVs produzem expressões fluorescentes significativamente altas e específicas do tipo celular por 4 dpi, permitindo o acesso aos pontos de tempo pós-natal. Para ilustrar essa abordagem, o interneuron amacrina "starburst" cholinergic "starburst" foi rotulado pela entrega de Brainbow AAV em camundongos neonatais expressando o site de entrada de acetiltransferase de colina (ChAT)-internal ribosome (IRES)-Cre transgene, que está ativo na retina pós-natal inicial31,32. As células amacrinas starburst desenvolvem uma morfologia arbórea estereotipada e radial que é moldada pela auto-evasão dendrite mediada pelas protocadherinas agrupadas33,34. Este artigo mostra que a resolução de dendritos e filopodia de starburst é significativamente melhorada pelos XFPs para a membrana plasmática com a adição do motivo CAAX que sofre farnesylation, como usado para o Brainbow AAVs31. Finalmente, foram determinados protocolos de imagem e pós-processamento de lapso de tempo que produzem imagens de alta qualidade para reconstrução dendrito e quantificação morfométrica. Este protocolo pode ser usado para identificar fatores que controlam a morfogênese dendrita e para capturar vários comportamentos celulares na retina intacta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45185-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45186-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HABG01 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 50 &#215; 15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470313-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene disposable transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tip paint brush, size 3/0</td>
			<td>Conventional art supply store</td>
			<td></td>
			<td>Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-imaging incubation system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber polyethylene tubing, PE-160 10&#39;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel heater controller, Model TC-344C</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater controller cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CC-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large bath incubation chamber with slice support</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample anchor (Harps)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0260</td>
			<td>Sample anchor must be compatible with incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sloflo In-line Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Microliter Syringe Series 700, Removable Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)&#160;</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2453</td>
			<td>Addgene Plasmid #45185&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 
			1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2454</td>
			<td>Addgene Plasmid #45186</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF Dye content &#8805;85 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tattoo paste</td>
			<td>Ketchum MFG Co</td>
			<td>329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>PV-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>Supplier may vary depending on region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH35317.604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>Open source</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations

Descobrir mecanismos que padronizam as arboris dendríticas requer métodos para visualizar, imagem e analisar dendritos durante o desenvolvimento. A retina do rato é um poderoso sistema modelo para a investigação de mecanismos específicos do tipo celular de morfogênese neuronal e conectividade. A organização e a composição dos subtipos da retina estão bem definidas, e ferramentas genéticas estão disponíveis para acessar tipos específicos durante o desenvolvimento. Muitos tipos de células de retina também restringem seus dendritos e/ou axônios a camadas estreitas, o que facilita a imagem de lapso de tempo. As culturas de explant da retina do rato são adequadas para imagens de células vivas usando microscopia confocal ou multifotônio, mas métodos otimizados para dinâmica de dendrite de imagem com resolução temporal e estrutural são carentes. Apresentado aqui é um método para rotular e imaginar escassamente o desenvolvimento de populações específicas de retina marcadas pelo sistema Cre-Lox. Vírus associados a adeno (AAVs) comercialmente disponíveis (AAVs) usados aqui expressavam proteínas fluorescentes direcionadas à membrana de forma dependente de Cre. A entrega intraocular de AAVs em camundongos neonatais produz rotulagem fluorescente de tipos de células-alvo por 4-5 dias após a injeção (dpi). Os sinais fluorescentes de membrana são detectáveis por imagens confocal e resolvem estruturas e dinâmicas finas do ramo. Vídeos de alta qualidade que abrangem 2-4 h são adquiridos a partir de imagens de montagem plana de retina perfumadas com fluido cerebrospinal artificial oxigenado (aCSF). Também é fornecido um pipeline de pós-processamento de imagem para desconvolução e correção de deriva tridimensional (3D). Este protocolo pode ser usado para capturar vários comportamentos celulares na retina intacta e identificar novos fatores que controlam a morfogênese neurita. Muitas estratégias de desenvolvimento aprendidas na retina serão relevantes para a compreensão da formação de circuitos neurais em outros lugares do sistema nervoso central.

Usando o protocolo acima, um vídeo 3D de alta resolução de dendritos de células de explosão estelar em desenvolvimento foi adquirido, desconvolved e corrigido para deriva 3D. Foram produzidas projeções máximas de plano Z para fazer vídeos 2D para análise (Vídeo Suplementar 1, Figura 5A). A desconvolução 3D de cada ponto de tempo aumentou a resolução de projeções finas de filopodia (Figura 5B,C). Saliências fina...

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Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Aqui, apresentamos um método para investigar morfogênese neurita em explantes de retina de camundongos pós-natal por microscopia confocal de lapso de tempo. Descrevemos uma abordagem para rotulagem e aquisição esparsa de tipos de células da retina e seus processos finos usando vetores de vírus associados a adeno recombinantes que expressam proteínas fluorescentes direcionadas à membrana de forma dependente de Cre.

Imagem de lapso de tempo da arborização neuronal usando rotulagem de vírus associado adeno esparsa de populações de células de retina geneticamente direcionadas

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

A rotulagem e visualização de células únicas de árvores dendríticas ou axonais é necessária para estudar morfogênese neuronal. Ao rotular as arbors em desenvolvimento de forma minimamente invasiva, o tecido retiniano permanece saudável e adequado para imagens vivas confocal prolongadas. A principal vantagem deste método é a capacidade de visualizar arboris individuais com proteínas fluorescentes multicoloras dentro de quatro dias após a injeção.Isso torna possível estudar morfologias de arbor neonatal. Este protocolo de imagem e análise de injeção pode ser usado para estudar morfologias neuronais em todo o sistema nervoso central. O local apropriado de seleção e injeção de Cre deve ser determinado para atingir a população celular de interesse.Comece selecionando uma linha de mouse Cre para rotular as populações de células retinárias de interesse. Obtenha vírus AAV dependente de recombinase codificando proteínas fluorescentes. Para uma rotulagem ideal de processos finos, selecione vetores que expressem proteínas fluorescentes modificadas visando a membrana plasmática.Para a alíquota AAV no gelo, e prepare uma diluição de um a quatro AAV usando soro fisiológico estéril ou PBS. Para visualizar as injeções, colora a solução azul adicionando aproximadamente um microliter de 0,02% solução de corante FAST Green FCF para cada 15 microlitros de diluição AAV. Esterilize a área de injeção com 70% de etanol.Enchimento de micropipette com a diluição AAV usando uma microsinga. Sob um microscópio estereo, quebre a ponta da micropipette com uma agulha de calibre 30 para deslatar a ponta. Depois de anestesiar os camundongos neonatais, tatue suas patas com tinta de tatuagem usando uma agulha de calibre 30 para identificar os animais.Colete recortes de cauda para isolamento de DNA e genotipagem. Limpe a pele sobrepondo os olhos com 70% de etanol. Use uma agulha de calibre 30 para abrir a pálpebra fundida enquanto aplica pressão leve com os dedos para abrir o olho.Faça um pequeno buraco na córnea na junção da córnea esclera. Insira o micropipette de vidro no orifício e pressione o micro pedal do pé injetor duas a quatro vezes para injetar o AAV no espaço intravitreal. Remova lentamente a micropipette e confirme a injeção de AAV visualizando o corante azul na pupila.Depois de preparar a aCSF da retina como descrito no manuscrito do texto, oxigene o aCSF da retina borbulhando com carbogen por um mínimo de 15 minutos, em seguida, ajuste o pH para 7,4. Incorpore uma placa de Petri de 60 milímetros de diâmetro em uma bandeja de gelo e encha-a com aCSF de retina oxigenada. Coloque a placa de Petri cheia sob um microscópio estéreo.Em seguida, corte a aba das pálpebras do rato eutanizado para expor o olho. Use fórceps contundentes para enuclear os olhos e transferi-los para a aCSF de retina fria colocada sob o microscópio estéreo. Sob o microscópio estéreo, estabilize o olho apertando o nervo óptico usando o pedórbico dumont número cinco e faça um buraco no centro da córnea com uma agulha de calibre 30, em seguida, insira uma ponta da micro tesoura no orifício para fazer uma incisão do orifício até o fim da córnea.Repita fazer quatro fatias nas direções cardeais, criando quatro retalhos. Segure e puxe os dois retalhos adjacentes, descascando suavemente a esclera da retina para todos os retalhos de córnea. Em seguida, remova a lente do copo de retina usando os fórceps.Por fim, use micro tesouras para fazer quatro incisões radiais da borda da retina em direção ao nervo óptico, criando quatro pétalas iguais. Se usar filtros de membrana MCE cinza de grande diâmetro para montagem, corte o disco em quadrantes com aproximadamente um centímetro de diâmetro e coloque o disco MCE no centro de um papel filtro branco maior. Usando dois pincéis de tinta tamanho três por zero, vire um copo de retina em um pincel com o lado da célula gânglio da retina para baixo.Retire suavemente a retina do aCSF, certificando-se de que a tensão da água não rasgue a retina. Enquanto ainda segura a escova de tinta com a retina, mova a placa de Petri contendo aCSF para fora do caminho e coloque o papel filtro branco com a membrana MCE sob o estereoscópio. Usando uma pipeta de transferência, coloque uma gota de aCSF no centro do papel filtro MCE.Flutue a retina para a gotícula aCSF criada pela tensão superficial e membrana MCE carregada. Use pincéis de tinta para posicionar a retina dentro da gota com o lado da célula gânglio da retina para cima, em seguida, desdobre as quatro pétalas. Uma vez posicionado, crie uma ponte de água entre o pincel e o papel filtro branco para quebrar a tensão superficial da gotícula.Monte a câmara de incubação de imagens ao vivo e preencha-a com aCSF oxigenada. Ligue a bomba e o controlador de temperatura, certificando-se de que a temperatura não suba acima de 34 graus Celsius. Pode levar até uma hora para a temperatura da câmara estabilizar.Recomenda-se configurar a câmara de incubação antes de iniciar a dissecção da retina. A temperatura estável da câmara ajuda a reduzir a deriva da amostra. Para transferir o monte plano de retina para a câmara de perfusão, pare a bomba e remova o aCSF que está na câmara.Em seguida, coloque o disco MCE com o suporte plano de retina na câmara de incubação. Pré-molhar um peso amostral para quebrar a tensão da superfície e, em seguida, colocá-lo sobre o suporte plano garantindo que o peso da amostra seja colocado no papel MCE para reduzir a deriva amostral. Reabastecer a câmara com o aCSF aquecido e circular aCSF a aproximadamente um mililitro por minuto.Posicione a peça do nariz com o objetivo de mergulhar 25 vezes na câmara de imagem. Tela para células rotuladas de interesse usando luz epifluorescente, e ajustar o volume de imagem para capturar características dendríticas de interesse. Usando uma tabela de procuração que identifica pixels supersaturados e subsaturados, ajuste a potência do laser de modo que nenhum pixel esteja supersaturado.Adquira o volume de imagem 3D e repita a aquisição na taxa de quadros desejada. O volume de imagem pode ser ajustado entre cada ponto de tempo para compensar a deriva da amostra. Importe a série de imagens, dividindo as imagens pelo tempo.Economize todos os pontos de tempo manualmente ou executando um plugin macro. Crie uma função de spread de ponto teórico usando o plugin ImageJ clicando em Defraction PSF 3D, abertura numérica da lente, comprimento de onda de emissão de fluoroforeiro, tamanho do pixel e espaçamento Z são necessários para criar um PSF preciso.Importe todos os pontos de tempo desconvolvados como uma pilha clicando em arquivo, importação e sequência de imagem. Converta a pilha em um hipersepilante clicando em imagem, hipersilha e, em seguida, empilha para hiperstack. Adicione o número de fatias Z e prazos, em seguida, corrija a deriva 3D usando o plugin de deriva 3D correto.Salve o hipersedor corrigido em deriva 3D e converta a imagem de volta em uma pilha regular clicando em imagem, hipersilhadas, hipersemonia para empilhar e, em seguida, divida os pontos de tempo clicando em imagem, pilhas, ferramentas e divisor de pilhas. Para que o número de subssares seja dividido, digite o número de pontos de tempo. Use o processamento em lote para criar uma projeção máxima para todos os pontos de tempo.Importe a sequência de imagem de lapso de tempo clicando no arquivo, importe e, em seguida, sequência de imagem. E use ferramentas convencionais imageJ para a análise desejada de vídeo bidimensional desconvolved e pós-processado, um vídeo 3D de alta resolução de dendritos de células de explosão estelar foi adquirido, desconvolved e corrigido para deriva 3D. Foram produzidas projeções máximas de plano Z para fazer vídeos 2D para análise, mostrando uma área de refinamento dendrático e uma área de crescimento dendrático.A desconvolução 3D de cada ponto de tempo aumentou a resolução de projeções finas de filopodia fina de célula amacrina p6 única antes e depois da desconvolução com ImageJ. Períodos prolongados de infecção por AAV não levam necessariamente ao aumento do sinal fluorescente, como mostrado por níveis semelhantes de expressão proteica em cinco e 11 dias após a injeção. Reduzir a deriva da amostra durante a imagem é importante.A deriva é minimizada pela manutenção de uma temperatura de imagem consistente e pelo posicionamento adequado do peso na amostra. Se ocorrer deriva, a aquisição manual da série temporal permite o ajuste do volume de imagem entre os quadros. Isso garante que as características de interesse permaneçam no quadro.Este protocolo produz vídeos 3D de alta resolução, desconvolved e corrige à deriva de neurites em desenvolvimento. Tais vídeos levam a uma melhor compreensão da fiação dos neurônios e são necessários para avançar os métodos de análise computacional da morfogênese 3D. Melhores softwares de rastreamento e rastreamento automáticos são necessários para obter uma análise de alto rendimento do desenvolvimento de neurite.

Research

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Neuroscience

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Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Vedação subjugada Adeno-associada do vírus 9 (AAV9) em ratos adultos

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus Adeno-associado aos ratos e avaliação do sistema nervoso Central transdução

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualização e imagem ao vivo do Oligodendrocyte organelas em fatias Organotypic cérebro usando microscopia Confocal e vírus Adeno-associado

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Análise quantitativa da arborização dendrítica Neuronal complexidade em Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...