Name: time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Мы благодарим Мэдисон Грей за то, что она протянула мне руку, когда у меня ее не было. Это исследование было поддержано грантом NSERC Discovery Grant (RGPIN-2016-06128), стипендией Слоуна в области неврологии и канадской исследовательской кафедрой Tier 2 (для J.L.L.L). S. Ing-Esteves был поддержан Программой исследований в области науки о зрении и NSERC Postgraduate Scholarships-Doctorals.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол охватывает 2 дня с минимальным периодом 4-5 дней для вирусной трансдукции между экспериментальными днями (рисунок 1A). Эксперименты на животных проводятся в соответствии с Руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными для испо?...

Это видео демонстрирует экспериментальный конвейер, который использует существующие генетические инструменты для изображения динамики дендритов развивающихся нейронов сетчатки с помощью конфокальной живой визуализации. Также продемонстрированы внутриглазные инъекции Cre-зависимы...

Дендриты нейронов сетчатки образуют сложные, но специфические паттерны, которые влияют на их функцию в нейронных цепях. В сетчатке позвоночных различные типы ганглиозных клеток сетчатки (RGC) и интернейроны амакриновых клеток имеют уникальную дендритную морфологию, которая отличается размером беседки, расположением, длиной ветвей и плотностью1. Во время постнатального развития RGC и амакриновые клетки распространяют обильные дендритные процессы в нейропил, называемый внутренним плексиформным слоем (IPL), где они получают биполярные клеточные входы, передающие сигналы фоторецепторов2. С учетом покадровой визуализации флуоресцентно меченых популяций сетчатки у личинок цыплят или рыбок данио, морфогенез дендритов очень динамичен3,4,5. В течение нескольких дней дендритные беседки расширяются, реконструируются и разветвляются до узких подслоев IPL, где они синапсируются с избранными партнерами. Беседки демонстрируют различную структурную динамику над развитием, с изменениями относительных скоростей добавления ветвей, втягивания и стабилизации. Дендриты амакрина и RGC также демонстрируют различное поведение роста и ремоделирования, которое может отражать типоспецифическую арборизацию. Тем не менее, эти исследования отслеживали широкие популяции амакрина или RGC и были сосредоточены на ламинарном нацеливании, которое является лишь одним из аспектов морфологии.
Механизмы, которые производят огромное морфологическое разнообразие, наблюдаемое среди подтипов сетчатки, плохо изучены. Целью этой группы была разработка метода захвата динамики дендритов и ремоделирования беседки определенных подтипов сетчатки у мышей. Идентификация специфических для типа клеток механизмов дендритового паттерна требует методов визуализации и измерения дендритового поведения интересующих клеток. Органотипические культуры сетчатки мышей хорошо подходят для исследований изображений живых клеток с использованием конфокальной или многофотонной микроскопии. Развивающиеся сетчатки рассекаются и монтируются в плоскую эксплант, которая может быть изображена в течение нескольких часов в записывающей камере или культивирована в течение нескольких дней с ограниченным воздействием на схему6,7. Живые нейроны сетчатки могут быть помечены различными методами, включая заполнение красителем электродами, электропорацию, биолистическую доставку частиц, покрытых липофильными красителями или плазмидами, кодирующими флуоресцентные белки (например, Gene Gun), а также генетически закодированные клеточные метки7,8,9,10 . Однако эти подходы неэффективны для визуализации динамики дендритов конкретных подтипов сетчатки. Например, методы наполнения красителем имеют низкую пропускную способность и требуют электрофизиологического аппарата и дополнительных генетических меток для надежного нацеливания на интересующие клетки. Кроме того, сильные флуоресцентные сигналы в соме могут скрывать близлежащие дендриты.
Биолистические методы доставки генов могут одновременно маркировать десятки клеток, но этапы, включающие доставку частиц высокого давления и ночную инкубацию изолированной сетчатки, могут поставить под угрозу физиологию клеток и дендритный рост. В этой статье предполагается, что последние генетические инструменты могут быть использованы для захвата ранней динамики дендритов с типом клеток и структурным разрешением, учитывая следующие экспериментальные критерии. Во-первых, чтобы разрешить тонкие ветви и филоподии, которые доминируют над развивающимися беседками, метод должен маркировать нейроны яркими, флуоресцентными белками, которые заполняют процессы во всей беседке. Флуоресцентная маркировка не должна исчезать из-за фотоотбеливания в течение периода визуализации. Различные варианты флуоресцентных белков были сгенерированы и сравнены на предмет пригодности для визуализации in vivo/ex vivo11 на основе яркости и фотостабильности. Во-вторых, флуоресцентные белки (XFP) должны быть выражены на достаточно высоких уровнях на самой ранней стадии морфогенеза дендритов, чтобы не пропустить узкое окно развития. При анализе статических временных точек в сетчатке мыши развитие дендрита происходит в течение первой постнатальной недели и включает фазы роста, ремоделирования и стабилизации10,12,13,14,15. В-третьих, метод должен привести к селективной маркировке или к повышенной вероятности маркировки интересующей нейронной субпопуляции. В-четвертых, маркировка целевой субпопуляции должна быть достаточно разреженной, чтобы можно было идентифицировать и проследить всю нейрональную беседку. Хотя подтипы RGC и amacrine можно отличить по их зрелым морфологическим характеристикам и моделям стратификации IPL16,17,18,19,20, задача состоит в том, чтобы идентифицировать подтипы во время развития на основе незрелых структур. Этой задаче способствует расширение трансгенных инструментов для маркировки конкретных типов клеток сетчатки во время развития.
Трансгенные и мышиные линии, в которых клеточная и временная экспрессия флуоресцентных белков или Cre определяется регуляторными элементами генов, широко используются для изучения типов клеток сетчатки13,21,22,23. Основные наблюдения за субтип-специфическими паттернами развития дендритов были получены из исследований трансгенных сетчаток мыши в статических точках времени10,14,24,25. Система Cre-Lox, в частности, позволяет осуществлять изысканные манипуляции с генами и мониторинг подтипов с использованием различных рекомбиназозависимых репортеров, датчиков и оптогенетических активаторов. Эти инструменты привели к открытию подтип-специфических молекулярных программ и функциональных свойств, которые лежат в основе сборки схем сетчатки26,27,28,29,30. Тем не менее, их еще предстоит использовать для изучения подтип-специфической динамики дендритов в сетчатке мыши. Маркировка низкой плотности может быть достигнута путем объединения линий мыши Cre с трансгенами, введенными электропорацией или рекомбинантными AAV. При наличии также могут быть использованы тамоксифен-индуцируемые линии Cre или интерсекциональные генетические стратегии. Наконец, клетка должна быть помечена минимально инвазивным способом и визуализирована с использованием параметров приобретения, чтобы не компрометировать ткань или не вмешиваться в клеточную функцию, необходимую для морфогенеза дендрита.
Здесь представлен метод применения трансгенных инструментов и конфокальной микроскопии для исследования динамики дендритов в живых эксплантах сетчатки живых мышей. Трансгенные линии мыши Cre были объединены с векторами AAV, которые экспрессируют флуоресцентные белки при рекомбинации Cre, что позволяет разреженно маркировать интересующие клетки сетчатки. Коммерчески доступные AAV доставляются в неонатальную сетчатку с помощью интравитреальных инъекций. В этой статье показано, что AAV производят значительно высокую и специфическую для типа клеток флуоресцентную экспрессию на 4 dpi, что позволяет получить доступ к постнатальным временным точкам. Чтобы проиллюстрировать этот подход, холинергический «звездообразующий» интернейрон амакрина был помечен путем доставки Brainbow AAV у неонатальных мышей, экспрессирующих холинацетилтрансферазу (ChAT)-внутренний сайт входа рибосомы (IRES)-Трансген Cre, который активен в ранней постнатальной сетчатке31,32. Звездообразующие амакриновые клетки развивают стереотипную и радиальную морфологию беседки, которая формируется дендрритным самоизбытием, опосредованным кластеризованными протокадгеринами33,34. В данной работе показано, что разрешение звездообразования дендритов и филоподий значительно улучшается XFP к плазматической мембране с добавлением мотива CAAX, который подвергается фарнезилированию, как это используется для Brainbow AAVs31. Наконец, были определены протоколы покадровой визуализации и постобработки, которые дают высококачественные изображения, поддающиеся реконструкции дендритов и морфометрической количественной оценке. Этот протокол может быть использован для идентификации факторов, контролирующих морфогенез дендритов, и для захвата нескольких клеточных поведений в интактной сетчатке.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45185-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45186-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HABG01 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 50 &#215; 15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470313-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene disposable transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tip paint brush, size 3/0</td>
			<td>Conventional art supply store</td>
			<td></td>
			<td>Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-imaging incubation system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber polyethylene tubing, PE-160 10&#39;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel heater controller, Model TC-344C</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater controller cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CC-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large bath incubation chamber with slice support</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample anchor (Harps)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0260</td>
			<td>Sample anchor must be compatible with incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sloflo In-line Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Microliter Syringe Series 700, Removable Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)&#160;</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2453</td>
			<td>Addgene Plasmid #45185&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 
			1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2454</td>
			<td>Addgene Plasmid #45186</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF Dye content &#8805;85 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tattoo paste</td>
			<td>Ketchum MFG Co</td>
			<td>329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>PV-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>Supplier may vary depending on region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH35317.604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>Open source</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations

Обнаружение механизмов, которые формируют дендритные беседки, требует методов визуализации, изображения и анализа дендритов во время развития. Сетчатка мыши является мощной модельной системой для исследования специфических для типа клеток механизмов морфогенеза и связности нейронов. Организация и состав подтипов сетчатки четко определены, и генетические инструменты доступны для доступа к конкретным типам во время развития. Многие типы клеток сетчатки также ограничивают свои дендриты и / или аксоны узкими слоями, что облегчает покадровую визуализацию. Эксплантные культуры сетчатки мышей хорошо подходят для визуализации живых клеток с использованием конфокальной или многофотонной микроскопии, но методы, оптимизированные для визуализации динамики дендритов с временным и структурным разрешением, отсутствуют. Здесь представлен метод разреженной маркировки и изображения развития специфических популяций сетчатки, отмеченных системой Cre-Lox. Коммерчески доступные аденоассоциированные вирусы (AAV), используемые здесь, экспрессировали мембранно-целевые флуоресцентные белки cre-зависимым образом. Внутриглазная доставка AAV у неонатальных мышей производит флуоресцентную маркировку целевых типов клеток через 4-5 дней после инъекции (dpi). Мембранные флуоресцентные сигналы обнаруживаются с помощью конфокальной визуализации и разрешают тонкие ветви структур и динамику. Высококачественные видео, охватывающие 2-4 часа, получены из плоских креплений сетчатки, перфузированных оксигенированной искусственной спинномозговой жидкостью (aCSF). Также предоставляется конвейер постобработки изображений для деконволюции и трехмерной (3D) коррекции дрейфа. Этот протокол может быть использован для захвата нескольких клеточных поведений в интактной сетчатке и для выявления новых факторов, контролирующих морфогенез нейритов. Многие стратегии развития, изученные в сетчатке, будут иметь отношение к пониманию формирования нейронных цепей в других частях центральной нервной системы.

Используя вышеуказанный протокол, было получено, деконволюционное и скорректировано для 3D-дрейфа 3D-видео с высоким разрешением разработки дендритов звездообразующих клеток. Максимальные проекции Z-плоскости были созданы для создания 2D-видео для анализа (Дополнительное видео 1</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Здесь мы представляем метод исследования морфогенеза нейритов в постнатальных эксплантах сетчатки мышей методом покадровой конфокальной микроскопии. Описан подход к разреженной маркировке и приобретению типов клеток сетчатки и их тонких процессов с использованием рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов, которые экспрессируют мембранно-целевые флуоресцентные белки cre-зависимым образом.

Покадровая визуализация арборизации нейронов с использованием разреженной аденоассоциированной вирусной маркировки генетически целевых популяций клеток сетчатки

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Для изучения морфогенеза нейронов требуется одноклеточная маркировка и визуализация дендритарных или аксональных беседок. Маркируя развивающиеся беседки минимально инвазивным способом, ткань сетчатки остается здоровой и подходящей для длительной конфокальной живой визуализации. Основным преимуществом данного метода является возможность визуализации отдельных беседок с многоцветными флуоресцентными белками в течение четырех дней после инъекции.Это делает возможным изучение морфологии неонатальной беседки. Этот протокол визуализации и анализа инъекций может быть использован для изучения морфологии нейронов в центральной нервной системе. Соответствующий выбор Cre и место инъекции должны быть определены для нацеливания на интересующую популяцию клеток.Начните с выбора линии мыши Cre, чтобы пометить интересующие популяции клеток сетчатки. Получают рекомбиназно-зависимый вирус AAV, кодирующий флуоресцентные белки. Для оптимальной маркировки тонких процессов выбирайте векторы, которые экспрессируют модифицированные флуоресцентные белки, нацеленные на плазматическую мембрану.Для аликвоты AAV на льду и приготовьте разбавление от одного до четырех AAV с использованием стерильного физиологического раствора или PBS. Чтобы визуализировать инъекции, окрасьте раствор в синий цвет, добавив примерно один микролитр 0,02% раствора красителя FAST Green FCF на каждые 15 микролитров разведения AAV. Стерилизуют область инъекции 70% этанолом.Засыпьте микропипетку разбавлением AAV с помощью микрошприца. Под стереомикроскопом разбейте наконечник микропипетки иглой 30-го калибра, чтобы распечатать наконечник. После обезболивания неонатальных мышей татуируйте их подушечки лап чернилами для татуировки, используя иглу 30-го калибра для идентификации животных.Собирайте обрезки хвоста для выделения ДНК и генотипирования. Смажьте кожу, покрывающую глаза, 70% этанолом. Используйте иглу 30-го калибра, чтобы открыть сросшееся веко, применяя легкое давление пальцами, чтобы открыть глаз.Проткните небольшое отверстие через роговицу в соединении роговицы. Вставьте стеклянную микропипетку в отверстие и нажмите на ножную педаль микроинжектора два-четыре раза, чтобы ввести AAV в интравитреальное пространство. Медленно удалите микропипетку и подтвердите инъекцию AAV, визуализируя синий краситель в зрачке.После приготовления aCSF сетчатки, как описано в тексте рукописи, насытите оксигеном aCSF сетчатки, пузыря карбогеном в течение минимум 15 минут, затем отрегулируйте рН до 7,4. Вставьте чашку Петри диаметром 60 миллиметров в лоток для льда и наполните ее насыщенным кислородом сетчаткой aCSF. Поместите заполненную чашку Петри под стереомикроскоп.Затем отрежьте лоскут век усыпленной мыши, чтобы обнажить глаз. Используйте тупые щипцы для энуклеации глаз и переноса их в холодную сетчатку aCSF, помещенную под стереомикроскоп. Под стереомикроскопом стабилизируйте глаз, обхватив зрительный нерв с помощью щипцов числа пять Дюмона и проткните отверстие в центре роговицы иглой 30 калибра, затем вставьте один кончик микроножек в отверстие, чтобы сделать разрез от отверстия до конца роговицы.Повторите, чтобы сделать четыре среза по сторонам света, создав четыре створки. Схватите и раздвиньте два соседних лоскута, аккуратно отшелушивая склеру от сетчатки для всех лоскутов роговицы. Затем снимите хрусталик с чашечки сетчатки с помощью щипцов.Наконец, используйте микроножницы, чтобы сделать четыре радиальных разреза от края сетчатки к зрительному нерву, создав четыре равных лепестка. Если для монтажа используются серые мембранные фильтры MCE большого диаметра, разрежьте диск на квадранты примерно на один сантиметр в поперечнике, а затем поместите диск MCE в центр более крупной белой фильтровальной бумаги. Используя две кисти третьего размера на ноль, переверните одну чашку сетчатки на кисть с ганглиями сетчатки стороной вниз.Осторожно поднимите сетчатку из aCSF, убедившись, что натяжение воды не разрывает сетчатку. Все еще удерживая кисть с сетчаткой, переместите чашку Петри, содержащую aCSF, в сторону и поместите белую фильтровальную бумагу с мембраной MCE под стереоскоп. Используя трансферную пипетку, поместите каплю aCSF в центр фильтровальной бумаги MCE.Поместите сетчатку в каплю aCSF, созданную поверхностным натяжением и заряженной мембраной MCE. Используйте кисти, чтобы расположить сетчатку внутри капли с ганглиозной клеткой сетчатки стороной вверх, затем разверните четыре лепестка. После позиционирования создайте водный мост между кистью и белой фильтровальной бумагой, чтобы разрушить поверхностное натяжение капли.Соберите инкубационную камеру с живым изображением и заполните ее насыщенной кислородом aCSF. Включите насос и регулятор температуры, следя за тем, чтобы температура не поднималась выше 34 градусов по Цельсию. Для стабилизации температуры в камере может потребоваться до часа.Рекомендуется установить инкубационную камеру перед началом рассечения сетчатки. Стабильная температура камеры помогает уменьшить дрейф образцов. Чтобы перенести плоскую насыпь сетчатки в перфузионную камеру, остановите насос и удалите aCSF, который находится в камере.Затем поместите диск MCE с плоским креплением сетчатки в инкубационную камеру. Предварительно смочите вес образца, чтобы преодолеть поверхностное натяжение, затем поместите его на плоское крепление, гарантируя, что вес образца помещается на бумагу MCE для уменьшения дрейфа образца. Наполните камеру нагретым aCSF и циркулируйте aCSF со скоростью примерно один миллилитр в минуту.Поместите носовую часть с 25-кратным водоопрокидывающим объективом в камеру визуализации. Экран для метких клеток, представляющих интерес, с использованием эпифлуоресцентного света и регулировка объема изображения для захвата дендритных особенностей, представляющих интерес. Используя таблицу подстановки, которая идентифицирует как перенасыщенные, так и недонасыщенные пиксели, настройте мощность лазера таким образом, чтобы ни один пиксель не был перенасыщен.Получение объема 3D-изображения и повторная съемка с требуемой частотой кадров. Объем изображения можно регулировать между каждой точкой времени, чтобы компенсировать дрейф образца. Импортируйте серию изображений, разбивая изображения по времени.Сохраняйте все точки времени вручную или с помощью плагина макросов. Создайте теоретическую функцию разброса точек с помощью плагина ImageJ, щелкнув Defraction PSF 3D, числовая диафрагма объектива, длина волны флуорофорного излучения, размер пикселя и Z-интервал необходимы для создания точного PSF. Выберите плагины, макросы и запустите для выполнения пакетной параллельной итеративной деконволюции для всех временных точек с использованием предоставленного макроса.Импортируйте все деконволюционные временные точки в виде стека, щелкнув файл, импорт, а затем последовательность изображений. Преобразуйте стек в гиперстек, щелкнув изображение, гиперстеки, а затем стеки в гиперстек. Добавьте количество Z-срезов и таймфреймов, затем исправьте 3D-дрейф с помощью правильного плагина 3D-дрейфа.Сохраните гиперстек с исправленным 3D-дрейфом и преобразуйте изображение обратно в обычный стек, щелкнув изображение, гиперстеки, гиперстек в стек, а затем разделите временные точки, щелкнув изображение, стеки, инструменты и сплиттер стеков. Чтобы указать количество разделенных подстеков, введите количество точек времени. Используйте пакетную обработку для создания максимальной проекции для всех временных точек.Импортируйте последовательность изображений замедленной съемки, щелкнув файл, импорт, затем последовательность изображений. И использовать обычные инструменты ImageJ для желаемого анализа деконволюционного и постобработанного двухмерного видео, Было получено, деконволюционно и скорректировано для 3D-дрейфа 3D-видео с высоким разрешением развивающихся дендритов звездообразующих клеток. Были получены максимальные проекции Z-плоскости для создания 2D-видео для анализа, показывающие область дендритной утонченности и область дендритного роста.3D-деконволюция каждой точки времени увеличивала разрешение тонких проекций филоподий одиночной амакриновой ячейки P6 до и после деконволюции с ImageJ. Длительные периоды заражения AAV не обязательно приводят к увеличению флуоресцентного сигнала, о чем свидетельствуют аналогичные уровни экспрессии белка через пять и 11 дней после инъекции. Важно уменьшить дрейф образцов во время визуализации.Дрейф сводится к минимуму за счет поддержания постоянной температуры изображения и надлежащего позиционирования веса на образце. Если происходит дрейф, ручное получение временных рядов позволяет регулировать объем изображения между кадрами. Это гарантирует, что интересующие особенности останутся в кадре.Этот протокол создает 3D-видео с высоким разрешением, деконволюцией и дрейфом разработки нейритов. Такие видео приводят к лучшему пониманию нейронной проводки и необходимы для продвижения методов вычислительного анализа 3D-морфогенеза. Для достижения высокопроизводительного анализа разработки нейритов требуется более совершенное программное обеспечение для автоматического отслеживания и отслеживания.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Внутричерепное Инъекция адено-ассоциированные вирусные векторы

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Органотипической Анализ фрагментов для высокого разрешения Time-Lapse Визуализация миграции нейронов в послеродовой мозга

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Изображений нейронов Ответы на фрагмент Препараты вомероназального орган выражения генетически закодированные Кальций датчика

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Покадровый Визуализация нейробластов миграции в остром ломтики мозга взрослых мышей

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Мотор Перерезка нерва и Покадровый Визуализация глиальных клеточных поведений в Живом данио рерио

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Долгосрочный длительной Визуализация мыши Cochlear эксплантов

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Субпиальный адено-ассоциированный вирус 9 (AAV9) Доставка векселей для взрослых мышей

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Методы и советы для внутривенного введения аденоассоциированный вирус для крыс и оценки трансдукции центральной нервной системы

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Визуализация и живой изображений Олигодендроциты органелл в Organotypic мозга фрагментов с помощью аденоассоциированный вирус и конфокальная микроскопия

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Количественный анализ сложности нейрональных дендритных арборизация у дрозофилы

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...