Name: time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Agradecemos a Madison Gray por darme una mano cuando no tenía ninguna. Esta investigación fue apoyada por una beca de descubrimiento de NSERC (RGPIN-2016-06128), una beca Sloan en neurociencia y una cátedra de investigación de Canadá Nivel 2 (a J.L.L). S. Ing-Esteves fue apoyado por el Programa de Investigación de Ciencias de la Visión y las Becas de Postgrado-Doctorado de NSERC.

NOTA: Este protocolo abarca 2 días con un período mínimo de 4-5 días para la transducción viral entre días experimentales (Figura 1A). Los experimentos con animales se realizan de acuerdo con las Directrices del Consejo Canadiense de Cuidado animal para el uso de animales en investigación y cuidado de animales de laboratorio bajo protocolos aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Laboratorio de Servicios para Animales en el Hospital para Niños Enfermos (Toronto, Can...

Este video muestra una tubería experimental que utiliza las herramientas genéticas existentes para obtener imágenes de la dinámica de las dendritas del desarrollo de las neuronas de la retina con imágenes en vivo confocales. También se han demostrado las inyecciones intraoculares de AAV dependientes de Cre que codifican proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana en ratones neonatales. Las células individuales de poblaciones genéticamente dirigidas están brillantemente etiquetadas tan pronto como 4-5 dpi. S...

Las dendritas de las neuronas de la retina forman patrones intrincados, pero específicos, que influyen en su función dentro de los circuitos neuronales. En la retina de los vertebrados, diversos tipos de células ganglionares retinianas (RGC) e interneuronas de células amacrinas tienen morfologías dendríticas únicas que difieren en tamaño del cenador, ubicación, longitud de la rama y densidad1. Durante el desarrollo postnatal, las RGC y las células amacrinas extienden procesos dendríticos exuberantes en un neuropil llamado capa plexiforme interna (IPL), donde reciben entradas de células bipolares que transmiten señales fotorreceptoras2. Según lo capturado por imágenes de lapso de tiempo de poblaciones retinianas marcadas fluorescentemente en larvas de pollitos o peces cebra, la morfogénesis de dendritas es altamente dinámica3,4,5. En cuestión de días, los cenadores dendríticos se expanden, remodelan y ramifican a subcapas estrechas de la IPL, donde hacen sinapsis con socios seleccionados. Los cenadores exhiben diferentes dinámicas estructurales a lo largo del desarrollo, con cambios en las tasas relativas de adición, retracción y estabilización de ramas. Las dendritas amacrinas y RGC también exhiben diferentes comportamientos de crecimiento y remodelación que podrían reflejar la arborización específica del tipo. Sin embargo, estos estudios rastrearon amplias poblaciones de amacrina o RGC y se centraron en la orientación laminar, que es solo un aspecto de la morfología.
Los mecanismos que producen la vasta diversidad morfológica observada a través de los subtipos de retina son poco conocidos. El objetivo de este grupo fue desarrollar un método para capturar la dinámica de las dendritas y la remodelación del cenador de subtipos retinianos definidos en ratones. La identificación de mecanismos específicos del tipo de célula de patrón de dendritas requiere métodos para visualizar y medir el comportamiento de las dendritas de las células de interés. Los cultivos organotípicos de retinas de ratón son adecuados para estudios de imágenes de células vivas que utilizan microscopía confocal o multifotónica. Las retinas en desarrollo se diseccionan y se montan en un explante plano que puede ser fotografiado durante varias horas en una cámara de grabación o cultivado durante unos días con efectos limitados en el circuito6,7. Las neuronas retinianas vivas pueden ser marcadas por una variedad de técnicas, incluyendo el llenado de tinte por electrodos, electroporación, entrega biolística de partículas recubiertas con colorantes lipofílicos o plásmidos que codifican proteínas fluorescentes (por ejemplo, Gene Gun), así como etiquetas celulares codificadas genéticamente7,8,9,10 . Sin embargo, estos enfoques son ineficientes para la dinámica de las dendritas por imágenes de subtipos específicos de retina. Por ejemplo, los métodos de llenado de colorantes son de bajo rendimiento y requieren aparatos de electrofisiología y etiquetas genéticas adicionales para dirigirse de manera confiable a las células de interés. Además, las fuertes señales de fluorescencia en el soma pueden oscurecer las dendritas cercanas.
Los métodos de administración de genes biolísticos pueden etiquetar simultáneamente docenas de células, pero los pasos que involucran la entrega de partículas a alta presión y la incubación nocturna de retina aislada pueden comprometer la fisiología celular y el crecimiento dendrítico. Este artículo propone que se pueden emplear herramientas genéticas recientes para capturar la dinámica temprana de las dendritas con el tipo de célula y la resolución estructural, dados los siguientes criterios experimentales. Primero, para resolver las ramas finas y los filopodios que dominan los cenadores en desarrollo, el método debe etiquetar las neuronas con proteínas brillantes y fluorescentes que llenan los procesos en todo el cenador. El etiquetado de fluorescencia no debe desvanecerse debido al fotoblanqueo durante el período de obtención de imágenes. Se han generado y comparado una variedad de variantes de proteínas fluorescentes para la idoneidad de las imágenes in vivo/ex vivo11 basadas en el brillo y la fotoestabilidad. En segundo lugar, las proteínas fluorescentes (PFX) deben expresarse en niveles suficientemente altos en la etapa más temprana de la morfogénesis de la dendrita, de modo que no se pierda la estrecha ventana de desarrollo. En los análisis de puntos de tiempo estáticos en la retina del ratón, el desarrollo de dendritas ocurre durante la primera semana postnatal e incluye fases de crecimiento, remodelación y estabilización10,12,13,14,15. En tercer lugar, el método debe conducir a un etiquetado selectivo o a una mayor probabilidad de etiquetado de la subpoblación neuronal de interés. En cuarto lugar, el etiquetado de la subpoblación objetivo debe ser lo suficientemente escaso como para que se pueda identificar y rastrear todo el cenador neuronal. Aunque los subtipos RGC y amacrina pueden distinguirse por sus características morfológicas maduras y patrones de estratificación de IPL16,17,18,19,20, el desafío es identificar subtipos durante el desarrollo basados en estructuras inmaduras. Esta tarea se ve facilitada por la expansión de herramientas transgénicas para etiquetar tipos específicos de células de la retina durante el desarrollo.
Las líneas de ratón transgénicos y knock-in en las que la expresión celular y temporal de proteínas fluorescentes o Cre está determinada por elementos reguladores de genes son ampliamente utilizadas para estudiar tipos de células retinianas13,21,22,23. Las observaciones clave sobre los patrones específicos de subtipo de desarrollo de dendritas provienen de estudios de retinas de ratones transgénicos en puntos de tiempo estáticos10,14,24,25. El sistema Cre-Lox, en particular, permite una exquisita manipulación genética y monitoreo de subtipos utilizando una variedad de reporteros, sensores y activadores optogenéticos dependientes de la recombinasa. Estas herramientas han llevado a descubrimientos de programas moleculares específicos de subtipos y propiedades funcionales que subyacen al ensamblaje del circuito retiniano26,27,28,29,30. Sin embargo, aún no se han aprovechado para estudiar la dinámica de las dendritas específicas del subtipo en la retina del ratón. El etiquetado de baja densidad se puede lograr combinando líneas de ratón Cre con transgenes introducidos por electroporación o por AAV recombinantes. Si está disponible, también se pueden usar líneas de Cre inducibles por tamoxifeno o estrategias genéticas interseccionales. Finalmente, la célula debe ser etiquetada de una manera mínimamente invasiva y fotografiada utilizando parámetros de adquisición para no comprometer el tejido o interferir con la función celular requerida para la morfogénesis de la dendrita.
Aquí se presenta un método para aplicar herramientas transgénicas y microscopía confocal para investigar la dinámica de las dendritas en explantes de retina de ratones vivos. Las líneas de ratón transgénico Cre se han combinado con vectores AAV que expresan proteínas fluorescentes tras la recombinación de Cre, lo que permite un etiquetado escaso de las células de la retina de interés. Los AAV disponibles comercialmente se administran a la retina neonatal mediante inyecciones intravítreas. Este artículo demuestra que los AAV producen una expresión fluorescente significativamente alta y específica del tipo celular en 4 dpi, lo que permite el acceso a los puntos de tiempo postnatales. Para ilustrar este enfoque, la interneurona colinérgica "starburst" amacrina fue marcada mediante la administración de Brainbow AAV en ratones neonatales que expresan el transgén de colina acetiltransferasa (ChAT)-ribosoma interno (IRES)-Cre, que es activo en la retina postnatal temprana31,32. Las células amacrinas starburst desarrollan una morfología estereotipada y radial del cenador que está formada por la autoevitabilidad de las dendritas mediada por las protocadherinas agrupadas33,34. Este artículo muestra que la resolución de las dendritas y filopodias de estallido estelar se mejora significativamente mediante XFP a la membrana plasmática con la adición del motivo CAAX que sufre farnesilación, como se utiliza para los AAV de Brainbow31. Finalmente, se han determinado los protocolos de imágenes de lapso de tiempo y post-procesamiento que producen imágenes de alta calidad susceptibles de reconstrucción de dendritas y cuantificación morfométrica. Este protocolo se puede utilizar para identificar factores que controlan la morfogénesis de las dendritas y para capturar varios comportamientos celulares en la retina intacta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45185-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45186-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HABG01 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 50 &#215; 15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470313-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene disposable transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tip paint brush, size 3/0</td>
			<td>Conventional art supply store</td>
			<td></td>
			<td>Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-imaging incubation system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber polyethylene tubing, PE-160 10&#39;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel heater controller, Model TC-344C</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater controller cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CC-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large bath incubation chamber with slice support</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample anchor (Harps)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0260</td>
			<td>Sample anchor must be compatible with incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sloflo In-line Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Microliter Syringe Series 700, Removable Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)&#160;</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2453</td>
			<td>Addgene Plasmid #45185&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 
			1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2454</td>
			<td>Addgene Plasmid #45186</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF Dye content &#8805;85 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tattoo paste</td>
			<td>Ketchum MFG Co</td>
			<td>329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>PV-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>Supplier may vary depending on region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH35317.604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>Open source</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations

Descubrir los mecanismos que modelan los cenadores dendríticos requiere métodos para visualizar, visualizar y analizar las dendritas durante el desarrollo. La retina de ratón es un potente sistema modelo para la investigación de mecanismos específicos del tipo celular de morfogénesis neuronal y conectividad. La organización y composición de los subtipos de retina están bien definidas, y las herramientas genéticas están disponibles para acceder a tipos específicos durante el desarrollo. Muchos tipos de células de la retina también restringen sus dendritas y / o axones a capas estrechas, lo que facilita las imágenes de lapso de tiempo. Los cultivos de explantes de retina de ratón son adecuados para la obtención de imágenes de células vivas mediante microscopía confocal o multifotónica, pero faltan métodos optimizados para la dinámica de las dendritas de imágenes con resolución temporal y estructural. Aquí se presenta un método para etiquetar e visualizar escasamente el desarrollo de poblaciones específicas de retina marcadas por el sistema Cre-Lox. Los virus adenoasociados (AVA) disponibles comercialmente utilizados aquí expresaron proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana de una manera dependiente de Cre. La administración intraocular de AAV en ratones neonatales produce un marcado fluorescente de tipos de células objetivo a los 4-5 días después de la inyección (dpi). Las señales fluorescentes de membrana son detectables por imágenes confocales y resuelven estructuras y dinámicas de ramas finas. Los videos de alta calidad que abarcan de 2 a 4 h se adquieren a partir de imágenes de montajes planos de retina perfundidos con líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado (aCSF). También se proporciona una tubería de postprocesamiento de imágenes para la deconvolución y la corrección de deriva tridimensional (3D). Este protocolo se puede utilizar para capturar varios comportamientos celulares en la retina intacta y para identificar nuevos factores que controlan la morfogénesis de la neurita. Muchas estrategias de desarrollo aprendidas en la retina serán relevantes para comprender la formación de circuitos neuronales en otras partes del sistema nervioso central.

Usando el protocolo anterior, se adquirió, descontornó y corrigió un video 3D de alta resolución del desarrollo de dendritas celulares starburst para la deriva 3D. Se produjeron proyecciones máximas en plano Z para realizar videos 2D para su análisis (Video Complementario 1, Figura 5A). La deconvolución 3D de cada punto temporal aumentó la resolución de las proyecciones de filopodia fina (Figura 5B, C). Las protuberanci...

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Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Aquí, presentamos un método para investigar la morfogénesis de neuritas en explantes retinianos de ratón postnatales mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Describimos un enfoque para el etiquetado disperso y la adquisición de tipos de células retinianas y sus procesos finos utilizando vectores de virus adenoasociados recombinantes que expresan proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana de una manera dependiente de Cre.

Imágenes de lapso de tiempo de arborización neuronal utilizando el etiquetado de virus adenoasociados dispersos de poblaciones de células retinianas genéticamente dirigidas

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Se requiere el etiquetado de una sola célula y la visualización de cenadores dendríticos o axonales para estudiar la morfogénesis neuronal. Al etiquetar los cenadores en desarrollo de una manera mínimamente invasiva, el tejido de la retina permanece sano y adecuado para imágenes vivas confocales prolongadas. La principal ventaja de este método es la capacidad de visualizar cenadores individuales con proteínas fluorescentes multicolores dentro de los cuatro días posteriores a la inyección.Esto hace posible el estudio de las morfologías de los cenadores neonatales. Este protocolo de análisis e imágenes de inyección se puede utilizar para estudiar las morfologías neuronales en todo el sistema nervioso central. Se debe determinar la selección adecuada de Cre y la ubicación de la inyección para dirigirse a la población celular de interés.Comience seleccionando una línea de ratón Cre para etiquetar las poblaciones de células de la retina de interés. Obtener el virus AAV dependiente de la recombinasa que codifica proteínas fluorescentes. Para un etiquetado óptimo de procesos finos, seleccione vectores que expresen proteínas fluorescentes modificadas dirigidas a la membrana plasmática.Para la alícuota AAV en hielo, y prepare una dilución de uno a cuatro AAV usando solución salina estéril o PBS. Para visualizar las inyecciones, coloree la solución de azul agregando aproximadamente un microlitro de solución de colorante FCF 0.02% Fast Green por cada 15 microlitros de dilución AAV. Esterilizar el área de inyección con etanol al 70%.Rellene la micropipeta con la dilución AAV con una microjeringa. Bajo un microscopio estereoscópico, rompa la punta de la micropipeta con una aguja de calibre 30 para desprecintar la punta. Después de anestesiar a los ratones neonatales, tatúe sus almohadillas de patas con tinta de tatuaje usando una aguja de calibre 30 para identificar a los animales.Recolectar recortes de cola para el aislamiento del ADN y el genotipado. Frote la piel que recubre los ojos con 70% de etanol. Use una aguja de calibre 30 para abrir el párpado fusionado mientras aplica una ligera presión con los dedos para abrir el ojo.Haga un pequeño agujero a través de la córnea en la unión de la córnea esclerótica. Inserte la micropipeta de vidrio en el orificio y presione el pedal del microinyector de dos a cuatro veces para inyectar el AAV en el espacio intravítreo. Retire lentamente la micropipeta y confirme la inyección de AAV visualizando el tinte azul en la pupila.Después de preparar el aCSF retiniano como se describe en el manuscrito de texto, oxigene el aCSF retiniano burbujeando con carbógeno durante un mínimo de 15 minutos, luego ajuste el pH a 7.4. Incrustar una placa de Petri de 60 milímetros de diámetro en una bandeja de hielo y llenarla con aCSF retiniana oxigenada. Coloque la placa de Petri llena bajo un microscopio estereoscópico.A continuación, corte el colgajo del párpado del ratón sacrificado para exponer el ojo. Use fórceps contundentes para enuclear los ojos y transferirlos al aCSF retiniano frío colocado debajo del microscopio estereoscópico. Bajo el microscopio estereoscópico, estabilice el ojo apretando el nervio óptico con el número cinco de Dumont y haga un agujero en el centro de la córnea con una aguja de calibre 30, luego inserte una punta de las micro tijeras en el orificio para hacer una incisión desde el orificio hasta el final de la córnea.Repita para hacer cuatro rodajas en las direcciones cardinales, creando cuatro solapas. Agarre y separe los dos colgajos adyacentes, pelando suavemente la esclerótica de la retina para todos los colgajos de la córnea. Luego retire la lente de la copa de la retina con los fórceps.Finalmente, use micro tijeras para hacer cuatro incisiones radiales desde el borde de la retina hacia el nervio óptico, creando cuatro pétalos iguales. Si utiliza filtros de membrana MCE grises de gran diámetro para el montaje, corte el disco en cuadrantes de aproximadamente un centímetro de ancho, luego coloque el disco MCE en el centro de un papel de filtro blanco más grande. Usando dos pinceles de tamaño tres por cero, voltee una taza de retina sobre un pincel con la célula ganglionar de la retina hacia abajo.Levante suavemente la retina fuera del aCSF, asegurándose de que la tensión del agua no desgarre la retina. Mientras mantienes el pincel con la retina, mueve la placa de Petri que contiene aCSF fuera del camino y coloca el papel de filtro blanco con la membrana MCE debajo del estereoscopio. Usando una pipeta de transferencia, coloque una gota de aCSF en el centro del papel de filtro MCE.Flote la retina en la gota de aCSF creada por la tensión superficial y la membrana MCE cargada. Use pinceles para colocar la retina dentro de la gota con la célula ganglionar retiniana hacia arriba, luego despliegue los cuatro pétalos. Una vez colocado, cree un puente de agua entre el pincel y el papel de filtro blanco para romper la tensión superficial de la gota.Ensamble la cámara de incubación de imágenes en vivo y llénela con aCSF oxigenado. Encienda la bomba y el controlador de temperatura, asegurándose de que la temperatura no supere los 34 grados centígrados. La temperatura de la cámara puede tardar hasta una hora en estabilizarse.Se recomienda configurar la cámara de incubación antes de comenzar la disección de la retina. La temperatura estable de la cámara ayuda a reducir la deriva de la muestra. Para transferir el montículo plano de retina a la cámara de perfusión, detenga la bomba y retire el aCSF que se encuentra en la cámara.Luego coloque el disco MCE con el soporte plano de retina en la cámara de incubación. Moje previamente un peso de muestra para romper la tensión superficial, luego colóquelo en el soporte plano asegurándose de que el peso de la muestra se coloque en el papel MCE para reducir la deriva de la muestra. Rellene la cámara con el aCSF calentado y circule el aCSF a aproximadamente un mililitro por minuto.Coloque la pieza nasal con el objetivo de inmersión de agua 25 veces en la cámara de imágenes. Detecte las células etiquetadas de interés utilizando luz epifluorescente y ajuste el volumen de la imagen para capturar las características dendríticas de interés. Usando una tabla de búsqueda que identifica píxeles sobresaturados e infrasaturados, ajuste la potencia del láser de modo que no haya píxeles sobresaturados.Adquiera el volumen de imágenes 3D y repita la adquisición a la velocidad de fotogramas deseada. El volumen de la imagen se puede ajustar entre cada punto de tiempo para compensar la deriva de la muestra. Importe la serie de imágenes, dividiendo las imágenes por tiempo.Guarde todos los puntos de tiempo manualmente o ejecutando un complemento de macro. Cree una función teórica de dispersión de puntos utilizando el complemento ImageJ haciendo clic en Defraction PSF 3D, se requiere apertura numérica de lente, longitud de onda de emisión de fluoróforos, tamaño de píxel y espaciado Z para crear un PSF preciso. Seleccione complementos, macros y ejecute para realizar una deconvolución iterativa paralela por lotes para todos los puntos de tiempo utilizando la macro proporcionada.Importe todos los puntos de tiempo descontorneados como una pila haciendo clic en archivo, importar y, a continuación, en secuencia de imágenes. Convierta la pila en una hyperstack haciendo clic en image, hyperstacks y, a continuación, stacks to hyperstack. Agregue el número de Z-slices y marcos de tiempo, luego corrija la deriva 3D usando el complemento de deriva 3D correcto.Guarde la hiperstack corregida de deriva 3D y convierta la imagen de nuevo en una pila normal haciendo clic en imagen, hyperstacks, hyperstack para apilar, luego divida los puntos de tiempo haciendo clic en imagen, pilas, herramientas y divisor de pilas. Para el número de substacks que se van a dividir, introduzca el número de puntos de tiempo. Utilice el procesamiento por lotes para crear una proyección máxima para todos los puntos de tiempo.Importe la secuencia de imágenes de lapso de tiempo haciendo clic en archivo, importar y, a continuación, en secuencia de imágenes. Y utilice las herramientas convencionales de ImageJ para el análisis deseado de video bidimensional desconvolucionado y postprocesado, Un video 3D de alta resolución de desarrollo de dendritas de células starburst fue adquirido, desconvoluvido y corregido para la deriva 3D. Se produjeron proyecciones máximas de plano Z para hacer videos 2D para análisis, mostrando un área de refinamiento dendrítico y un área de crecimiento dendrítico.La deconvolución 3D de cada punto de tiempo aumentó la resolución de las proyecciones de filopodia fina de una sola célula amacrina de estallido estelar P6 antes y después de la deconvolución con ImageJ. Los períodos prolongados de infección por AAV no necesariamente conducen a un aumento de la señal fluorescente, como lo demuestran los niveles similares de expresión de proteínas a los cinco y 11 días después de la inyección. Es importante reducir la deriva de la muestra durante la toma de imágenes.La deriva se minimiza manteniendo una temperatura de imagen constante y posicionando adecuadamente el peso en la muestra. Si se produce una deriva, la adquisición manual de la serie temporal permite ajustar el volumen de imagen entre fotogramas. Esto asegura que las características de interés permanezcan en el marco.Este protocolo produce videos 3D de alta resolución, descontormulados y corregidos por deriva de neuritas en desarrollo. Tales videos conducen a una mejor comprensión del cableado neuronal y son necesarios para avanzar en los métodos de análisis computacional de la morfogénesis 3D. Se requieren mejores softwares automáticos de rastreo y seguimiento para lograr un análisis de alto rendimiento del desarrollo de neuritas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Adenovirus Subagonal Asociado 9 (AAV9) Vector Entrega en Ratones Adultos

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Métodos y consejos para la administración intravenosa del Virus Adeno-asociado a las ratas y la evaluación de la transducción de señales del sistema nervioso Central

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualización y en proyección de imagen del Oligodendrocyte organelos en rebanadas de cerebro Organotypic mediante Virus Adeno-asociado y Microscopía Confocal

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica Neuronal en Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...