Name: time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Vi tackar Madison Gray för att hon gav mig en hand när jag inte hade någon. Denna forskning stöddes av ett NSERC Discovery Grant (RGPIN-2016-06128), ett Sloan Fellowship in Neuroscience och en Canada Research Chair Tier 2 (till J.L.L). S. Ing-Esteves stöddes av Vision Science Research Program och NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral.

OBS: Detta protokoll sträcker sig över 2 dagar med en minsta period på 4-5 dagar för viral transduktion mellan experimentella dagar (Figur 1A). Djurförsök utförs i enlighet med Canadian Council on Animal Care Guidelines for Use of Animals in Research and Laboratory Animal Care enligt protokoll som godkänts av Laboratory of Animal Services Animal Use and Care Committee vid Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada).
1. Förberedelser för neonatala AAV-inje...

Denna video visar en experimentell pipeline som använder befintliga genetiska verktyg för att avbilda dendritdynamiken för att utveckla retinala neuroner med konfokal live-imaging. Dessutom demonstreras intraokulära injektioner av Cre-beroende AAV som kodar för membraninriktade fluorescerande proteiner i neonatala möss. Enstaka celler av genetiskt riktade populationer är ljust märkta så tidigt som 4-5 dpi. Retinala platta fästen förbereddes för standardavbildningskammare för att utföra konfokal avbildning m...

Dendriter av retinala neuroner bildar invecklade, men ändå specifika, mönster som påverkar deras funktion inom neurala kretsar. I ryggradsdjurens näthinna bär olika typer av retinala ganglionceller (RGC) och amakrincellinterneuroner unika dendritiska morfologier som skiljer sig åt i trädborrstorlek, plats, grenlängd och densitet1. Under postnatal utveckling förlänger RGC och amakrina celler sprudlande dendritiska processer till en neuropil som kallas det inre plexiformskiktet (IPL), där de tar emot bipolära cellingångar som överför fotoreceptorsignaler2. Som fångats genom time-lapse-avbildning av fluorescerande märkta retinala populationer hos kyckling- eller zebrafisklarver är dendritmorfogenesen mycket dynamisk3,4,5. Inom några dagar expanderar, ombygger och förgrenar sig dendritiska arbors till smala underlager av IPL, där de synaps med utvalda partners. Arbors uppvisar olika strukturell dynamik över utveckling, med förändringar i relativa hastigheter för grenaddition, indragning och stabilisering. Amakrin- och RGC-dendriter uppvisar också olika utväxt- och ombyggnadsbeteenden som kan återspegla typspecifik arborisering. Dessa studier spårade dock breda amakrin- eller RGC-populationer och fokuserade på laminär inriktning, vilket bara är en aspekt av morfologin.
Mekanismerna som producerar den stora morfologiska mångfalden som observerats över retinala subtyper är dåligt förstådda. Syftet med denna grupp var att utveckla en metod för att fånga dendritdynamik och arborremodellering av definierade retinala subtyper hos möss. Att identifiera celltypsspecifika mekanismer för dendritmönster kräver metoder för att visualisera och mäta dendritbeteenden hos celler av intresse. Organotypiska kulturer av musnäthinnor är väl lämpade för levande cellavbildningsstudier med konfokal eller multifotonmikroskopi. Utvecklande näthinnor dissekeras och monteras i en platt explant som kan avbildas i flera timmar i en inspelningskammare eller odlas under några dagar med begränsade effekter på kretsarna6,7. Levande retinala neuroner kan märkas med en mängd olika tekniker, inklusive färgämnesfyllning med elektroder, elektroporering, biolistisk leverans av partiklar belagda med lipofila färgämnen eller plasmider som kodar för fluorescerande proteiner (t.ex. genpistol), samt genetiskt kodade celletiketter7,8,9,10 . Dessa metoder är emellertid ineffektiva för avbildning av dendritdynamik hos specifika retinala subtyper. Till exempel är färgämnesfyllningsmetoder låg genomströmning och kräver elektrofysiologiapparater och ytterligare genetiska etiketter för att på ett tillförlitligt sätt rikta in sig på celler av intresse. Dessutom kan de starka fluorescenssignalerna i soma dölja närliggande dendriter.
Biolistiska genleveransmetoder kan samtidigt märka dussintals celler, men steg som involverar högtryckspartikelleverans och inkubation över natten av isolerad näthinna kan äventyra cellfysiologin och dendritisk utväxt. Detta dokument föreslår att nya genetiska verktyg kan användas för att fånga tidig dendritdynamik med celltyp och strukturell upplösning, med tanke på följande experimentella kriterier. För det första, för att lösa de fina grenarna och filopodierna som dominerar utvecklande arbors, bör metoden märka neuroner med ljusa, fluorescerande proteiner som fyller processer i hela trädborrningen. Fluorescensmärkningen bör inte blekna på grund av fotoblekning under avbildningsperioden. En mängd olika fluorescerande proteinvarianter har genererats och jämförts för lämplighet för in vivo/ex vivo-avbildning11 baserat på ljusstyrka och fotostabilitet. För det andra måste fluorescerande proteiner (FFP) uttryckas i tillräckligt höga nivåer vid det tidigaste stadiet av dendritmorfogenes, så att det smala utvecklingsfönstret inte missas. I analyser av statiska tidpunkter i musens näthinna sker dendritutveckling under den första postnatala veckan och inkluderar faser av utväxt, ombyggnad och stabilisering10,12,13,14,15. För det tredje bör metoden leda till selektiv märkning eller till ökad sannolikhet för märkning av den neuronala subpopulationen av intresse. För det fjärde måste märkningen av måldelpopulationen vara tillräckligt gles så att hela den neuronala trädborrningen kan identifieras och spåras. Även om RGC och amakrinsubtyper kan särskiljas genom sina mogna morfologiska egenskaper och IPL-stratifieringsmönster16,17,18,19,20, är utmaningen att identifiera subtyper under utveckling baserat på omogna strukturer. Denna uppgift underlättas av utvidgningen av transgena verktyg för att märka specifika retinala celltyper under utvecklingen.
Transgena och knock-in muslinjer där cellulärt och tidsmässigt uttryck av fluorescerande proteiner eller Cre bestäms av genreglerande element används ofta för att studera retinala celltyper13,21,22,23. Viktiga observationer om subtypspecifika mönster för dendritutveckling har kommit från studier av transgena musnäthinnor vid statiska tidpunkter10,14,24,25. Cre-Lox-systemet möjliggör i synnerhet utsökt genmanipulation och övervakning av subtyper med hjälp av en mängd olika rekombinasberoende reportrar, sensorer och optogenetiska aktivatorer. Dessa verktyg har lett till upptäckter av subtypspecifika molekylära program och funktionella egenskaper som ligger till grund för retinal kretsmontering26,27,28,29,30. De har dock ännu inte utnyttjats för att studera subtypspecifik dendritdynamik i musnäthinnan. Märkning med låg densitet kan uppnås genom att kombinera Cre-muslinjer med transgener som introduceras genom elektroporering eller genom rekombinanta AAV. Om tillgängligt kan tamoxifeninducerbara Cre-linjer eller intersektionella genetiska strategier också användas. Slutligen bör cellen märkas på ett minimalt invasivt sätt och avbildas med hjälp av förvärvsparametrar för att inte äventyra vävnaden eller störa cellulär funktion som krävs för dendritmorfogenes.
Här presenteras en metod för att tillämpa transgena verktyg och konfokalmikroskopi för att undersöka dendritdynamiken i levande mus retinala explanter. Cre transgena muslinjer har kombinerats med AAV-vektorer som uttrycker fluorescerande proteiner vid Cre-rekombination, vilket möjliggör gles märkning av retinala celler av intresse. Kommersiellt tillgängliga AAV levereras till neonatal näthinna genom intravitreala injektioner. Detta dokument visar att AAV producerar signifikant högt och celltypsspecifikt fluorescerande uttryck med 4 dpi, vilket ger tillgång till postnatala tidpunkter. För att illustrera detta tillvägagångssätt märktes den kolinerga "starburst" amakrininterneuron genom att leverera Brainbow AAV hos neonatala möss som uttrycker kolinacetyltransferas (ChAT) -inre ribosomingångsstället (IRES) -Cre-transgen, som är aktiv i den tidiga postnatala näthinnan31,32. Starburst amakrinceller utvecklar en stereotyp och radiell arbormorfologi som formas av dendrit självundvikande medierad av de klustrade protokadherinerna33,34. Detta dokument visar att upplösningen av starburst dendriter och filopodia förbättras avsevärt av FPP till plasmamembranet med tillsats av CAAX-motivet som genomgår farnesylering, som används för Brainbow AAVs31. Slutligen har time-lapse-avbildnings- och efterbehandlingsprotokoll fastställts som producerar högkvalitativa bilder som är mottagliga för dendritrekonstruktion och morfometrisk kvantifiering. Detta protokoll kan användas för att identifiera faktorer som styr dendritmorfogenes och för att fånga flera cellulära beteenden i den intakta näthinnan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45185-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45186-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HABG01 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 50 &#215; 15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470313-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene disposable transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tip paint brush, size 3/0</td>
			<td>Conventional art supply store</td>
			<td></td>
			<td>Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-imaging incubation system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber polyethylene tubing, PE-160 10&#39;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel heater controller, Model TC-344C</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater controller cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CC-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large bath incubation chamber with slice support</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample anchor (Harps)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0260</td>
			<td>Sample anchor must be compatible with incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sloflo In-line Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Microliter Syringe Series 700, Removable Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)&#160;</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2453</td>
			<td>Addgene Plasmid #45185&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 
			1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2454</td>
			<td>Addgene Plasmid #45186</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF Dye content &#8805;85 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tattoo paste</td>
			<td>Ketchum MFG Co</td>
			<td>329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>PV-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>Supplier may vary depending on region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH35317.604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>Open source</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations

Att upptäcka mekanismer som mönstrar dendritiska arbors kräver metoder för att visualisera, avbilda och analysera dendriter under utvecklingen. Musens näthinna är ett kraftfullt modellsystem för undersökning av celltypsspecifika mekanismer för neuronal morfogenes och anslutning. Organisationen och sammansättningen av retinala subtyper är väldefinierade, och genetiska verktyg är tillgängliga för att komma åt specifika typer under utvecklingen. Många retinala celltyper begränsar också sina dendriter och / eller axoner till smala lager, vilket underlättar time-lapse-avbildning. Mus näthinnans explantkulturer är väl lämpade för levande cellavbildning med konfokal eller multifotonmikroskopi, men metoder optimerade för avbildning av dendritdynamik med tidsmässig och strukturell upplösning saknas. Här presenteras en metod för att sparsamt märka och avbilda utvecklingen av specifika näthinnepopulationer markerade med Cre-Lox-systemet. Kommersiellt tillgängliga adenoassocierade virus (AAV) som används här uttryckte membraninriktade fluorescerande proteiner på ett Cre-beroende sätt. Intraokulär leverans av AAV hos neonatala möss ger fluorescerande märkning av riktade celltyper med 4-5 dagar efter injektion (dpi). Membranfluorescerande signaler kan detekteras genom konfokal avbildning och löser fina grenstrukturer och dynamik. Högkvalitativa videor som sträcker sig över 2-4 timmar förvärvas från bildbehandling av retinala platta fästen perfuserade med syresatt konstgjord cerebrospinalvätska (aCSF). Dessutom tillhandahålls en bild efterbehandlingsrörledning för dekonvolution och tredimensionell (3D) driftkorrigering. Detta protokoll kan användas för att fånga flera cellulära beteenden i den intakta näthinnan och för att identifiera nya faktorer som styr neuritmorfogenesen. Många utvecklingsstrategier som lärs in i näthinnan kommer att vara relevanta för att förstå bildandet av neurala kretsar någon annanstans i centrala nervsystemet.

Med hjälp av ovanstående protokoll förvärvades, dekonvolverades och korrigerades en högupplöst 3D-video av att utveckla starburstcelldendriter för 3D-drift. Z-plan maximala projektioner producerades för att göra 2D-videor för analys (kompletterande video 1, figur 5A). 3D-dekonvolution för varje tidpunkt ökade upplösningen av fina filopodiaprojektioner (figur 5B, C). Fina filopodiautsprång är ett kännetecken för ...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Här presenterar vi en metod för att undersöka neuritmorfogenes i postnatala mus retinala explanter genom time-lapse konfokalmikroskopi. Vi beskriver ett tillvägagångssätt för gles märkning och förvärv av retinala celltyper och deras fina processer med hjälp av rekombinanta adenoassocierade virusvektorer som uttrycker membranriktade fluorescerande proteiner på ett Cre-beroende sätt.

Time-lapse-avbildning av neuronal arborisering med användning av gles adenoassocierad virusmärkning av genetiskt riktade retinala cellpopulationer

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Encellsmärkning och visualisering av dendritiska eller axonala arbors krävs för att studera neuronal morfogenes. Genom att märka utveckla arbors på ett minimalt invasivt sätt förblir retinal vävnad frisk och lämplig för långvarig konfokal levande avbildning. Den största fördelen med denna metod är förmågan att visualisera enskilda arbors med flerfärgade fluorescerande proteiner inom fyra dagar efter injektionen.Detta gör det möjligt att studera neonatala arbormorfologier. Detta injektionsavbildnings- och analysprotokoll kan användas för att studera neuronala morfologier över centrala nervsystemet. Lämplig Cre-urval och injektionsplats måste bestämmas för att rikta in sig på cellpopulationen av intresse.Börja med att välja en Cre-muslinje för att märka de retinala cellpopulationerna av intresse. Erhålla rekombinasberoende AAV-virus som kodar för fluorescerande proteiner. För optimal märkning av fina processer, välj vektorer som uttrycker modifierade fluorescerande proteiner som riktar sig mot plasmamembranet.För AAV-alikvoten på is och förbered en en till fyra AAV-utspädning med steril saltlösning eller PBS. För att visualisera injektionerna, färga lösningen blå genom att tillsätta ungefär en mikroliter 0,02% Fast Green FCF-färglösning för varje 15 mikroliter AAV-utspädning. Sterilisera injektionsområdet med 70% etanol.Återfyll mikropipetten med AAV-utspädningen med en mikrosyring. Under ett stereomikroskop bryter du mikropipettspetsen med en 30-gauge nål för att lossa spetsen. Efter att ha bedövat de neonatala mössen, tatuera sina tasspuddar med tatueringsbläck med en 30-gauge nål för att identifiera djuren.Samla svansklipp för DNA-isolering och genotypning. Svabba huden över ögonen med 70% etanol. Använd en 30-gauge nål för att öppna det smälta ögonlocket medan du applicerar lätt tryck med fingrarna för att öppna ögat.Poke ett litet hål genom hornhinnan vid hornhinnan sclera korsning. Sätt in glasmikropipetten i hålet och tryck på mikroinjektorns fotpedal två till fyra gånger för att injicera AAV i det intravitreala utrymmet. Ta långsamt bort mikropipetten och bekräfta AAV-injektionen genom att visualisera det blå färgämnet i pupillen.Efter beredning av retinal aCSF som beskrivs i textmanuskriptet, syresätta retinal aCSF genom att bubbla med karbogen i minst 15 minuter och justera sedan pH till 7,4. Bädda in en petriskål med en diameter på 60 millimeter i en isbricka och fyll den med syresatt retinal aCSF. Placera den fyllda petriskålen under ett stereomikroskop.Skär sedan ögonlocksfliken på den avlivade musen för att exponera ögat. Använd trubbiga pincett för att enukleera ögonen och överföra dem till den kalla retinala aCSF placerad under stereomikroskopet. Under stereomikroskopet stabiliserar du ögat genom att klämma fast synnerven med Dumont nummer fem pincett och sticka ett hål i mitten av hornhinnan med en 30 gauge nål och sätt sedan in en spets av mikrosaxen i hålet för att göra ett snitt från hålet till slutet av hornhinnan.Upprepa för att göra fyra skivor i kardinalriktningarna och skapa fyra flikar. Ta tag i och dra isär de två intilliggande flikarna och skala försiktigt sclera från näthinnan för alla hornhinneflikar. Ta sedan bort linsen från näthinnan med tången.Slutligen använd mikrosax för att göra fyra radiella snitt från näthinnans kant mot synnerven, vilket skapar fyra lika kronblad. Om du använder grå MCE-membranfilter med stor diameter för montering, skär skivan i kvadranter ungefär en centimeter över och placera sedan MCE-skivan på mitten av ett större vitt filterpapper. Vänd en retinalkopp med en pensel i storlek tre med noll på en pensel med retinalganglioncellsidan nedåt.Lyft försiktigt näthinnan ur aCSF och se till att vattenspänningen inte sliter näthinnan. Medan du fortfarande håller penseln med näthinnan, flytta petriskålen som innehåller aCSF ur vägen och placera det vita filterpapperet med MCE-membranet under stereoskopet. Placera en droppe aCSF i mitten av MCE-filterpapperet med en överföringspipett.Flyt näthinnan i aCSF-droppen som skapas av ytspänningen och det laddade MCE-membranet. Använd penslar för att placera näthinnan i droppen med retinalganglioncellsidan uppåt och vik sedan ut de fyra kronbladen. När du väl är placerad skapar du en vattenbro mellan penseln och vitt filterpapper för att bryta droppens ytspänning.Montera inkubationskammaren för levande avbildning och fyll den med syresatt aCSF. Slå på pumpen och temperaturregulatorn och se till att temperaturen inte stiger över 34 grader Celsius. Det kan ta upp till en timme för kammartemperaturen att stabiliseras.Det rekommenderas att ställa in inkubationskammaren innan retinal dissektion påbörjas. Stabil kammartemperatur hjälper till att minska provdriften. För att överföra retinalplattan till perfusionskammaren, stoppa pumpen och ta bort aCSF som finns i kammaren.Placera sedan MCE-skivan med retinalens platta fäste i inkubationskammaren. Förvåta en provvikt för att bryta ytspänningen och placera den sedan på det plana fästet så att provvikten placeras på MCE-papperet för att minska provdriften. Fyll på kammaren med den uppvärmda aCSF och cirkulera aCSF med ungefär en milliliter per minut.Placera nässtycket med det 25 gånger vattendoppande målet i bildkammaren. Skärm för märkta celler av intresse med epifluorescent ljus och justera bildvolymen för att fånga dendritiska egenskaper av intresse. Använd en uppslagstabell som identifierar både övermättade och undermättade pixlar och justera lasereffekten så att inga pixlar är övermättade.Skaffa 3D-bildvolymen och upprepa förvärvet med önskad bildhastighet. Bildvolymen kan justeras mellan varje tidpunkt för att kompensera för provavdrift. Importera bildserien och dela upp bilderna efter tid.Spara alla tidspunkter manuellt eller genom att köra ett makroplugin. Skapa en teoretisk punktspridningsfunktion med hjälp av ImageJ-plugin-programmet genom att klicka på Defraction PSF 3D, objektivets numeriska bländare, fluoroforemissionsvåglängd, pixelstorlek och Z-avstånd krävs för att skapa en exakt PSF. Välj plugins, makron och kör för att utföra batchparallell iterativ dekonvolution för alla tidpunkter med det angivna makrot.Importera alla dekonvolverade tidpunkter som en stack genom att klicka på fil, importera och sedan på bildsekvens. Konvertera stacken till en hyperstack genom att klicka på image, hyperstacks och sedan stacks till hyperstack. Lägg till antalet Z-skivor och tidsramar och korrigera sedan 3D-driften med rätt 3D-drift-plugin.Spara den 3D-driftkorrigerade hyperstacken och konvertera bilden tillbaka till en vanlig stack genom att klicka på bild, hyperstackar, hyperstack för att stapla och dela sedan upp tidspunkterna genom att klicka på bild, staplar, verktyg och stackdelare. För antalet delstackar som ska delas anger du antalet tidpunkter. Använd batchbearbetning för att skapa en maximal projektion för alla tidpunkter.Importera bildsekvensen för tidsfördröjning genom att klicka på fil, importera och sedan på bildsekvens. Och använd konventionella ImageJ-verktyg för önskad analys av dekonvolverad och efterbehandlad tvådimensionell video, En högupplöst 3D-video av att utveckla starburst-celldendriter förvärvades, dekonvolverades och korrigerades för 3D-drift. Z-plan maximala projektioner producerades för att göra 2D-videor för analys, vilket visar ett område med dendritisk förfining och ett område med dendritisk utväxt.3D-dekonvolution av varje tidpunkt ökade upplösningen av fina filopodiaprojektioner av enstaka P6 starburst amacrine cell före och efter dekonvolution med ImageJ. Förlängda AAV-infektionsperioder leder inte nödvändigtvis till ökad fluorescerande signal, vilket framgår av liknande nivåer av proteinuttryck vid fem och 11 dagar efter injektionen. Det är viktigt att minska provdriften under avbildningen.Avdrift minimeras genom att bibehålla en konsekvent bildtemperatur och genom att på lämpligt sätt placera vikten på provet. Om avdrift uppstår möjliggör manuell anskaffning av tidsserien justering av bildvolymen mellan bildrutorna. Detta säkerställer att funktionerna av intresse förblir i ram.Detta protokoll producerar högupplösta, dekonvolverade och driftkorrigerade 3D-videor av utvecklande neuriter. Sådana videor leder till en bättre förståelse av neuronledningar och krävs för att främja beräkningsanalysmetoder för 3D-morfogenes. Bättre automatisk spårning och spårning programvara krävs för att uppnå hög genomströmningsanalys av neuritutveckling.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intrakraniell Injektion av Adeno-associerad virala vektorer

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

En Organotypic Slice-analys för högupplöst Time-lapse avbildning av neuronala migration i Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Imaging Neuronal svar i Slice Beredningar av vomeronasala Orgel uttrycker en genetiskt kodade Kalcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse avbildning av Neuroblast Migration i akuta skivor av vuxen mus framhjärnan

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motorisk nerv transection och Time-lapse avbildning av stödjeceller Beteenden Live Zebrafish

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Långsiktig Time Lapse avbildning av Mouse Cochlear Explantat

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpierad adenoassocierad virus 9 (AAV9) vektorleverans i vuxna möss

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Metoder och Tips för intravenös administrering av Adeno-associerade Virus till råttor och utvärdering av centrala nervsystemet transduktion

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering och levande avbildning av Oligodendrocyte organeller i Organotypic hjärnan skivor med hjälp av Adeno-associerade Virus och konfokalmikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Kvantitativ analys av neuronala dendritiska Arborization komplexitet i Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...