Name: time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Madison Gray'e, hiç sahip olmadığım zamanlarda bana yardım ettiği için teşekkür ederiz. Bu araştırma bir NSERC Keşif Bursu (RGPIN-2016-06128), Nörobilimde bir Sloan Bursu ve bir Kanada Araştırma Başkanı Tier 2 (J.L.L.'ye) tarafından desteklenmiştir. S. Ing-Esteves, Görme Bilimleri Araştırma Programı ve NSERC Yüksek Lisans Bursları-Doktora tarafından desteklenmiştir.

NOT: Bu protokol, deney günleri arasında viral transdüksiyon için minimum 4-5 günlük bir süre ile 2 güne yayılmaktadır (Şekil 1A). Hayvan deneyleri, Kanada Hasta Çocuklar Hastanesi (Toronto, Kanada) Hayvan Hizmetleri Laboratuvarı Hayvan Kullanımı ve Bakım Komitesi tarafından onaylanan protokoller kapsamında Araştırma ve Laboratuvar Hayvan Bakımında Hayvanların Kullanımı için Hayvan Bakım Kılavuzları Konseyi'ne uygun olarak gerçekleştirilir.
<p class="jove_t...

Bu video, gelişmekte olan retinal nöronların dendrit dinamiklerini konfokal canlı görüntüleme ile görüntülemek için mevcut genetik araçları kullanan deneysel bir boru hattını göstermektedir. Ayrıca, membran hedefli floresan proteinlerini yenidoğan farelere kodlayan Cre-bağımlı AAV'lerin göz içi enjeksiyonları da gösterilmiştir. Genetik olarak hedeflenmiş popülasyonların tek hücreleri, 4-5 dpi kadar erken bir sürede parlak bir şekilde etiketlenir. Standart görüntüleme odalarının canlı...

Retinal nöronların dendritleri, nöral devreler içindeki işlevlerini etkileyen karmaşık, ancak spesifik kalıplar oluşturur. Omurgalı retinasında, çeşitli tipte retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) ve amakrin hücre internöronları, ağaç dikme boyutu, yeri, dal uzunluğu ve yoğunluğu bakımından farklılık gösteren benzersiz dendritik morfolojiler taşır1. Postnatal gelişim sırasında, RGC'ler ve amakrin hücreler, coşkulu dendritik süreçleri, fotoreseptör sinyallerini ileten bipolar hücre girdilerini aldıkları iç pleksiform tabaka (IPL) adı verilen bir nöropil içine genişletirler2. Civciv veya zebra balığı larvalarında floresan olarak etiketlenmiş retinal popülasyonların hızlandırılmış görüntülenmesiyle yakalandığı gibi, dendrit morfogenezi oldukça dinamiktir3,4,5. Birkaç gün içinde, dendritik arborslar IPL'nin dar alt katmanlarına genişler, yeniden şekillenir ve yükselir, burada seçkin ortaklarla sinaps yaparlar. Arbors, gelişim üzerinde farklı yapısal dinamikler sergiler ve göreceli dal ilavesi, geri çekme ve stabilizasyon oranlarındaki değişikliklerle birlikte. Amakrin ve RGC dendritleri ayrıca tipe özgü ağaçlandırmayı yansıtabilecek farklı büyüme ve yeniden şekillendirme davranışları sergiler. Bununla birlikte, bu çalışmalar geniş amakrin veya RGC popülasyonlarını izlemiş ve morfolojinin sadece bir yönü olan laminer hedeflemeye odaklanmıştır.
Retinal alt tiplerde gözlenen geniş morfolojik çeşitliliği üreten mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu grubun amacı, farelerde tanımlanmış retinal alt tiplerin dendrit dinamiklerini ve arbor yeniden şekillenmesini yakalamak için bir yöntem geliştirmekti. Dendrit desenlemesinin hücre tipine özgü mekanizmalarını tanımlamak, ilgilenilen hücrelerin dendrit davranışlarını görselleştirmek ve ölçmek için yöntemler gerektirir. Fare retinalarının organotipik kültürleri, konfokal veya multifoton mikroskopi kullanan canlı hücre görüntüleme çalışmaları için çok uygundur. Gelişmekte olan retinalar diseke edilir ve bir kayıt odasında birkaç saat boyunca görüntülenebilen veya devre üzerinde sınırlı etkilerle birkaç gün boyunca kültürlenebilen düz bir eksplanta monte edilir6,7. Canlı retinal nöronlar, elektrotlarla boya doldurma, elektroporasyon, lipofilik boyalarla kaplanmış parçacıkların biyolistik iletimi veya floresan proteinleri kodlayan plazmidler (örneğin, Gen Tabancası) ve genetik olarak kodlanmış hücre etiketleri7,8,9,10 dahil olmak üzere çeşitli tekniklerle etiketlenebilir7,8,9,10 . Bununla birlikte, bu yaklaşımlar spesifik retinal alt tiplerin dendrit dinamiklerini görüntülemede verimsizdir. Örneğin, boya doldurma yöntemleri düşük verimlidir ve ilgilenilen hücreleri güvenilir bir şekilde hedeflemek için elektrofizyoloji aparatı ve ek genetik etiketler gerektirir. Dahası, somadaki güçlü floresan sinyalleri yakındaki dendritleri gizleyebilir.
Biyolistik gen verme yöntemleri aynı anda düzinelerce hücreyi etiketleyebilir, ancak yüksek basınçlı parçacık dağıtımını ve izole retinanın gece boyunca inkübasyonunu içeren adımlar hücre fizyolojisini ve dendritik büyümeyi tehlikeye atabilir. Bu makale, aşağıdaki deneysel kriterler göz önüne alındığında, hücre tipi ve yapısal çözünürlük ile erken dendrit dinamiklerini yakalamak için son genetik araçların kullanılabileceğini önermektedir. İlk olarak, gelişmekte olan arborslara hakim olan ince dalları ve filopodia'yı çözmek için, yöntem nöronları tüm çardaktaki süreçleri dolduran parlak, floresan proteinlerle etiketlemelidir. Görüntüleme süresi boyunca fotobeyazlatma nedeniyle floresan etiketleme solmamalıdır. Çeşitli floresan protein varyantları üretilmiş ve parlaklık ve fotostabiliteye dayalı olarak in vivo/ex vivo görüntülemeye11 uygunluk açısından karşılaştırılmıştır. İkincisi, floresan proteinler (XFP'ler), dendrit morfogenezinin en erken aşaması ile yeterince yüksek seviyelerde eksprese edilmelidir, böylece dar gelişim penceresi kaçırılmaz. Fare retinasındaki statik zaman noktalarının analizlerinde, dendrit gelişimi doğum sonrası ilk haftada meydana gelir ve büyüme, yeniden modelleme ve stabilizasyon aşamalarını içerir10,12,13,14,15. Üçüncüsü, yöntem seçici etiketlemeye veya ilgilenilen nöronal alt popülasyonun etiketlenme olasılığının artmasına yol açmalıdır. Dördüncüsü, hedef alt popülasyonun etiketlenmesi yeterince seyrek olmalıdır, böylece tüm nöronal ağaç dikme tanımlanabilir ve izlenebilir. RGC ve amakrin alt tipleri olgun morfolojik özellikleri ve IPL tabakalaşma paternleri16,17,18,19,20 ile ayırt edilebilse de, zorluk, olgunlaşmamış yapılara dayanarak gelişim sırasında alt tipleri tanımlamaktır. Bu görev, geliştirme sırasında spesifik retinal hücre tiplerini etiketlemek için transgenik araçların genişletilmesiyle kolaylaştırılmıştır.
Floresan proteinlerin veya Cre'nin hücresel ve zamansal ekspresyonunun gen düzenleyici elementler tarafından belirlendiği transgenik ve knock-in fare çizgileri, retinal hücre tiplerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır13,21,22,23. Dendrit gelişiminin alt tipe özgü kalıpları üzerine yapılan temel gözlemler, statik zaman noktalarında transgenik fare retinaları üzerine yapılan çalışmalardan gelmiştir10,14,24,25. Özellikle Cre-Lox sistemi, çeşitli rekombinaze bağımlı muhabirler, sensörler ve optogenetik aktivatörler kullanarak alt tiplerin mükemmel gen manipülasyonunu ve izlenmesini sağlar. Bu araçlar, retinal devre düzeneğinin altında yatan alt tipe özgü moleküler programların ve fonksiyonel özelliklerin keşfedilmesine yol açmıştır26,27,28,29,30. Bununla birlikte, fare retinasındaki alt tipe özgü dendrit dinamiklerini incelemek için henüz kullanılmamışlardır. Düşük yoğunluklu etiketleme, Cre fare çizgilerinin elektroporasyon veya rekombinant AAV'ler tarafından tanıtılan transgenlerle birleştirilmesiyle elde edilebilir. Varsa, tamoksifen ile indüklenebilir Cre hatları veya kesişimsel genetik stratejiler de kullanılabilir. Son olarak, hücre minimal invaziv bir şekilde etiketlenmeli ve dokudan ödün vermemek veya dendrit morfogenezi için gerekli hücresel fonksiyona müdahale etmemek için edinim parametreleri kullanılarak görüntülenmelidir.
Burada canlı fare retinal eksplantlarında dendrit dinamiklerini araştırmak için transgenik araçlar ve konfokal mikroskopi uygulamak için bir yöntem sunulmaktadır. Cre transgenik fare çizgileri, Cre rekombinasyonu üzerine floresan proteinleri eksprese eden AAV vektörleri ile birleştirilmiştir, bu da ilgilenilen retinal hücrelerin seyrek etiketlenmesine izin verir. Ticari olarak temin edilebilen AAV'ler intravitreal enjeksiyonlarla yenidoğan retinasına verilir. Bu makale, AAV'lerin 4 dpi ile önemli ölçüde yüksek ve hücre tipine özgü floresan ekspresyonu ürettiğini ve doğum sonrası zaman noktalarına erişime izin verdiğini göstermektedir. Bu yaklaşımı göstermek için, kolinerjik "starburst" amakrin internöron, yenidoğan farelerde kolin asetiltransferaz (ChAT)-internal ribozom giriş bölgesi (IRES)-Pre transgenini eksprese eden Brainbow AAV verilerek etiketlendi31,32. Starburst amakrin hücreleri, kümelenmiş protokadherinlerin aracılık ettiği dendrit kendinden kaçınma ile şekillenen stereotipli ve radyal bir ağaç dikme morfolojisi geliştirir33,34. Bu makale, yıldız patlaması dendritlerinin ve filopodia'nın çözünürlüğünün, Brainbow AAV'ler için kullanıldığı gibi, farzesilasyona uğrayan CAAX motifinin eklenmesiyle XFP'ler tarafından plazma zarına önemli ölçüde iyileştirildiğini göstermektedir31. Son olarak, dendrit rekonstrüksiyonu ve morfometrik niceleme için uygun yüksek kaliteli görüntüler üreten hızlandırılmış görüntüleme ve işlem sonrası protokoller belirlenmiştir. Bu protokol, dendrit morfogenezini kontrol eden faktörleri tanımlamak ve sağlam retinadaki çeşitli hücresel davranışları yakalamak için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45185-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Addgene viral prep #45186-AAV9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HABG01 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 50 &#215; 15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470313-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene disposable transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470225-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tip paint brush, size 3/0</td>
			<td>Conventional art supply store</td>
			<td></td>
			<td>Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-imaging incubation system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber polyethylene tubing, PE-160 10&#39;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel heater controller, Model TC-344C</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater controller cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CC-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large bath incubation chamber with slice support</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample anchor (Harps)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0260</td>
			<td>Sample anchor must be compatible with incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sloflo In-line Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Microliter Syringe Series 700, Removable Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)&#160;</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2453</td>
			<td>Addgene Plasmid #45185&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 
			1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-9-PV2454</td>
			<td>Addgene Plasmid #45186</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF Dye content &#8805;85 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tattoo paste</td>
			<td>Ketchum MFG Co</td>
			<td>329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>PV-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>Supplier may vary depending on region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>HB0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH35317.604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td>Open source</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of neuronal arborization using sparse adeno-associated virus labeling of genetically targeted retinal cell populations

Dendritik arborsları modelleyen mekanizmaları keşfetmek, gelişim sırasında dendritleri görselleştirmek, görüntülemek ve analiz etmek için yöntemler gerektirir. Fare retinası, nöronal morfogenez ve bağlantının hücre tipine özgü mekanizmalarının araştırılması için güçlü bir model sistemidir. Retinal alt tiplerin organizasyonu ve bileşimi iyi tanımlanmıştır ve gelişim sırasında belirli tiplere erişmek için genetik araçlar mevcuttur. Birçok retinal hücre tipi ayrıca dendritlerini ve / veya aksonlarını dar tabakalarla sınırlar, bu da hızlandırılmış görüntülemeyi kolaylaştırır. Fare retina eksplant kültürleri, konfokal veya multifoton mikroskopisi kullanarak canlı hücre görüntüleme için çok uygundur, ancak dendrit dinamiklerini zamansal ve yapısal çözünürlükle görüntülemek için optimize edilmiş yöntemler eksiktir. Burada Cre-Lox sistemi tarafından işaretlenmiş spesifik retinal popülasyonların gelişimini seyrek olarak etiketlemek ve görüntülemek için bir yöntem sunulmaktadır. Burada kullanılan ticari olarak temin edilebilen adeno ilişkili virüsler (AAV'ler), membran hedefli floresan proteinlerini Cre'ye bağımlı bir şekilde ifade etti. Yenidoğan farelerde AAV'lerin göz içi doğumu, enjeksiyondan 4-5 gün sonra (dpi) hedeflenen hücre tiplerinin floresan etiketlemesini sağlar. Membran floresan sinyalleri konfokal görüntüleme ile algılanabilir ve ince dal yapılarını ve dinamiklerini çözer. 2-4 saate yayılan yüksek kaliteli videolar, oksijenli yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ile perfüze edilmiş görüntüleme retinal düz montajlarından elde edilir. Ayrıca, dekonvolüsyon ve üç boyutlu (3B) sapma düzeltmesi için bir görüntü son işleme ardışık düzenidir. Bu protokol, sağlam retinadaki çeşitli hücresel davranışları yakalamak ve nörit morfogenezini kontrol eden yeni faktörleri tanımlamak için kullanılabilir. Retinada öğrenilen birçok gelişimsel strateji, merkezi sinir sisteminin başka yerlerinde nöral devrelerin oluşumunu anlamak için geçerli olacaktır.

Yukarıdaki protokolü kullanarak, yıldız patlaması hücresi dendritlerinin geliştirilmesinin yüksek çözünürlüklü bir 3D videosu elde edildi, deconvolved edildi ve 3D sürüklenme için düzeltildi. Analiz için 2D videolar yapmak üzere Z-düzlemi maksimum projeksiyonları üretildi (Ek Video 1, Şekil 5A). Her zaman noktasının 3D dekonvolüsyonu, ince filopodia projeksiyonlarının çözünürlüğünü arttırmıştır (Şekil 5B...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations at JoVE.com

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Burada, postnatal fare retinal eksplantlarında nörit morfogenezini hızlandırılmış konfokal mikroskopi ile araştırmak için bir yöntem sunuyoruz. Membran hedefli floresan proteinlerini Cre'e bağımlı bir şekilde eksprese eden rekombinant adeno ilişkili virüs vektörlerini kullanarak retina hücre tiplerinin ve ince süreçlerinin seyrek etiketlenmesi ve edinilmesi için bir yaklaşım tanımladık.

Genetik Olarak Hedeflenmiş Retinal Hücre Popülasyonlarının Seyrek Adeno İlişkili Virüs Etiketlemesi Kullanılarak Nöronal Arborizasyonun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Nöronal morfogenezi incelemek için dendritik veya aksonal arborsların tek hücreli etiketlenmesi ve görselleştirilmesi gereklidir. Gelişmekte olan arborları minimal invaziv bir şekilde etiketleyerek, retina dokusu sağlıklı kalır ve uzun süreli konfokal canlı görüntüleme için uygun kalır. Bu yöntemin temel avantajı, enjeksiyondan sonraki dört gün içinde çok renkli floresan proteinlerle bireysel arborları görselleştirme yeteneğidir.Bu, yenidoğan ağaç dikme morfolojilerinin incelenmesini mümkün kılar. Bu enjeksiyon görüntüleme ve analiz protokolü, merkezi sinir sistemindeki nöronal morfolojileri incelemek için kullanılabilir. İlgilenilen hücre popülasyonunu hedeflemek için uygun Cre seçimi ve enjeksiyon yeri belirlenmelidir.İlgilenilen retinal hücre popülasyonlarını etiketlemek için bir Cre fare çizgisi seçerek başlayın. Floresan proteinleri kodlayan rekombinaza bağımlı AAV virüsü elde edin. İnce proseslerin optimum şekilde etiketlenmesi için, plazma zarını hedef alan modifiye floresan proteinlerini ifade eden vektörleri seçin.Buz üzerindeki AAV aliquot için steril salin veya PBS kullanarak bir ila dört AAV seyreltme hazırlayın. Enjeksiyonları görselleştirmek için, her 15 mikrolitre AAV seyreltmesi için yaklaşık bir mikrolitre% 0.02Hızlı Yeşil FCF boya çözeltisi ekleyerek çözeltiyi maviye renklendirin. Enjeksiyon alanını% 70 etanol ile sterilize edin.Mikropipeti bir mikroşırınga kullanarak AAV seyreltme ile doldurun. Stereo mikroskop altında, ucun mührünü açmak için mikropipet ucunu 30 gauge'lik bir iğneyle kırın. Yenidoğan farelerini uyuşturduktan sonra, hayvanları tanımlamak için 30 gauge'lik bir iğne kullanarak pençe pedlerini dövme mürekkebi ile dövmeyin.DNA izolasyonu ve genotipleme için kuyruk kırpıntılarını toplayın. Gözlerin üzerindeki cildi% 70 etanol ile silin. Gözü açmak için parmaklarınızla hafif basınç uygularken kaynaşmış göz kapağını açmak için 30 gauge'luk bir iğne kullanın.Kornea sklera kavşağındaki korneadan küçük bir delik açın. Cam mikropipeti deliğe yerleştirin ve AAV'yi intravitreal boşluğa enjekte etmek için mikro enjektör ayak pedalına iki ila dört kez basın. Mikropipeti yavaşça çıkarın ve göz bebeğindeki mavi boyayı görselleştirerek AAV enjeksiyonunu onaylayın.Metin makalesinde açıklandığı gibi retinal aCSF'yi hazırladıktan sonra, retinal aCSF'yi en az 15 dakika boyunca karbojenle köpürterek oksijenlendirin, ardından pH'ı 7.4'e ayarlayın. 60 milimetre çapında bir Petri kabını bir buz tepsisine yerleştirin ve oksijenli retinal aCSF ile doldurun. Doldurulmuş Petri kabını stereo mikroskop altına yerleştirin.Ardından, gözü açığa çıkarmak için ötenazi faresinin göz kapağı kapağını kesin. Gözleri enüklee etmek ve stereo mikroskop altına yerleştirilmiş soğuk retinal aCSF'ye aktarmak için künt forseps kullanın. Stereo mikroskop altında, beş numaralı forseps Dumont'u kullanarak optik siniri sıkıştırarak gözü stabilize edin ve korneanın merkezinde 30 gauge'luk bir iğne ile bir delik açın, ardından delikten korneanın sonuna kadar bir kesi yapmak için mikro makasın bir ucunu deliğe yerleştirin.Kardinal yönlerde dört dilim yapmak için tekrarlayın ve dört kanat oluşturun. İki bitişik flebi kavrayın ve birbirinden ayırın, sklerayı retinadan tüm kornea flepleri için yavaşça soyun. Ardından forsepsleri kullanarak lensi retina kabından çıkarın.Son olarak, retinanın kenarından optik sinire doğru dört radyal kesi yapmak için mikro makas kullanın ve dört eşit taç yaprağı oluşturun. Montaj için büyük çaplı gri MCE membran filtreler kullanıyorsanız, diski kabaca bir santimetre genişliğinde kadranlar halinde kesin, ardından MCE diskini daha büyük bir beyaz filtre kağıdının ortasına yerleştirin. İki boyut üçe sıfır boya fırçası kullanarak, retinal gangliyon hücresi tarafı aşağı bakacak şekilde bir retinal fincanı boya fırçasına çevirin.Retinayı nazikçe aCSF'den kaldırın ve su gerginliğinin retinayı yırtmadığından emin olun. Boya fırçasını retina ile tutmaya devam ederken, aCSF içeren Petri kabını yoldan çekin ve beyaz filtre kağıdını MCE membranı ile stereoskobun altına yerleştirin. Bir transfer pipeti kullanarak, MCE filtre kağıdının ortasına bir aCSF damlacığı yerleştirin.Retinayı, yüzey gerilimi ve yüklü MCE membranı tarafından oluşturulan aCSF damlacığına yüzdürün. Retinayı damlacık içinde retinal gangliyon hücresi tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırmak için boya fırçaları kullanın, ardından dört yaprağı açın. Yerleştirildikten sonra, damlacığın yüzey gerilimini kırmak için boya fırçası ile beyaz filtre kağıdı arasında bir su köprüsü oluşturun.Canlı görüntüleme inkübasyon odasını monte edin ve oksijenli aCSF ile doldurun. Sıcaklığın 34 santigrat derecenin üzerine çıkmadığından emin olarak pompayı ve sıcaklık kontrol cihazını açın. Oda sıcaklığının dengelenmesi bir saat kadar sürebilir.Retina diseksiyonuna başlamadan önce kuluçka odasının kurulması önerilir. Kararlı oda sıcaklığı, numune sapmasını azaltmaya yardımcı olur. Retinal düz höyüğü perfüzyon odasına aktarmak için, pompayı durdurun ve odadaki aCSF'yi çıkarın.Daha sonra MCE diskini retinal düz montajla inkübasyon odasına yerleştirin. Yüzey gerilimini kırmak için bir numune ağırlığını önceden ıslatın, ardından düz montajın üzerine yerleştirin ve numune sapmasını azaltmak için numune ağırlığının MCE kağıdına yerleştirilmesini sağlayın. Odayı ısıtılmış aCSF ile doldurun ve aCSF'yi dakikada yaklaşık bir mililitrede dolaştırın.Burun parçasını, görüntüleme odasına 25 kez su batırma hedefiyle konumlandırın. Epifloresan ışığı kullanarak etiketli hücreleri görüntüleyin ve ilgilenilen dendritik özellikleri yakalamak için görüntüleme hacmini ayarlayın. Hem aşırı doymuş hem de az doymuş pikselleri tanımlayan bir arama tablosu kullanarak, lazer gücünü hiçbir pikselin aşırı doymamış olacağı şekilde ayarlayın.3D görüntüleme hacmini elde edin ve elde etmeyi istenen kare hızında tekrarlayın. Görüntüleme hacmi, numune sapmasını telafi etmek için her zaman noktası arasında ayarlanabilir. Görüntü serilerini içe aktarın ve görüntüleri zamana göre bölün.Tüm zaman noktalarını manuel olarak veya bir makro eklentisi çalıştırarak kaydedin. Doğru bir PSF oluşturmak için ImageJ eklentisini kullanarak ImageJ eklentisini kullanarak teorik bir nokta yayılma işlevi oluşturun, doğru bir PSF oluşturmak için lens sayısal diyaframı, florofor emisyon dalga boyu, piksel boyutu ve Z aralığı gereklidir.Dosyayı, içe aktarmayı ve ardından görüntü dizisini tıklayarak tüm belirsizleştirilmiş zaman noktalarını yığın olarak içe aktarın. Görüntüyü, hiper yığınları, ardından yığınları hiper yığına tıklayarak yığını hiper yığına dönüştürün. Z-dilimlerinin ve zaman dilimlerinin sayısını ekleyin, ardından doğru 3D drift eklentisini kullanarak 3D drift'i düzeltin.3B sapma düzeltilmiş hiper yığını kaydedin ve görüntüyü, hiper yığınları, yığın için hiper yığını tıklatarak görüntüyü normal bir yığına dönüştürün, ardından görüntü, yığınlar, araçlar ve yığın ayırıcıyı tıklatarak zaman noktalarını bölün. Bölünecek alt yığın sayısı için zaman noktası sayısını girin. Tüm zaman noktaları için maksimum projeksiyon oluşturmak üzere toplu işlemeyi kullanın.Dosyayı, içe aktarmayı ve ardından görüntü sırasını tıklayarak hızlandırılmış görüntü dizisini içe aktarın. Ve deconvolved ve post işlenmiş iki boyutlu videonun istenen analizi için geleneksel ImageJ araçlarını kullanın, Yıldız patlaması hücre dendritleri geliştiren yüksek çözünürlüklü bir 3D video elde edildi, deconvolved ve 3D sürüklenme için düzeltildi. Z-düzlemi maksimum projeksiyonları, analiz için 2D videolar yapmak için üretildi, bir dendritik arıtma alanı ve bir dendritik büyüme alanı gösterdi.Her zaman noktasının 3D dekonvolüsyonu, ImageJ ile dekonvolüsyondan önce ve sonra tek P6 yıldız patlaması amakrin hücresinin ince filopodia projeksiyonlarının çözünürlüğünü arttırdı. Uzun süreli AAV enfeksiyon dönemleri, enjeksiyondan sonraki beş ve 11 gün içinde benzer seviyelerde protein ekspresyonu ile gösterildiği gibi floresan sinyalinin artmasına neden olmaz. Görüntüleme sırasında numune kaymasının azaltılması önemlidir.Tutarlı bir görüntüleme sıcaklığı korunarak ve numune üzerindeki ağırlığın uygun şekilde konumlandırılmasıyla sapma en aza indirilir. Sapma meydana gelirse, zaman serisinin manuel olarak alınması, çerçeveler arasındaki görüntüleme hacminin ayarlanmasına izin verir. Bu, ilgilenilen özelliklerin çerçevede kalmasını sağlar.Bu protokol, gelişmekte olan nöritlerin yüksek çözünürlüklü, deconvolved ve drift düzeltmeli 3D videolarını üretir. Bu tür videolar, nöron kablolamasının daha iyi anlaşılmasına yol açar ve 3D morfogenezin hesaplamalı analiz yöntemlerini ilerletmek için gereklidir. Nörit gelişiminin yüksek verim analizini elde etmek için daha iyi otomatik izleme ve izleme yazılımları gereklidir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Adeno-ilişkili Viral Vektörler İntrakranial Enjeksiyon

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Yetişkin Farelerde Subpial Adeno-ilişkili Virüs 9 (AAV9) Vektör Teslimatı

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Yöntemleri ve merkezi sinir sistemi iletim değerlendirilmesi ve Adeno ilişkili virüs fareler için intravenöz Yönetim için ipuçları

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Görselleştirme ve Oligodendrocyte organelleri Adeno ilişkili virüs ve Confocal mikroskobu kullanılarak Organotypic beyin dilimleri içinde canlı görüntüleme

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Kantitatif analiz Drosophila nöronal dendritik Arborization karmaşıklığı

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...