Name: quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations
Uploaded: 2021-07-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations at JoVE.com

1. Forberedelsestrin
<ol><li>Forbered Muller-Hinton bouillon (MHB) ved at tilføje 25 g MH bouillon til 1 L destilleret vand og bland. Autoklave ved 121 °C i 2,5 timer. Opbevar derefter det autoklaverede medie ved stuetemperatur eller i køleskabet.</li>
	<li>Subkultur de pågældende bakterier (E. coli ESBL) på agar medier ved hjælp af fire-kvadrant striber metode og inkubere natten over ved 37 °C.<ol>
<li>Brug en steril løkke, tage en koloni og sprede det i første halvdel af MacConkey agar plade ved at...

<ol>
	<li>Ibezim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+resistance+to+antibiotics.">Microbial resistance to antibiotics.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).</li><li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistance+crisis:+part+1:+causes+and+threats.">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P &amp; T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li><li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antibiotics:+Are+we+in+the+post-antibiotic+era.">Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era.</a> Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+at+the+crossroads.">Antibiotics at the crossroads.</a> Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).</li><li>Bollenbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+interactions:+mechanisms+and+implications+for+drug+discovery+and+resistance+evolution.">Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).</li><li>Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+antibiotic+resistance+in+common+infectious+diseases:+role+of+antibiotic+combination+therapy.">Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy.</a> Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).</li><li>Chanda, S., Rakholiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy:+Synergism+between+natural+plant+extracts+and+antibiotics+against+infectious+diseases.">Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases.</a> Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).</li><li>Cottarel, G., Wierzbowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+drugs,+an+emerging+option+for+antibacterial+therapy.">Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy.</a> Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).</li><li>Kristiansen, J., Amaral, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+management+of+resistant+infection+with+non-antibiotics.">The potential management of resistant infection with non-antibiotics.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).</li><li>Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+for+treatment+of+infections+with+gram-negative+bacteria.">Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria.</a> Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).</li><li>Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+of+antimicrobial+therapy.">General principles of antimicrobial therapy.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).</li><li>Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+combinations:+Should+they+be+tested.">Antibiotic combinations: Should they be tested.</a> Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).</li><li>Doern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+does+2+plus+2+equal+5?+A+review+of+antimicrobial+synergy+testing.">When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li><li>Stein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+checkerboard+synergy+analysis+of+colistin,+meropenem,+tigecycline+against+multidrug-resistant+clinical+klebsiella+pneumonia+isolates.">Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates.</a> PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).</li><li>Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+essential+oil+components+and+antibiotics:+a+review.">Synergy between essential oil components and antibiotics: a review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).</li><li>Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-kill+assay+and+Etest+evaluation+for+synergy+with+polymyxin+B+and+fluconazole+against+Candida+glabrata.">Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).</li></ol>

Metoden Quadruple Checkerboard ligner skakternet og det tredimensionale skakbræt i protokollen. Der bør dog tages hensyn til visse afgørende skridt for at undgå fejl under forsøget.
Sørg for at teste for MIC af hvert lægemiddel mod den testede isolere før du starter protokollen for at vide, hvad er de koncentrationer, der er nødvendige for at starte fortyndinger med for stof 1 og stof 2, der skal serielt fortyndes i pladerne. Med hensyn til lægemiddel 3 og lægemiddel 4 bør MIC ogs?...

Med stigningen i resistens på grund af overforbrug og misbrug af antibiotika1,2, er behovet for at udvikle nye lægemidler og midler til behandling af bakterielle infektioner blevet afgørende. Nye tilgange såsom udvikling af nye lægemidler er meget vigtige for at overvinde modstandskrisen. Medicinalindustrien er dog ikke interesseret i at udvikle nye antimikrobielle midler. Desuden, hvis nye lægemidler udvikles, bakterier vil holde på udvikling og udvikling af resistens over for disse nye lægemidler3,4. Således vil problemet med resistens ikke blive løst, hvilket gør behovet for en anden tilgang et must, der bør overvejes og studeres for at overvinde bakteriel resistens.
Lægemiddelkombination er et meget vigtigt koncept til behandling af bakterielle infektioner hovedsageligt dem, der er forårsaget af multiresistente patogener5,6. Det nedsætter behandlingsforløbet, nedsætter den givne dosis; Således reducerer toksiciteten af det givne lægemiddel, hjælper med at reducere resistensudviklingen og på en måde sensibiliserer bakterierne til de givne lægemidler som beskrevet i begrebet sikkerhedsstillelse følsomhed5,7,8,9.
Resistens udvikling til et lægemiddel kræver en enkelt mutation; Imidlertid kræver resistensudvikling af en kombination af lægemidler, der er målrettet mod flere veje, flere uafhængige mutationer, der bremses af denne kombination. Et eksempel på nedsat resistens, mens du bruger kombinationsbehandling, er den reducerede resistens over for Rifampin i Mycobacterium Tuberkulose10. Et andet eksempel er en undersøgelse udført af Gribble et al., der viste, at antallet af resistente stammer hos patienter, der tager Piperacillin alene for at være højere end hos dem, der tager en kombination af carboxypenicillin og aminoglycoside10. Undersøgelser har vist, at resistens udvikling til aminoglykosider i udviklingen bakterier gjort disse stammer følsomme over for forskellige andre lægemidler5. Kombinationen mellem beta-lactam-klassens lægemiddel amoxicillin og lactamase-hæmmer clavulansyren viste succes med at behandle resistente bakteriestammer8.
Faldende behandlingstid er en god fordel som følge af lægemiddelkombinationer. For eksempel vil en behandling af kombineret penicillin eller ceftriaxone med gentamicin i 2 uger give den samme effekt som penicillin eller ceftriaxone alene, når den gives i 4 uger11. Ved at kombinere stoffer giver mulighed for brug af lavere doser af lægemidler, der ikke er effektive, når de gives alene, såsom Sub-MICs. Eksemplet med sulfonamider kan gives, når brugen af triplesulfonaamider ved lavere doser minimerer den producerede toksicitet, som er krystaldannelse eller krystallurier, når der anvendes uopløselige sulfonamider ved fulde doser12.
Således vil faldende dosis givet og tidspunktet for behandlingen i sidste ende mindske toksiciteten af narkotika på kroppen. Ideen om at udvikle metoder til at vurdere samspillet mellem kombinerede lægemidler er meget vigtig. I en undersøgelse viste resultaterne, at kombinationsbehandling er mere effektiv til behandling af resistente arter af Acinetobacter og P. aeruginosa8.
Give stoffer i kombination Der er forskellige metoder, hvormed vi kan studere lægemiddelkombinationer, såsom skakternetmetoden, tids-kill-kurvemetoden og E-testmetoden13. Kontroltavlemetoden kan undersøge alle mulige kombinationer mellem de to pågældende lægemidler i et eksperiment selv. Derudover blev det udviklet til at studere en kombination af tre lægemidler14. Nu udvider vi dette til at studere en kombination af fire lægemidler hovedsagelig til behandling af multiresistente patogener.
Den tid-kill kurve assay er normalt udføres for at teste for den baktericide effekt af et bestemt lægemiddel. Det blev også brugt til at teste for effekten af lægemiddelkombinationer, hvor flere lægemidler kombineres i specifikke koncentrationer. Denne protokol kræver forberedelse af flere sterile rør eller kopper, hvor vi i hver kop tilføjer bouillon, kombination af stoffer og den krævede bakteriestamme. Efter inkubation og registrering af den optiske tæthed på flere tidspunkter sammenlignes resultaterne med den normale vækstrate for den anvendte stamme for at se, om vækstraten steg, faldt eller ikke ændrede13.
E-testmetoden anvendes normalt til at teste for den minimale hæmmende koncentration (MIC), hvor en strimmel, der indeholder en gradientkoncentration af det pågældende lægemiddel, anbringes på en podet plade. Det blev også brugt til at teste kombinationen mellem to stoffer, hvor to strimler tilsættes til pladen på en vinkelret måde, der skærer ved deresMIC'er 13.
Ifølge litteraturen er der ingen guldstandard at definere og studere synergi; det er således vanskeligt at vurdere, hvilken af de metoder, der anvendes til at studere kombination, der er bedre, og hvilken der giver bedre og mere pålidelige resultater hovedsagelig13. Men, Time-kill assay er arbejdskrævende, tidskrævende, og dyre15,16, mens E-test metode er udviklet til at studere en kombination mellem to lægemidler alene. Skakbræt kan studere alle mulige kombinationer mellem de to testede lægemidler, og det er derfor, denne teknik er blevet valgt til at blive udviklet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330000402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330-0013-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>For drug 3 and 4 preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polysterene round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm petri dishes</td>
			<td>JRZ Plastilab</td>
			<td></td>
			<td>As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>For serial diltuion and combining drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole</td>
			<td>By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France</td>
			<td>10177403</td>
			<td>Drug 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceforane, 1 g (Cefotaxime)</td>
			<td>PHARCO Pharmaceuticals</td>
			<td>24750/2006</td>
			<td>Drug 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli ESBL strain</td>
			<td>Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon</td>
			<td></td>
			<td>Bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Conkey + crystal violet agar</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>64169508</td>
			<td>For making agar plates used for subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)</td>
			<td>HIKMA Pharmaceuticals</td>
			<td>2BXMIA56N-AEF</td>
			<td>Drug 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>69444</td>
			<td>For making bacterial media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>GJ54761</td>
			<td>For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OH19855 HH40868</td>
			<td>For the addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)</td>
			<td>sanofi aventis</td>
			<td>221937/2009</td>
			<td>Drug 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations

Begrebet lægemiddelkombinationsbehandling bliver meget vigtigt, hovedsagelig med den drastiske stigning i resistens over for lægemidler. Det firedobbelte skakbræt, også kaldet Q-skakbrættet, har til formål at maksimere antallet af mulige kombinationer, der kan opnås mellem fire lægemidler i et eksperiment for at minimere den tid og det arbejde, der er nødvendigt for at opnå de samme resultater med andre protokoller. Denne protokol er baseret på den enkle mikrofortyndingsteknik, hvor stofferne fortyndes og kombineres sammen i flere 96-brøndsplader.
I det første sæt af 96-brønds plader tilsættes Muller-Hinton bouillon efterfulgt af det første nødvendige lægemiddel (f.eks. Cefotaxime her) for at serielt fortynde det. Efter det første skridt er gjort, bruges et andet sæt 96-brøndsplader til at fortynde det andet lægemiddel (f.eks. Amikaci), som vil blive overført ved at fjerne et bestemt volumen stof 2 og sætte i de tilsvarende brønde i det første sæt 96-brøndsplader, der indeholder lægemiddel et. Det tredje trin gøres ved at tilsætte de krævede koncentrationer af det tredje lægemiddel (f.eks. Levofloxacin) til de relevante plader i det indledende sæt, der indeholder kombination af lægemiddel 1 og 2. Det fjerde trin udføres ved at tilsætte de krævede koncentrationer af det fjerde lægemiddel (f.eks. Trimethoprim-sulfamethoxazol) til de relevante plader i første sæt. Derefter vil E. coli ESBL bakteriel inoculum blive forberedt og tilføjet.
Denne metode er vigtig for at evaluere alle mulige kombinationer og har en bredere vifte af muligheder, der skal testes desuden for in vivo test. På trods af at være en trættende teknik, der kræver meget fokus, er resultaterne bemærkelsesværdige og tidsbesparende, hvor mange kombinationer kan testes i et enkelt eksperiment.

Figur 2A viser de opnåede resultater ved at kombinere Cefotaxime og Amikacin med specifikke koncentrationer af Levofloxacin og Trimethoprim-sulfamethoxazol. Vi kan i venstre del af figuren se de fire plader, der skematisk præsenteres for koncentrationerne af stofferne i højre del af figuren. Pilene repræsenterer brøndene på grænsefladen Vækst/ingen vækst. De farvede brønde er brøndene, der indeholder vækst. Vi bemærker, at den fjerde plade ikke indeholder vækst i kvadranten, de...

Watch this Scientific Journal Video about Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations at JoVE.com

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

Denne protokol beskriver, hvordan man studerer alle mulige kombinationer, der kan opnås mellem fire lægemidler i et enkelt eksperiment. Denne metode er baseret på standard mikrofortyndingsanalysen med 96 brønd og beregningen af fraktionelle hæmmende koncentrationer (FIC' er) for at evaluere resultaterne.

Firdobbelt skakbræt: En ændring af det tredimensionale skakbræt til undersøgelse af lægemiddelkombinationer

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biology

Unit 1

Pharmacodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Et analyseværktøj, der kvantificerer cellemorfologi Ændringer fra Tredimensionelle fluorescensbilleder

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Brug High Resolution Computed Tomography at visualisere de tredimensionelle struktur og funktion af dyrs vaskulatur

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler ved PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging i Tre-dimensionelle Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Tre-dimensionelle genopbygning af den vaskulære arkitektur i passiv klarhed-ryddet mus æggestokkene

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-klar: En væv Clearing metode til tredimensional billeddannelse af fedtvæv

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

En BW Reporter System for at studere Receptor-Ligand interaktioner

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...