Name: quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations
Uploaded: 2021-07-24T14:30:00
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1. Étapes de préparation
<ol><li>Préparer le bouillon Muller-Hinton (MHB) en ajoutant 25 g de bouillon MH à 1 L d’eau distillée et mélanger. Autoclave à 121 °C pendant 2,5 h. Ensuite, rangez le support autoclavé à température ambiante ou au réfrigérateur.</li>
	<li>Sous-culture des bactéries en question(E. coli ESBL) sur le milieu de la gélose en utilisant la méthode de stries à quatre quadrants et incuber pendant la nuit à 37 °C.<ol>
<li>À l’aide d’une boucle stérile, prenez une col...

<ol>
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A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li><li>Stein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+checkerboard+synergy+analysis+of+colistin,+meropenem,+tigecycline+against+multidrug-resistant+clinical+klebsiella+pneumonia+isolates.">Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates.</a> PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).</li><li>Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+essential+oil+components+and+antibiotics:+a+review.">Synergy between essential oil components and antibiotics: a review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).</li><li>Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-kill+assay+and+Etest+evaluation+for+synergy+with+polymyxin+B+and+fluconazole+against+Candida+glabrata.">Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).</li></ol>

La méthode quadruple damier ressemble au damier et au damier tridimensionnel dans son protocole. Cependant, certaines étapes cruciales doivent être prises en considération pour éviter les erreurs au cours de l’expérience.
Assurez-vous de tester le MIC de chaque médicament contre l’isolat testé avant de commencer le protocole pour savoir quelles sont les concentrations qui sont nécessaires pour commencer les dilutions avec pour le médicament 1 et le médicament 2 qui doivent être...

Avec l’augmentation de la résistance due à la surutilisation et à la mauvaise utilisation des antibiotiques1,2, la nécessité de développer de nouveaux médicaments et agents pour traiter les infections bactériennes est devenue cruciale. De nouvelles approches telles que le développement de nouveaux médicaments sont très importantes pour surmonter la crise de résistance. Cependant, l’industrie pharmaceutique n’est pas intéressée par le développement de nouveaux agents antimicrobiens. De plus, si de nouveaux médicaments sont développés, les bactéries continueront d’évoluer et de développer une résistance contre ces nouveaux médicaments3,4. Ainsi, le problème de la résistance ne sera pas résolu, ce qui rend la nécessité d’une autre approche indispensable qui devrait être considérée et étudiée pour surmonter la résistance bactérienne.
La combinaison de médicaments est un concept très important pour le traitement des infections bactériennes, principalement celles causées par des agents pathogènes multirésistants5,6. Il diminue le cours du traitement, diminue la dose donnée; ainsi, diminuer la toxicité du médicament donné, aide à diminuer le taux de développement de la résistance et, d’une certaine manière, sensibilise les bactéries aux médicaments donnés comme décrit dans le concept de sensibilité collatérale5,7,8,9.
Le développement d’une résistance à un médicament nécessite une seule mutation; cependant, le développement d’une résistance à une combinaison de médicaments ciblant plusieurs voies nécessite plusieurs mutations indépendantes qui sont ralenties par cette combinaison. Un exemple de diminution de la résistance lors de l’utilisation de la polythérapie est la diminution du taux de résistance à la rifampicine dans Mycobacterium Tuberculosis10. Un autre exemple est une étude réalisée par Gribble et al. qui a montré que le taux d’émergence de souches résistantes chez les patients prenant de la pipéracilline seule était plus élevé que chez ceux prenant une combinaison de carboxypénicilline et d’aminoglycoside10. Des études ont montré que le développement d’une résistance aux aminoglycosides chez les bactéries en évolution rendait ces souches sensibles à divers autres médicaments5. La combinaison entre le médicament de classe bêta-lactamine amoxicilline et l’inhibiteur de lactamase acide clavulanique a montré le succès dans le traitement des souches bactériennes résistantes8.
La diminution du temps de traitement est un bon avantage résultant des combinaisons de médicaments. Par exemple, un traitement de pénicilline ou de ceftriaxone combinée avec de la gentamicine pendant 2 semaines donnera la même efficacité que la pénicilline ou la ceftriaxone seule lorsqu’elle est administrée pendant 4 semaines11. La combinaison de médicaments permet l’utilisation de doses plus faibles de médicaments qui ne sont pas efficaces lorsqu’ils sont administrés seuls, comme les sous-CMI. L’exemple des sulfamides peut être donné lorsque l’utilisation de triples sulfamides minimise, à des doses plus faibles, la toxicité produite qui est la formation de cristaux ou la cristallurie lors de l’utilisation de sulfamides insolubles à pleines doses12.
Ainsi, la diminution de la dose donnée et du temps de traitement finira par diminuer la toxicité des médicaments sur le corps. L’idée de développer des méthodes pour évaluer l’interaction entre les médicaments combinés est très importante. Dans une étude, les résultats ont montré que la thérapie combinée est plus efficace pour le traitement des espèces résistantes d’Acinetobacter et de P. aeruginosa8.
Donner des médicaments en combinaison Il existe différentes méthodes par lesquelles nous pouvons étudier les combinaisons de médicaments, telles que la méthode en damier, la méthode de la courbe de temps mort et la méthode E-test13. La méthode du damier peut étudier toutes les combinaisons possibles entre les deux médicaments en question dans une seule expérience elle-même. En outre, il a été développé pour étudier une combinaison de trois médicaments14. Maintenant, nous étendons cela pour étudier une combinaison de quatre médicaments principalement pour le traitement des agents pathogènes multirésistants.
Le test de la courbe time-kill est généralement effectué pour tester l’effet bactéricide d’un certain médicament. Il a également été utilisé pour tester l’effet des combinaisons de médicaments où plusieurs médicaments sont combinés à des concentrations spécifiques. Ce protocole nécessite la préparation de plusieurs tubes ou tasses stériles où dans chaque tasse nous ajoutons le bouillon, la combinaison de médicaments et la souche bactérienne requise. Après incubation et enregistrement de la densité optique à plusieurs points de temps, les résultats sont comparés au taux de croissance normal de la souche utilisée pour voir si le taux de croissance a augmenté, diminué ou n’a pas changé13.
La méthode de test électronique est habituellement effectuée pour tester la concentration minimale inhibitrice (CMI) où une bandelette contenant une concentration en gradient du médicament en question est posée sur une plaque inoculée. Il a également été utilisé pour tester la combinaison entre deux médicaments où deux bandes sont ajoutées à la plaque de manière perpendiculaire se croisant à leurs CMI13.
Selon la littérature, il n’y a pas d’étalon-or pour définir et étudier la synergie; ainsi, il est difficile d’évaluer laquelle des méthodes utilisées pour étudier la combinaison est la meilleure et laquelle produit des résultats meilleurs et plus fiables principalement13. Cependant, le test Time-kill est laborieux, long et coûteux15,16,tandis que la méthode E-test est développée pour étudier une combinaison entre deux médicaments seulement. Damier peut étudier toutes les combinaisons possibles entre les deux médicaments testés et c’est pourquoi cette technique a été choisie pour être développée.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330000402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330-0013-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>For drug 3 and 4 preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polysterene round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm petri dishes</td>
			<td>JRZ Plastilab</td>
			<td></td>
			<td>As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>For serial diltuion and combining drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole</td>
			<td>By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France</td>
			<td>10177403</td>
			<td>Drug 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceforane, 1 g (Cefotaxime)</td>
			<td>PHARCO Pharmaceuticals</td>
			<td>24750/2006</td>
			<td>Drug 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli ESBL strain</td>
			<td>Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon</td>
			<td></td>
			<td>Bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Conkey + crystal violet agar</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>64169508</td>
			<td>For making agar plates used for subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)</td>
			<td>HIKMA Pharmaceuticals</td>
			<td>2BXMIA56N-AEF</td>
			<td>Drug 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>69444</td>
			<td>For making bacterial media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>GJ54761</td>
			<td>For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OH19855 HH40868</td>
			<td>For the addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)</td>
			<td>sanofi aventis</td>
			<td>221937/2009</td>
			<td>Drug 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations

Le concept de polythérapie devient très important, principalement avec l’augmentation drastique de la résistance aux médicaments. Le quadruple damier, également appelé q-damier, vise à maximiser le nombre de combinaisons possibles qui peuvent être obtenues entre quatre médicaments dans une expérience pour minimiser le temps et le travail nécessaires pour obtenir les mêmes résultats avec d’autres protocoles. Ce protocole est basé sur la technique simple de micro dilution où les médicaments sont dilués et combinés ensemble dans plusieurs plaques de 96 puits.
Dans la première série de plaques de 96 puits, le bouillon Muller-Hinton est ajouté suivi du premier médicament requis (par exemple, le céfotaxime ici) pour le diluer en série. Une fois la première étape terminée, un autre ensemble de plaques de 96 puits est utilisé pour diluer le deuxième médicament (par exemple, Amikaci), qui sera transféré en enlevant un volume spécifique de médicament 2 et mis dans les puits correspondants dans le premier ensemble de plaques de 96 puits qui contient le médicament un. La troisième étape consiste à ajouter les concentrations requises du troisième médicament (p. ex. lévofloxacine) aux plaques appropriées de l’ensemble initial contenant la combinaison des médicaments 1 et 2. La quatrième étape consiste à ajouter les concentrations requises du quatrième médicament (p. ex. triméthoprime-sulfaméthoxazol) dans les plaques appropriées de la première série. Ensuite, l’inoculum bactérien E. coli ESBL sera préparé et ajouté.
Cette méthode est importante pour évaluer toutes les combinaisons possibles et offre un plus large éventail de possibilités à tester en outre pour les tests in vivo. Bien qu’il s’agisse d’une technique fatigante nécessitant beaucoup de concentration, les résultats sont remarquables et permettent de gagner du temps où de nombreuses combinaisons peuvent être testées dans une seule expérience.

La figure 2A représente les résultats obtenus en combinant le céfotaxime et l’amikacine avec des concentrations spécifiques de lévofloxacine et de triméthoprime-sulfaméthoxazole. Nous pouvons voir dans la partie gauche de la figure les quatre plaques qui sont schématiquement présentées avec les concentrations des médicaments dans la partie droite de la figure. Les flèches représentent les puits de l’interface Croissance/pas de croissance. Les puits colorés sont les puits qu...

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Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

Ce protocole décrit comment étudier toutes les combinaisons possibles qui peuvent être obtenues entre quatre médicaments dans une seule expérience. Cette méthode est basée sur l’essai standard de micro dilution sur plaque de 96 puits et sur le calcul des concentrations inhibitrices fractionnaires (FICs) pour évaluer les résultats.

Quadruple-Damier : Une modification du Damier tridimensionnel pour l’étude des combinaisons de médicaments

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

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