Name: quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations
Uploaded: 2021-07-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations at JoVE.com

1. Forberedelsestrinn
<ol><li>Forbered Muller-Hinton kjøttkraft (MHB) ved å tilsette 25 g MH kjøttkraft til 1 L destillert vann og bland. Autoklav ved 121 °C i 2,5 timer. Deretter lagrer du det autoklavede mediet ved romtemperatur eller i kjøleskapet.</li>
	<li>Subkultur de aktuelle bakteriene (E. coli ESBL) på agarmediene ved hjelp av den fire-kvadrant stripemetoden og inkubere over natten ved 37 °C.<ol>
<li>Bruk en steril sløyfe, ta en koloni og spre den i første halvdel av MacConkey agarplaten ved ...

<ol>
	<li>Ibezim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+resistance+to+antibiotics.">Microbial resistance to antibiotics.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).</li><li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistance+crisis:+part+1:+causes+and+threats.">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P &amp; T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li><li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antibiotics:+Are+we+in+the+post-antibiotic+era.">Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era.</a> Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+at+the+crossroads.">Antibiotics at the crossroads.</a> Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).</li><li>Bollenbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+interactions:+mechanisms+and+implications+for+drug+discovery+and+resistance+evolution.">Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).</li><li>Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+antibiotic+resistance+in+common+infectious+diseases:+role+of+antibiotic+combination+therapy.">Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy.</a> Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).</li><li>Chanda, S., Rakholiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy:+Synergism+between+natural+plant+extracts+and+antibiotics+against+infectious+diseases.">Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases.</a> Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).</li><li>Cottarel, G., Wierzbowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+drugs,+an+emerging+option+for+antibacterial+therapy.">Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy.</a> Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).</li><li>Kristiansen, J., Amaral, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+management+of+resistant+infection+with+non-antibiotics.">The potential management of resistant infection with non-antibiotics.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).</li><li>Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+for+treatment+of+infections+with+gram-negative+bacteria.">Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria.</a> Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).</li><li>Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+of+antimicrobial+therapy.">General principles of antimicrobial therapy.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).</li><li>Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+combinations:+Should+they+be+tested.">Antibiotic combinations: Should they be tested.</a> Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).</li><li>Doern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+does+2+plus+2+equal+5?+A+review+of+antimicrobial+synergy+testing.">When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li><li>Stein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+checkerboard+synergy+analysis+of+colistin,+meropenem,+tigecycline+against+multidrug-resistant+clinical+klebsiella+pneumonia+isolates.">Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates.</a> PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).</li><li>Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+essential+oil+components+and+antibiotics:+a+review.">Synergy between essential oil components and antibiotics: a review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).</li><li>Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-kill+assay+and+Etest+evaluation+for+synergy+with+polymyxin+B+and+fluconazole+against+Candida+glabrata.">Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).</li></ol>

Quadruple Checkerboard-metoden ligner sjakkbrettet og det tredimensjonale sjakkbrettet i protokollen. Imidlertid bør det tas hensyn til visse viktige skritt for å unngå feil under eksperimentet.
Sørg for å teste for MIC for hvert legemiddel mot den testede isolasjonen før du starter protokollen for å vite hva som er konsentrasjonene som trengs for å starte fortynning med for legemiddel 1 og legemiddel 2 som må fortynnes serielt i platene. Når det gjelder legemiddel 3 og legemiddel 4,...

Med økningen i motstand på grunn av overforbruk og misbruk av antibiotika1,2, har behovet for å utvikle nye stoffer og midler for å behandle bakterielle infeksjoner blitt avgjørende. Nye tilnærminger som utvikling av nye legemidler er svært viktig for å overvinne motstandskrisen. Den farmasøytiske industrien er imidlertid ikke interessert i å utvikle nye antimikrobielle midler. Videre, hvis nye stoffer utvikles, vil bakterier fortsette å utvikle seg og utvikle motstand mot disse nye stoffene3,4. Dermed vil problemet med motstand ikke bli løst, noe som gjør behovet for en annen tilnærming til et must som bør vurderes og studeres for å overvinne bakteriell motstand.
Legemiddelkombinasjon er et svært viktig konsept for behandling av bakterielle infeksjoner hovedsakelig de som er forårsaket av multidrug-resistente patogener5,6. Det reduserer behandlingsforløpet, reduserer dosen som er gitt; Dermed reduserer toksisiteten til det gitte stoffet, bidrar til å redusere graden av motstandsutvikling og på en måte sensibiliserer bakteriene til de gitte stoffene som beskrevet i begrepet sikkerhetsfølsomhet5,7,8,9.
Motstandsutvikling til ett stoff krever en enkelt mutasjon; Resistensutviklingen mot en kombinasjon av legemidler rettet mot flere veier krever imidlertid flere uavhengige mutasjoner som bremses av denne kombinasjonen. Et eksempel på redusert motstand mens du bruker kombinasjonsterapi er den reduserte motstandshastigheten mot Rifampin i Mycobacterium Tuberculosis10. Et annet eksempel er en studie gjort av Gribble et al. som viste frekvensen av fremveksten av resistente stammer hos pasienter som tar Piperacillin alene for å være høyere enn hos de som tar en kombinasjon av karboksypenicillin og aminoglykosid10. Studier har vist at resistensutvikling mot aminoglykosider i utviklende bakterier gjorde disse stammene følsomme for ulike andre legemidler5. Kombinasjonen mellom beta-laktam klasse stoffet amoksicillin og laktamasehemmeren clavulanic acid viste suksess i behandling av resistente bakteriestammer8.
Å redusere behandlingstidspunktet er en god fordel som følge av legemiddelkombinasjoner. For eksempel vil en terapi av kombinert penicillin eller ceftriaxon med gentamicin i 2 uker gi samme effekt gitt av penicillin eller ceftriaxon alene når det gis i 4 uker11. Kombinere medisiner gjør det mulig å bruke lavere doser av legemidler som ikke er effektive når de gis alene, for eksempel Sub-MICene. Eksempelet på sulfonamider kan gis der bruk av trippel-sulfonamider minimerer, ved lavere doser, toksisiteten som produseres som er krystalldannelse eller krystalliuri ved bruk av uoppløselige sulfonamider ved fulle doser12.
Dermed vil reduksjon av doseringen gitt og behandlingstidspunktet til slutt redusere toksisiteten til legemidlene på kroppen. Ideen om å utvikle metoder for å vurdere samspillet mellom kombinerte legemidler er svært viktig. I en studie viste resultatene at kombinasjonsterapi er mer effektiv for behandling av resistente arter av Acinetobacter og P. aeruginosa8.
Gi narkotika i kombinasjon Det finnes forskjellige metoder som vi kan studere stoffkombinasjoner, for eksempel checkerboard-metoden, time-kill kurvemetoden og E-testmetoden13. Checkerboard-metoden kan studere alle mulige kombinasjoner mellom de to aktuelle stoffene i selve eksperimentet. I tillegg ble det utviklet for å studere en kombinasjon av tre stoffer14. Nå utvider vi dette for å studere en kombinasjon av fire stoffer hovedsakelig for behandling av multidrug-resistente patogener.
Tidsdrepende kurveanalysen utføres vanligvis for å teste for bakteriedrepende effekten av et bestemt stoff. Det ble også brukt til å teste effekten av legemiddelkombinasjoner der flere stoffer kombineres ved spesifikke konsentrasjoner. Denne protokollen krever tilberedning av flere sterile rør eller kopper der vi i hver kopp legger til buljongen, kombinasjonen av narkotika og den nødvendige bakteriestammen. Etter inkubasjon og registrering av den optiske tettheten på flere tidspunkter, sammenlignes resultatene med den normale vekstraten for den brukte stammen for å se om vekstraten økte, reduserte eller ikke endretseg 13.
E-testmetode gjøres vanligvis for å teste for den minimale hemmende konsentrasjonen (MIC) der en stripe som inneholder en gradientkonsentrasjon av det aktuelle stoffet, settes på en inokulert plate. Det ble også brukt til å teste kombinasjonen mellom to stoffer der to strimler legges til platen på en vinkelrett måte som krysser ved DERES MIC13.
Ifølge litteraturen er det ingen gullstandard for å definere og studere synergi; Dermed er det vanskelig å vurdere hvilken av metodene som brukes til å studere kombinasjon er bedre og hvilken som gir bedre og mer pålitelige resultater hovedsakelig13. Imidlertid er Time-kill analyse arbeidsintensiv, tidkrevende og dyr15,16, mens E-testmetoden er utviklet for å studere en kombinasjon mellom bare to stoffer. Checkerboard kan studere alle mulige kombinasjoner mellom de to legemidlene som er testet, og dette er grunnen til at denne teknikken er valgt til å utvikles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330000402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330-0013-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>For drug 3 and 4 preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polysterene round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm petri dishes</td>
			<td>JRZ Plastilab</td>
			<td></td>
			<td>As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>For serial diltuion and combining drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole</td>
			<td>By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France</td>
			<td>10177403</td>
			<td>Drug 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceforane, 1 g (Cefotaxime)</td>
			<td>PHARCO Pharmaceuticals</td>
			<td>24750/2006</td>
			<td>Drug 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli ESBL strain</td>
			<td>Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon</td>
			<td></td>
			<td>Bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Conkey + crystal violet agar</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>64169508</td>
			<td>For making agar plates used for subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)</td>
			<td>HIKMA Pharmaceuticals</td>
			<td>2BXMIA56N-AEF</td>
			<td>Drug 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>69444</td>
			<td>For making bacterial media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>GJ54761</td>
			<td>For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OH19855 HH40868</td>
			<td>For the addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)</td>
			<td>sanofi aventis</td>
			<td>221937/2009</td>
			<td>Drug 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations

Konseptet med legemiddelkombinasjonsterapi blir svært viktig, hovedsakelig med den drastiske økningen i resistens mot narkotika. Quadruple checkerboard, også kalt Q-checkerboard, tar sikte på å maksimere antall mulige kombinasjoner som kan oppnås mellom fire stoffer i ett eksperiment for å minimere tiden og arbeidet som trengs for å oppnå de samme resultatene med andre protokoller. Denne protokollen er basert på den enkle mikrofortynningsteknikken der stoffene fortynnes og kombineres sammen i flere 96-brønnsplater.
I det første settet med 96-brønnsplater tilsettes Muller-Hinton-kjøttkraft etterfulgt av det første nødvendige stoffet (f.eks. Cefotaxime her) for å fortynne det serielt. Etter at det første trinnet er gjort, brukes et annet sett med 96-brønnsplater til å fortynne det andre stoffet (f.eks. Amikaci), som vil bli overført ved å fjerne et bestemt volum av legemiddel 2 og sette inn de tilsvarende brønnene i det første settet med 96-brønnsplater som inneholder stoff en. Det tredje trinnet gjøres ved å legge til de nødvendige konsentrasjonene av det tredje stoffet (f.eks. Levofloxacin), til de riktige platene i det første settet som inneholder kombinasjon av legemiddel 1 og 2. Det fjerde trinnet gjøres ved å legge til de nødvendige konsentrasjonene av det fjerde stoffet (f.eks. Trimethoprim-sulfametoksazol) i de riktige platene i det første settet. Deretter vil E. coli ESBL bakteriell inoculum bli forberedt og tilsatt.
Denne metoden er viktig for å evaluere alle mulige kombinasjoner og har et bredere spekter av muligheter som skal testes videre for in vivo-testing. Til tross for at det er en slitsom teknikk som krever mye fokus, er resultatene bemerkelsesverdige og tidsbesparende der mange kombinasjoner kan testes i et enkelt eksperiment.

Figur 2A representerer resultatene oppnådd ved å kombinere Cefotaxime og Amikacin med spesifikke konsentrasjoner av Levofloxacin og Trimethoprim-sulfametoksazol. Vi kan se i venstre del av figuren de fire platene som skjematisk presenteres med konsentrasjonene av stoffene i høyre del av figuren. Pilene representerer brønnene på vekst/ingen vekst-grensesnittet. De fargede brønnene er brønnene som inneholder vekst. Vi merker at den fjerde platen ikke inneholder vekst i kvadranten som in...

Watch this Scientific Journal Video about Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations at JoVE.com

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

Denne protokollen beskriver hvordan man studerer alle mulige kombinasjoner som kan oppnås mellom fire legemidler i ett enkelt eksperiment. Denne metoden er basert på standard 96-brønns mikrofortynningsanalyse og beregning av fraksjonelle hemmende konsentrasjoner (FICer) for å evaluere resultatene.

Firedoble sjakkbrett: En modifikasjon av det tredimensjonale sjakkbrettet for å studere stoffkombinasjoner

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biology

Unit 1

Pharmacodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Et analytisk verktøy som kvantifiserer Cellular Morfologi Endringer fra Tredimensjonal fluorescens bilder

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Ved hjelp av høyoppløselig CT for å visualisere tredimensjonale struktur og funksjon Plant vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Påvisning av Levende<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler ved PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging i Tredimensjonal Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

3-dimensjonal modell av vaskulær arkitekturen av passiv KLARHET klarert musen eggstokkene

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: En vev fjerne metoden for tredimensjonale Imaging av fettvev

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

En BW Reporter System for å studere reseptor-Ligand interaksjoner

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...