Name: quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations
Uploaded: 2021-07-24T14:30:00
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1. Etapas de preparação
<ol><li>Prepare o caldo Muller-Hinton (MHB) adicionando 25 g de caldo MH a 1 L de água destilada e misture. Autoclave a 121 °C por 2,5 h. Em seguida, armazene a mídia autoclaved em temperatura ambiente ou na geladeira.</li>
	<li>Subcultura as bactérias em questão (E. coli ESBL) na mídia ágar usando o método de listras de quatro quadrantes e incubar durante a noite a 37 °C.<ol>
<li>Usando um laço estéril, pegue uma colônia e espalhe-a na primeira metade da placa de ágar Ma...

<ol>
	<li>Ibezim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+resistance+to+antibiotics.">Microbial resistance to antibiotics.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).</li><li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistance+crisis:+part+1:+causes+and+threats.">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P &amp; T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li><li>Alanis, A. 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A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li><li>Stein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+checkerboard+synergy+analysis+of+colistin,+meropenem,+tigecycline+against+multidrug-resistant+clinical+klebsiella+pneumonia+isolates.">Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates.</a> PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).</li><li>Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+essential+oil+components+and+antibiotics:+a+review.">Synergy between essential oil components and antibiotics: a review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).</li><li>Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-kill+assay+and+Etest+evaluation+for+synergy+with+polymyxin+B+and+fluconazole+against+Candida+glabrata.">Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).</li></ol>

O método De checkerboard quádruplo se assemelha ao tabuleiro de xadrez e ao tabuleiro de damas tridimensional em seu protocolo. No entanto, certas medidas cruciais devem ser tomadas em consideração para evitar erros durante o experimento.
Certifique-se de testar para o MIC de cada droga contra o isolado testado antes de iniciar o protocolo para saber quais são as concentrações necessárias para iniciar as diluições com a droga 1 e a droga 2 que precisam ser diluídas em série nas pla...

Com o aumento da resistência devido ao uso excessivo e uso indevido de antibióticos1,2, a necessidade de desenvolver novos medicamentos e agentes para tratar infecções bacterianas tornou-se crucial. Novas abordagens como o desenvolvimento de novas drogas são muito importantes para superar a crise de resistência. No entanto, a indústria farmacêutica não está interessada em desenvolver novos agentes antimicrobianos. Além disso, se novas drogas forem desenvolvidas, as bactérias continuarão evoluindo e desenvolvendo resistência contra essas novas drogas3,4. Assim, o problema de resistência não será resolvido, tornando a necessidade de outra abordagem uma obrigação que deve ser considerada e estudada para superar a resistência bacteriana.
A combinação de medicamentos é um conceito muito importante para o tratamento de infecções bacterianas principalmente aquelas causadas por patógenos resistentes a multidroga5,6. Diminui o curso do tratamento, diminui a dose dada; assim, a diminuição da toxicidade da determinada droga, ajuda a diminuir a taxa de desenvolvimento de resistência e, de certa forma, sensibiliza a bactéria aos medicamentos fornecidos como descrito no conceito de sensibilidade colateral5,7,8,9.
O desenvolvimento da resistência a uma droga requer uma única mutação; no entanto, o desenvolvimento da resistência a uma combinação de drogas que visam múltiplas vias requer várias mutações independentes que são por essa combinação. Um exemplo para a diminuição da resistência ao usar a terapia combinada é a diminuição da taxa de resistência ao Rifampin no Mycobacterium Tuberculosis10. Outro exemplo é um estudo feito por Gribble et al. que mostrou que a taxa de surgimento de cepas resistentes em pacientes que tomam Piperacillin sozinha para ser maior do que naquelas que tomam uma combinação de carboxipenicilina e aminoglycoside10. Estudos têm demonstrado que o desenvolvimento da resistência aos aminoglicosídeos em bactérias em evolução tornou essas cepas sensíveis a várias outras drogas5. A combinação entre a amoxicilina da droga classe beta-lactam e o ácido clavulanic inibidor de lactamase mostrou sucesso no tratamento de cepas bacterianas resistentes8.
Diminuir o tempo de tratamento é uma boa vantagem resultante de combinações de medicamentos. Por exemplo, uma terapia de penicilina combinada ou ceftriaxona com gentamicina por 2 semanas dará a mesma eficácia dada apenas por penicilina ou ceftriaxona quando dada apenas por 4 semanas11. A combinação de medicamentos permite o uso de doses mais baixas de drogas que não são eficazes quando dadas sozinhas, como os Sub-MICs. O exemplo de sulfonamidas pode ser dado quando o uso de sulfonamidas triplas minimiza, em doses mais baixas, a toxicidade produzida que é a formação de cristais ou cristalizatória ao usar sulfonamidas insolúveis em doses completas12.
Assim, a diminuição da dosagem dada e o tempo de tratamento acabarão por diminuir a toxicidade das drogas no corpo. A ideia de desenvolver métodos para avaliar a interação entre drogas combinadas é muito importante. Em um estudo, os resultados mostraram que a terapia combinada é mais eficaz para o tratamento de espécies resistentes de Acinetobacter e P. aeruginosa8.
Dando drogas em combinação Existem diferentes métodos pelos quais podemos estudar combinações de medicamentos, como o método de tabuleiro de xadrez, o método de curva de morte de tempo e o método de teste E13. O método de checkerboard pode estudar todas as combinações possíveis entre as duas drogas em questão em um experimento em si. Além disso, foi desenvolvido para estudar uma combinação de três fármacos14. Agora, estendemos isso para estudar uma combinação de quatro drogas principalmente para o tratamento de patógenos multidroga resistentes.
O ensaio da curva de morte de tempo é geralmente realizado para testar o efeito bactericida de uma determinada droga. Também foi usado para testar o efeito de combinações de drogas onde várias drogas são combinadas em concentrações específicas. Este protocolo requer a preparação de vários tubos ou copos estéreis onde em cada xícara adicionamos o caldo, a combinação de drogas e a cepa bacteriana necessária. Após a incubação e registro da densidade óptica em vários pontos de tempo, os resultados são comparados com a taxa de crescimento normal da cepa utilizada para ver se a taxa de crescimento aumentou, diminuiu ou não mudou13.
O método de teste eletrônico é geralmente feito para testar a concentração inibitória mínima (MIC) onde uma tira contendo uma concentração gradiente da droga em questão é colocada em uma placa inoculada. Também foi usado para testar a combinação entre duas drogas onde duas tiras são adicionadas à placa de forma perpendicular cruzando seus MICs13.
Segundo a literatura, não há padrão-ouro para definir e estudar sinergia; assim, é difícil avaliar qual dos métodos utilizados para estudar a combinação é melhor e qual produz resultados melhores e mais confiáveis principalmente13. No entanto, o ensaio de morte por tempo é intensivo em trabalho, demorado e caro15,16, enquanto o método de teste eletrônico é desenvolvido para estudar uma combinação entre apenas duas drogas. O Checkerboard pode estudar todas as combinações possíveis entre as duas drogas testadas e é por isso que esta técnica foi escolhida para ser desenvolvida.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330000402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330-0013-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>For drug 3 and 4 preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polysterene round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm petri dishes</td>
			<td>JRZ Plastilab</td>
			<td></td>
			<td>As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>For serial diltuion and combining drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole</td>
			<td>By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France</td>
			<td>10177403</td>
			<td>Drug 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceforane, 1 g (Cefotaxime)</td>
			<td>PHARCO Pharmaceuticals</td>
			<td>24750/2006</td>
			<td>Drug 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli ESBL strain</td>
			<td>Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon</td>
			<td></td>
			<td>Bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Conkey + crystal violet agar</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>64169508</td>
			<td>For making agar plates used for subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)</td>
			<td>HIKMA Pharmaceuticals</td>
			<td>2BXMIA56N-AEF</td>
			<td>Drug 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>69444</td>
			<td>For making bacterial media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>GJ54761</td>
			<td>For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OH19855 HH40868</td>
			<td>For the addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)</td>
			<td>sanofi aventis</td>
			<td>221937/2009</td>
			<td>Drug 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations

O conceito de terapia de combinação de drogas está se tornando muito importante principalmente com o aumento drástico da resistência às drogas. O tabuleiro de xadrez Quádruplo, também chamado de Q-checkerboard, visa maximizar o número de combinações possíveis que podem ser obtidas entre quatro drogas em um experimento para minimizar o tempo e o trabalho necessários para alcançar os mesmos resultados com outros protocolos. Este protocolo baseia-se na simples técnica de micro diluição onde as drogas são diluídas e combinadas em várias placas de 96 poços.
No primeiro conjunto de placas de 96 poços, o caldo Muller-Hinton é adicionado seguido pela primeira droga necessária (por exemplo, Cefotaxime aqui) para diluí-lo em série. Após o primeiro passo, outro conjunto de placas de 96 poços é usado para diluir a segunda droga (por exemplo, Amikaci), que será transferida removendo um volume específico de droga 2 e colocada nos poços correspondentes no primeiro conjunto de placas de 96 poços que contém uma droga. O terceiro passo é feito adicionando as concentrações necessárias da terceira droga (por exemplo, Levofloxacin), às placas apropriadas no conjunto inicial contendo combinação de droga 1 e 2. O quarto passo é feito adicionando as concentrações necessárias da quarta droga (por exemplo, Trimethoprim-sulfamethoxazol) nas placas apropriadas no primeiro conjunto. Em seguida, o inóculo bacteriano E. coli ESBL será preparado e adicionado.
Este método é importante para avaliar todas as combinações possíveis e tem uma gama mais ampla de possibilidades a serem testadas além para testes in vivo. Apesar de ser uma técnica cansativa que requer muito foco, os resultados são notáveis e economizam tempo onde muitas combinações podem ser testadas em um único experimento.

A Figura 2A representa os resultados obtidos pela combinação de Cefotaxime e Amikacin com concentrações específicas de Levofloxacina e Trimetoprim-sulfametoxazol. Podemos ver na parte esquerda da figura as quatro placas que são esquemáticamente apresentadas com as concentrações das drogas na parte direita da figura. As setas representam os poços na interface Crescimento/sem Crescimento. Os poços coloridos são os poços que contêm crescimento. Notamos que a quarta placa não cont...

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Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

Este protocolo descreve como estudar todas as combinações possíveis que podem ser obtidas entre quatro drogas em um único experimento. Este método baseia-se no ensaio padrão de micro diluição de placas de 96 poços e no cálculo de concentrações inibitórias fracionárias (FICs) para avaliar os resultados.

Quadruplicar-Checkerboard: Uma modificação do tabuleiro de xadrez tridimensional para estudar combinações de medicamentos

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

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