Name: quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations
Uploaded: 2021-07-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations at JoVE.com

никакой.

1. Этапы подготовки
<ol><li>Приготовьте бульон Мюллера-Хинтона (MHB), добавив 25 г бульона MH в 1 л дистиллированной воды и перемешайте. Автоклав при 121 °C в течение 2,5 ч. Затем храните автоклавные среды при комнатной температуре или в холодильнике.</li>
	<li>Субкультура рассматриваемых бактерий(E. c...

<ol>
	<li>Ibezim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+resistance+to+antibiotics.">Microbial resistance to antibiotics.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).</li><li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistance+crisis:+part+1:+causes+and+threats.">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P &amp; T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li><li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antibiotics:+Are+we+in+the+post-antibiotic+era.">Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era.</a> Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+at+the+crossroads.">Antibiotics at the crossroads.</a> Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).</li><li>Bollenbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+interactions:+mechanisms+and+implications+for+drug+discovery+and+resistance+evolution.">Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).</li><li>Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+antibiotic+resistance+in+common+infectious+diseases:+role+of+antibiotic+combination+therapy.">Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy.</a> Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).</li><li>Chanda, S., Rakholiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy:+Synergism+between+natural+plant+extracts+and+antibiotics+against+infectious+diseases.">Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases.</a> Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).</li><li>Cottarel, G., Wierzbowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+drugs,+an+emerging+option+for+antibacterial+therapy.">Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy.</a> Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).</li><li>Kristiansen, J., Amaral, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+management+of+resistant+infection+with+non-antibiotics.">The potential management of resistant infection with non-antibiotics.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).</li><li>Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+for+treatment+of+infections+with+gram-negative+bacteria.">Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria.</a> Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).</li><li>Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+of+antimicrobial+therapy.">General principles of antimicrobial therapy.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).</li><li>Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+combinations:+Should+they+be+tested.">Antibiotic combinations: Should they be tested.</a> Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).</li><li>Doern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+does+2+plus+2+equal+5?+A+review+of+antimicrobial+synergy+testing.">When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li><li>Stein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+checkerboard+synergy+analysis+of+colistin,+meropenem,+tigecycline+against+multidrug-resistant+clinical+klebsiella+pneumonia+isolates.">Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates.</a> PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).</li><li>Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+essential+oil+components+and+antibiotics:+a+review.">Synergy between essential oil components and antibiotics: a review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).</li><li>Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-kill+assay+and+Etest+evaluation+for+synergy+with+polymyxin+B+and+fluconazole+against+Candida+glabrata.">Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).</li></ol>

Метод четверной шаховой доски напоминает в своем протоколе шаховую доску и трехмерную шакерную доску. Тем не менее, некоторые важные шаги должны быть приняты во внимание, чтобы избежать ошибок во время эксперимента.
Обязательно проверьте MIC каждого лекарственного средс?...

С увеличением резистентности из-за чрезмерного и неправильного использованияантибиотиков 1,2,необходимость разработки новых лекарств и средств для лечения бактериальных инфекций стала решающей. Новые подходы, такие как разработка новых лекарств, очень важны для преодоления кризиса резистентности. Однако фармацевтическая промышленность не заинтересована в разработке новых противомикробных средств. Более того, если будут разработаны новые лекарства, бактерии будут продолжать развиваться и развивать устойчивость к этим новымпрепаратам3,4. Таким образом, проблема резистентности не будет решена, что делает необходимость другого подхода обязательным, который следует рассмотреть и изучить для преодоления бактериальной резистентности.
Комбинация препаратов является очень важным понятием для лечения бактериальных инфекций преимущественно тех, которые вызваны мультилекарственными возбудителями5,6. Уменьшает курс лечения, уменьшает дозу, вводимую; Таким образом, уменьшая токсичность данного препарата, способствует снижению скорости развития резистентности и, в некотором роде, сенсибилизирует бактерии к данным препаратам, как описано в концепции коллатеральнойчувствительности 5,7,8,9.
Развитие резистентности к одному препарату требует одной мутации; однако развитие резистентности к комбинации препаратов, нацеленных на несколько путей, требует нескольких независимых мутаций, которые замедляются этой комбинацией. Примером снижения резистентности при использовании комбинированной терапии является снижение скорости резистентности к рифампину у МикобактерийТуберкулеза 10. Другим примером является исследование, проведенное Gribble et al., которое показало, что скорость появления резистентных штаммов у пациентов, принимающих только Пиперациллин, выше, чем у тех, кто принимал комбинацию карбоксипенициллина и аминогликозид10. Исследования показали, что развитие устойчивости к аминогликозидам у эволюционирующих бактерий сделало эти штаммы чувствительными к различным другим препаратам5. Комбинация между препаратом класса бета-лактам амоксициллином и ингибитором лактамазы клавулановой кислотой показала успех в лечении резистентных бактериальных штаммов8.
Сокращение времени лечения является хорошим преимуществом, полученным в результате комбинаций препаратов. Например, терапия комбинированным пенициллином или цефтриаксоном с гентамицином в течение 2 недель даст такую же эффективность, как и пенициллин или цефтриаксон в одиночку при 4 неделях11. Комбинирование лекарств позволяет использовать более низкие дозы лекарств, которые не эффективны при одном применении, такие как Суб-МИК. Пример сульфаниламидов может быть приведен там, где применение тройных сульфаниламидов минимизирует при более низких дозах токсичность, возникает кристаллообразование или кристаллурия при использовании нерастворимых сульфаниламидов в полных дозах12.
Таким образом, уменьшение дозировки и времени лечения в конечном итоге уменьшит токсичность лекарств для организма. Идея разработки методов оценки взаимодействия между комбинированными препаратами очень важна. В одном исследовании результаты показали, что комбинированная терапия более эффективна для лечения резистентных видов Acinetobacter и P. aeruginosa8.
Давать препараты в комбинации Существуют различные методы, с помощью которых мы можем изучать комбинации лекарств, такие как метод шашечки, метод кривой временного убийства и методE-теста 13. Метод шашек может изучить все возможные комбинации между двумя рассматриваемыми препаратами в одном эксперименте. Кроме того, он был разработан для изучения комбинации трех препаратов14. Теперь мы расширяем это для изучения комбинации четырех препаратов в основном для лечения патогенов с множественной лекарственной устойчивостью.
Анализ кривой временного убийства обычно выполняется для проверки бактерицидного эффекта определенного препарата. Он также использовался для проверки эффекта комбинаций лекарств, где несколько препаратов объединяются в определенных концентрациях. Этот протокол требует приготовления нескольких стерильных пробирок или чашек, куда в каждую чашку мы добавляем бульон, комбинацию препаратов и необходимый бактериальный штамм. После инкубации и регистрации оптической плотности в нескольких временных точках результаты сравнивают с нормальной скоростью роста используемого штамма, чтобы увидеть, увеличилась ли скорость роста, уменьшилась или не изменилась13.
Метод E-теста обычно проводится для проверки минимальной ингибирующей концентрации (MIC), когда полоска, содержащая градиентную концентрацию рассматриваемого лекарственного средства, наносится на инокулированную пластину. Он также использовался для тестирования комбинации между двумя препаратами, где две полоски добавляются к пластине перпендикулярным образом, пересекаясь на их МИК13.
Согласно литературе, не существует золотого стандарта для определения и изучения синергии; Таким образом, трудно оценить, какой из методов, используемых для изучения комбинации, лучше, а какой дает лучшие и более достоверные результаты, главным образом13. Тем не менее, анализ Time-kill является трудоемким, трудоемким и дорогим15,16,в то время как метод E-test разработан для изучения комбинации только между двумя препаратами. Шачка может изучать все возможные комбинации между двумя протестированными препаратами, и именно поэтому эта методика была выбрана для разработки.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330000402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330-0013-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>For drug 3 and 4 preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polysterene round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm petri dishes</td>
			<td>JRZ Plastilab</td>
			<td></td>
			<td>As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>For serial diltuion and combining drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole</td>
			<td>By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France</td>
			<td>10177403</td>
			<td>Drug 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceforane, 1 g (Cefotaxime)</td>
			<td>PHARCO Pharmaceuticals</td>
			<td>24750/2006</td>
			<td>Drug 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli ESBL strain</td>
			<td>Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon</td>
			<td></td>
			<td>Bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Conkey + crystal violet agar</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>64169508</td>
			<td>For making agar plates used for subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)</td>
			<td>HIKMA Pharmaceuticals</td>
			<td>2BXMIA56N-AEF</td>
			<td>Drug 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>69444</td>
			<td>For making bacterial media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>GJ54761</td>
			<td>For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OH19855 HH40868</td>
			<td>For the addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)</td>
			<td>sanofi aventis</td>
			<td>221937/2009</td>
			<td>Drug 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations

Концепция лекарственно-комбинированной терапии приобретает очень важное значение в основном с резким повышением резистентности к лекарственным препаратам. Четверная шашь, также называемая Q-checkerboard, направлена на максимизацию количества возможных комбинаций, которые могут быть получены между четырьмя препаратами в одном эксперименте, чтобы минимизировать время и работу, необходимые для достижения тех же результатов с другими протоколами. Этот протокол основан на простой технике микроразбавления, где препараты разбавляются и объединяются вместе в нескольких 96-скважинных пластинах.
В первый набор 96-скважинных пластин добавляется бульон Мюллера-Хинтона, за которым следует первый необходимый препарат (например, цефотаксим здесь), чтобы последовательно разбавлять его. После того, как первая ступень выполнена, другой набор 96-скважинных пластин используется для разбавления второго лекарственного средства (например, Amikaci), который будет перенесен путем удаления определенного объема лекарственного средства 2 и помещен в соответствующие колодцы в первый набор пластин из 96-скважин, который содержит лекарственный один. Третий этап делают путем добавления требуемых концентраций третьего лекарственного средства (например, Левофлоксацина) к соответствующим пластинам в исходном наборе, содержащему комбинацию препарата 1 и 2. Четвертый этап делают путем добавления требуемых концентраций четвертого лекарственного средства (например, Триметоприма-сульфаметоксазола) в соответствующие пластины в первом наборе. Затем будет приготовлен и добавлен бактериальный инокулят E. coli ESBL.
Этот метод важен для оценки всех возможных комбинаций и имеет более широкий спектр возможностей для дальнейшего тестирования in vivo. Несмотря на то, что это утомительная техника, требующая большого внимания, результаты замечательны и экономят время, когда множество комбинаций может быть проверено в одном эксперименте.

Фиг.2А представляет результаты, полученные путем комбинирования цефотаксима и амикацина со специфическими концентрациями левофлоксацина и триметоприма-сульфаметоксазола. Мы можем видеть в левой части рисунка четыре пластины, которые схематично представлены с концен...

Watch this Scientific Journal Video about Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations at JoVE.com

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

Этот протокол описывает, как изучить все возможные комбинации, которые могут быть получены между четырьмя препаратами в одном эксперименте. Этот метод основан на стандартном анализе микроразбавления пластинок 96 скважин и расчете фракционных ингибирующих концентраций (FIC) для оценки результатов.

Четырехместная шачка: модификация трехмерной шапочка для изучения комбинаций лекарств

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biology

Unit 1

Pharmacodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

Чип основе трехмерной клеточной культуре в перфузии Микро-биореакторы

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Микротехнологий из Чип размером Строительные леса для трехмерного клеточного культивирования

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Привет-C: метод изучения трехмерной архитектуры геномов.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Аналитический инструмент, который количественно клеточные изменения морфологии от трехмерного изображения флуоресценции

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Использование компьютерной томографии высокого разрешения для визуализации трехмерной структуры и функции сосудистой завод

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Обнаружение эфир<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; O157: H7 Клетки по PMA-кПЦР

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET визуализации в трехмерных гидрогелей

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Трехмерная реконструкция сосудистой архитектуры пассивной очистили ЯСНОСТИ мыши яичника

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

ADIPO ясно: Ткани, очистка метод для трехмерных изображений жировой ткани

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Репортер BW системы для изучения взаимодействия рецептор лиганд

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...