Name: quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations
Uploaded: 2021-07-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations at JoVE.com

1. Förberedelsesteg
<ol><li>Förbered Muller-Hinton buljong (MHB) genom att lägga till 25 g MH-buljong till 1 L destillerat vatten och blanda. Autoklav vid 121 °C i 2,5 timmar. Förvara sedan de autoklaverade medierna i rumstemperatur eller i kylskåpet.</li>
	<li>Subkultur bakterierna i fråga(E. coli ESBL) på agarmedierna med hjälp av fyrkvadrantstrimmningsmetoden och inkubera över natten vid 37 °C.<ol>
<li>Använd en steril slinga, ta en koloni och sprid den i den första halvan av MacConkey agar-pla...

<ol>
	<li>Ibezim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+resistance+to+antibiotics.">Microbial resistance to antibiotics.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).</li><li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistance+crisis:+part+1:+causes+and+threats.">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P &amp; T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li><li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antibiotics:+Are+we+in+the+post-antibiotic+era.">Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era.</a> Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+at+the+crossroads.">Antibiotics at the crossroads.</a> Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).</li><li>Bollenbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+interactions:+mechanisms+and+implications+for+drug+discovery+and+resistance+evolution.">Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).</li><li>Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+antibiotic+resistance+in+common+infectious+diseases:+role+of+antibiotic+combination+therapy.">Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy.</a> Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).</li><li>Chanda, S., Rakholiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy:+Synergism+between+natural+plant+extracts+and+antibiotics+against+infectious+diseases.">Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases.</a> Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).</li><li>Cottarel, G., Wierzbowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+drugs,+an+emerging+option+for+antibacterial+therapy.">Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy.</a> Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).</li><li>Kristiansen, J., Amaral, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+management+of+resistant+infection+with+non-antibiotics.">The potential management of resistant infection with non-antibiotics.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).</li><li>Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+for+treatment+of+infections+with+gram-negative+bacteria.">Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria.</a> Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).</li><li>Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+of+antimicrobial+therapy.">General principles of antimicrobial therapy.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).</li><li>Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+combinations:+Should+they+be+tested.">Antibiotic combinations: Should they be tested.</a> Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).</li><li>Doern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+does+2+plus+2+equal+5?+A+review+of+antimicrobial+synergy+testing.">When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li><li>Stein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+checkerboard+synergy+analysis+of+colistin,+meropenem,+tigecycline+against+multidrug-resistant+clinical+klebsiella+pneumonia+isolates.">Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates.</a> PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).</li><li>Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+essential+oil+components+and+antibiotics:+a+review.">Synergy between essential oil components and antibiotics: a review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).</li><li>Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-kill+assay+and+Etest+evaluation+for+synergy+with+polymyxin+B+and+fluconazole+against+Candida+glabrata.">Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).</li></ol>

Quadruple Checkerboard-metoden liknar schackbrädet och den tredimensionella schackbrädet i protokollet. Vissa avgörande åtgärder bör dock beaktas för att undvika fel under försöket.
Se till att testa för MIC för varje läkemedel mot det testade isolatet innan du börjar protokollet för att veta vilka koncentrationer som behövs för att starta utspädningarna med för läkemedel 1 och läkemedel 2 som måste seriellt spädas i plattorna. När det gäller läkemedel 3 och läkemedel...

Med ökningen av resistens på grund av överanvändning och missbruk av antibiotika1,2, har behovet av att utveckla nya läkemedel och medel för att behandla bakteriella infektioner blivit avgörande. Nya metoder som att utveckla nya läkemedel är mycket viktiga för att övervinna motståndskrisen. Läkemedelsindustrin är dock inte intresserad av att utveckla nya antimikrobiella medel. Dessutom, om nya läkemedel utvecklas, kommer bakterier att fortsätta att utveckla och utveckla resistens mot dessa nya läkemedel3,4. Således kommer problemet med resistens inte att lösas, vilket gör behovet av ett annat tillvägagångssätt ett måste som bör övervägas och studeras för att övervinna bakteriell resistens.
Läkemedelskombination är ett mycket viktigt koncept för behandling av bakteriella infektioner främst de som orsakas av multiresistenta patogener5,6. Det minskar behandlingsloppet, minskar den angivna dosen; således minskar toxiciteten hos det givna läkemedlet, hjälper till att minska resistensutvecklingen och på ett sätt sensibiliserar bakterierna till de givna läkemedlen enligt beskrivningen i begreppet säkerhetskänslighet5,7,8,9.
Resistensutveckling mot ett läkemedel kräver en enda mutation; Resistensutveckling till en kombination av läkemedel som riktar sig mot flera vägar kräver dock flera oberoende mutationer som bromsas av denna kombination. Ett exempel på minskad resistens vid användning av kombinationsbehandling är den minskade resistensfrekvensen mot Rifampin vid Mycobacterium Tuberculosis10. Ett annat exempel är en studie gjord av Gribble et al. som visade att uppkomsten av resistenta stammar hos patienter som tar Piperacillin ensam är högre än hos dem som tar en kombination av karboxypenicillin och aminoglykosid10. Studier har visat att resistensutveckling mot aminoglykosider hos framväxande bakterier gjorde dessa stammar känsliga för olika andra läkemedel5. Kombinationen mellan beta-laktamklass läkemedlet amoxicillin och laktamashämmaren clavulanic syra visade framgång vid behandling av resistenta bakteriestammar8.
Att minska behandlingstiden är en bra fördel till följd av läkemedelskombinationer. Till exempel kommer en behandling av kombinerat penicillin eller ceftriaxon med gentamicin i 2 veckor att ge samma effekt som ges enbart av penicillin eller ceftriaxon när det ges i 4 veckor11. Att kombinera droger möjliggör användning av lägre doser av läkemedel som inte är effektiva när de ges ensamt såsom sub-MICs. Exemplet med sulfonamider kan ges där användningen av trippelsulfonamider vid lägre doser minimerar den toxicitet som produceras som kristallbildning eller kristallluri vid användning av olösliga sulfonamider vid fulla doser12.
Således, minska den angivna dosen och tidpunkten för behandlingen kommer så småningom att minska toxiciteten hos läkemedlen på kroppen. Idén att utveckla metoder för att bedöma samspelet mellan kombinerade läkemedel är mycket viktig. I en studie visade resultaten att kombinationsbehandling är effektivare för behandling av resistenta arter av Acinetobacter och P. aeruginosa8.
Ge droger i kombination Det finns olika metoder genom vilka vi kan studera läkemedelskombinationer, såsom schackbrädemetoden, metoden för tidsdödskurva och E-testmetoden13. Schackbrädemetoden kan studera alla möjliga kombinationer mellan de två drogerna i fråga i ett experiment självt. Dessutom utvecklades det för att studera en kombination av tre läkemedel14. Nu utvidgar vi detta för att studera en kombination av fyra läkemedel främst för behandling av multiresistenta patogener.
Tidsdödskurvans analys utförs vanligtvis för att testa för bakteriedödande effekten av ett visst läkemedel. Det användes också för att testa för effekten av läkemedelskombinationer där flera läkemedel kombineras vid specifika koncentrationer. Detta protokoll kräver beredning av flera sterila rör eller koppar där vi i varje kopp lägger till buljongen, kombinationen av droger och den nödvändiga bakteriestammen. Efter inkubation och registrering av den optiska densiteten vid flera tidpunkter jämförs resultaten med den normala tillväxttakten för den använda stammen för att se om tillväxttakten ökade, minskade eller inteändrades 13.
E-testmetod görs vanligtvis för att testa för den minimala hämmande koncentrationen (MIC) där en remsa som innehåller en gradientkoncentration av läkemedlet i fråga sätts på en inokulerad platta. Det användes också för att testa kombinationen mellan två droger där två remsor läggs till plattan på ett vinkelrätt sätt som skär vid deras MIC13.
Enligt litteraturen finns det ingen guldstandard att definiera och studera synergi; Således är det svårt att bedöma vilken av metoderna som används för att studera kombinationen är bättre och vilken som ger bättre och mer tillförlitliga resultat främst13. Tidsdödsanalys är dock arbetsintensiv, tidskrävande och dyr15,16, medan E-testmetoden utvecklas för att studera en kombination mellan endast två läkemedel. Checkerboard kan studera alla möjliga kombinationer mellan de två testade drogerna och det är därför denna teknik har valts för att utvecklas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330000402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330-0013-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>For drug 3 and 4 preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polysterene round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm petri dishes</td>
			<td>JRZ Plastilab</td>
			<td></td>
			<td>As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>For serial diltuion and combining drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole</td>
			<td>By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France</td>
			<td>10177403</td>
			<td>Drug 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceforane, 1 g (Cefotaxime)</td>
			<td>PHARCO Pharmaceuticals</td>
			<td>24750/2006</td>
			<td>Drug 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli ESBL strain</td>
			<td>Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon</td>
			<td></td>
			<td>Bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Conkey + crystal violet agar</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>64169508</td>
			<td>For making agar plates used for subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)</td>
			<td>HIKMA Pharmaceuticals</td>
			<td>2BXMIA56N-AEF</td>
			<td>Drug 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>69444</td>
			<td>For making bacterial media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>GJ54761</td>
			<td>For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OH19855 HH40868</td>
			<td>For the addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)</td>
			<td>sanofi aventis</td>
			<td>221937/2009</td>
			<td>Drug 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations

Begreppet läkemedelskombinationsterapi blir mycket viktigt främst med den drastiska ökningen av resistens mot droger. Quadruple schackbräde, även kallad Q-checkerboard, syftar till att maximera antalet möjliga kombinationer som kan erhållas mellan fyra läkemedel i ett experiment för att minimera den tid och det arbete som behövs för att uppnå samma resultat med andra protokoll. Detta protokoll är baserat på den enkla mikroutspädningstekniken där läkemedlen späds ut och kombineras i flera 96-brunnsplattor.
I den första uppsättningen 96-brunnsplattor tillsätts Muller-Hinton buljong följt av det första nödvändiga läkemedlet (t.ex. Cefotaxime här) för att seriellt späda ut det. När det första steget är klart används en annan uppsättning 96-brunnsplattor för att späda ut det andra läkemedlet (t.ex. Amikaci), som kommer att överföras genom att ta bort en specifik volym läkemedel 2 och sätta i motsvarande brunnar i den första uppsättningen 96-brunnsplattor som innehåller läkemedel. Det tredje steget görs genom att lägga till de nödvändiga koncentrationerna av det tredje läkemedlet (t.ex. Levofloxacin), till lämpliga plattor i den ursprungliga uppsättningen som innehåller en kombination av läkemedel 1 och 2. Det fjärde steget görs genom att lägga till de nödvändiga koncentrationerna av det fjärde läkemedlet (t.ex. Trimethoprim-sulfamethoxazol) i lämpliga plattor i den första uppsättningen. Sedan kommer E. coli ESBL bakteriell inokulat att beredas och tillsättas.
Denna metod är viktig för att utvärdera alla möjliga kombinationer och har ett bredare utbud av möjligheter att testas ytterligare för in vivo-testning. Trots att det är en tröttsam teknik som kräver mycket fokus är resultaten anmärkningsvärda och tidsbesparande där många kombinationer kan testas i ett enda experiment.

Figur 2A representerar de resultat som erhålls genom att kombinera Cefotaxime och Amikacin med specifika koncentrationer av Levofloxacin och Trimethoprim-sulfamethoxazole. Vi kan se i den vänstra delen av figuren de fyra plattorna som schematiskt presenteras med koncentrationerna av drogerna i den högra delen av figuren. Pilarna representerar brunnarna på gränssnittet Tillväxt/ingen tillväxt. De färgade brunnarna är brunnarna som innehåller tillväxt. Vi märker att den fjärde pla...

Watch this Scientific Journal Video about Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations at JoVE.com

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

Detta protokoll beskriver hur man studerar alla möjliga kombinationer som kan erhållas mellan fyra läkemedel i ett enda experiment. Denna metod är baserad på standardanalysen för mikrospädning av 96-brunnar och beräkningen av fraktionerade hämmande koncentrationer (FIC) för att utvärdera resultaten.

Fyrdubbel schackbräde: En ändring av den tredimensionella schackbrädet för studier av läkemedelskombinationer

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biology

Unit 1

Pharmacodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

Chip-baserade tredimensionella Cell Kultur i perfusion Micro-bioreaktorer

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Mikrofabrikation av Chip-storlek Byggnadsställningar för tredimensionell cellodling

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: En metod för att studera den tredimensionella arkitektur för ledare.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Ett analysverktyg som kvantifierar cellulär morfologi Ändringar från Tredimensionella fluorescensbilder

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Använda högupplöst datortomografi för att visualisera den tredimensionella strukturen och funktion växt kärlsystem

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Upptäckt av Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler genom PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging i Tredimensionella Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Tredimensionell rekonstruktion av vaskulär arkitekturen av passiv tydlighet-godkänt mus äggstocken

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: En vävnad Clearing metod för tredimensionell avbildning av fettvävnad

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Ett BW Reporter System för att studera Receptor-Ligand interaktioner

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...