Name: a rapid screening workflow to identify potential combination therapy for gbm using patient-derived glioma stem cells
Uploaded: 2021-03-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells at JoVE.com

We bedanken de National Natural Science Foundation of China (81672962), de Jiangsu Provincial Innovation Team Program Foundation en de Joint Key Project Foundation van Southeast University en Nanjing Medical University voor hun steun.

GBM-monster werd verkregen van een patiënt tijdens een routineoperatie na het verkrijgen van volledig geïnformeerde toestemming door de ethische commissie voor menselijk onderzoek van het First Affiliated Hospital van de Nanjing Medical University.
1. Isolatie en cultuur van patiënt-afgeleide GSC's
<ol><li>Plaats vers chirurgisch gereseceerd glioblastoomweefsel in een centrifugebuis van 15 ml gevuld met steriel PBS en bewaar het weefsel op ijs tot verdere operatie.</li>
	<li>Gehakt het GB...

<ol>
	<li>Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+glioblastoma.">Cancer stem cells in glioblastoma.</a> Genes &amp; Development. 29 (12), 1203-1217 (2015).</li><li>Binello, E., Germano, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+stem+cells:+a+novel+framework+for+brain+tumors.">Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors.</a> Cancer Science. 102 (11), 1958-1966 (2011).</li><li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells.">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li><li>Di Veroli, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combenefit:+an+interactive+platform+for+the+analysis+and+visualization+of+drug+combinations.">Combenefit: an interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations.</a> Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+inactivates+BMX-STAT3+in+glioma+stem+cells+to+impair+malignant+growth+and+radioresistance.">Ibrutinib inactivates BMX-STAT3 in glioma stem cells to impair malignant growth and radioresistance.</a> Science Translational Medicine. 10 (443), 1-13 (2018).</li><li>Tan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+synergistic+drug+pairs+targeting+HIV.">Systematic identification of synergistic drug pairs targeting HIV.</a> Nature Biotechnology. 30 (11), 1125-1130 (2012).</li><li>Jansen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinome-wide+RNA+interference+screen+reveals+a+role+for+PDK1+in+acquired+resistance+to+CDK4/6+inhibition+in+ER-positive+breast+cancer.">Kinome-wide RNA interference screen reveals a role for PDK1 in acquired resistance to CDK4/6 inhibition in ER-positive breast cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2488-2499 (2017).</li><li>Malyutina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+sensitivity+scoring+facilitates+the+discovery+of+synergistic+and+efficacious+drug+combinations+in+cancer.">Drug combination sensitivity scoring facilitates the discovery of synergistic and efficacious drug combinations in cancer.</a> PLoS Computational Biology. 15 (5), 1006752 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+High-throughput+drug+combination+screening+and+synergy+scoring.">Methods for High-throughput drug combination screening and synergy scoring.</a> Cancer Systems Biology. 1711, 351-398 (2018).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+synthetic+vulnerability+of+PTEN-deficient+glioblastoma+cells+with+MCL1+inhibitors.">Targeting the synthetic vulnerability of PTEN-deficient glioblastoma cells with MCL1 inhibitors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 19 (10), 2001-2011 (2020).</li></ol>

In de huidige studie werd een protocol beschreven dat kan worden toegepast om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide GSC's. In tegenstelling tot het standaard synergie/additiviteitsmetrische model zoals Loewe, BLISS of HSA-methoden, werd een eenvoudige en snelle workflow gebruikt waarbij een medicijnpaar niet op een volledige factoriële manier in meerdere concentraties moet worden gecombineerd als de traditionele methoden. In deze workflow werd SI (sensitivity index) g...

Glioblastoom (GBM) is het meest voorkomende en agressieve type primaire hersentumor. Momenteel is de totale overleving van GBM-patiënten die een maximale behandeling kregen (een combinatie van chirurgie, chemotherapie en radiotherapie) nog steeds korter dan 15 maanden; dus nieuwe en effectieve therapieën voor GBM zijn dringend nodig.
De aanwezigheid van glioomstamcellen (GSC's) in GBM vormt een aanzienlijke uitdaging voor de conventionele behandeling, omdat deze stamcellen een centrale rol spelen bij het behoud van tumormicro-omgeving, medicijnresistentie en tumorrecidief1. Daarom kan het richten op GSC's een veelbelovende strategie zijn voor GBM-behandeling2. Niettemin is een groot nadeel voor de werkzaamheid van het geneesmiddel bij GBM de heterogene aard ervan, inclusief maar niet beperkt tot het verschil in genetische mutaties, gemengde subtypen, epigenetische regulatie en tumormicro-omgeving, waardoor ze zeer refractair zijn voor behandeling. Na vele mislukte klinische onderzoeken realiseerden wetenschappers en klinische onderzoekers zich dat gerichte therapie met één middel waarschijnlijk niet in staat is om de progressie van zeer heterogene kankers zoals GBM volledig te beheersen. Terwijl zorgvuldig geselecteerde medicijncombinaties zijn goedgekeurd voor hun effectiviteit door synergetisch het effect van elkaar te versterken, waardoor een veelbelovende oplossing voor GBM-behandeling wordt geboden.
Hoewel er veel manieren zijn om de geneesmiddel-geneesmiddelinteracties van een geneesmiddelcombinatie te evalueren, zoals de CI (Combination Index), HSA (Highest Single Agent) en Bliss-waarden, enz.3,4, zijn deze berekeningsmethoden meestal gebaseerd op combinaties van meerdere concentraties. Inderdaad, deze methoden kunnen een positieve beoordeling van de interactie tussen geneesmiddel en geneesmiddel bieden, maar kunnen zeer bewerkelijk zijn als ze worden toegepast bij screening met hoge doorvoer. Om het proces te vereenvoudigen, werd een screeningsworkflow ontwikkeld voor het snel identificeren van de potentiële medicijncombinaties die de groei van GSC's remmen, afkomstig van chirurgische biopsieën van patiënt GBM. Een gevoeligheidsindex (SI) die het verschil van het verwachte gecombineerde effect en het waargenomen gecombineerde effect weergeeft, werd in deze methode geïntroduceerd om het synergetische effect van elk geneesmiddel te kwantificeren, zodat de potentiële kandidaten gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd door de SI-ranglijst. Ondertussen demonstreert dit protocol een voorbeeldscherm om de potentiële kandidaat (en) te identificeren die het anti-glioomeffect kunnen synergiseren met temozolomide, de eerstelijns chemotherapie voor GBM-behandeling, onder 20 kleine moleculaire remmers.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluta Max</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>P: 10,000 units/ml&#160;&#160;&#160;&#160; S:&#160; 10,000 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2088876</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 1. The&#160;formulation&#160;of GSC&#160;complete culture medium.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABT-737</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective and BH3 mimetic&#160;Bcl-2,&#160;Bcl-xL&#160;and&#160;Bcl-w&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adavosertib (MK-1775)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Wee1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZD5991</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Potent inhibitor of TGF-&#946; type I receptor&#160;ALK5 kinase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP57380</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent&#160;MNK1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dactolisib (BEZ235)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Dual ATP-competitive&#160;PI3K&#160;and&#160;mTOR&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dasatinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Dual&#160;Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR&#160;tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gefitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linifanib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of&#160;VEGFR&#160;and&#160;PDGFR&#160;family</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Inhibitor of&#160;c-Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML141</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Non-competitive inhibitor of&#160;Cdc42 GTPase&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSI-930</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;CDK4&#160;and&#160;CDK6&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 202190</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;p38 MAP kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepantronium bromide (YM-155)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Survivin&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS 359</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent FLT3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMI-77</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;estrogen receptor (ER)&#160;modulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid screening workflow to identify potential combination therapy for gbm using patient-derived glioma stem cells

De glioomstamcellen (GSC's) zijn een klein deel van de kankercellen die een essentiële rol spelen bij tumorinitiatie, angiogenese en medicijnresistentie bij glioblastoom (GBM), de meest voorkomende en verwoestende primaire hersentumor. De aanwezigheid van GSC's maakt de GBM zeer refractair voor de meeste individuele gerichte middelen, dus screeningmethoden met hoge doorvoer zijn vereist om potentiële effectieve combinatietherapieën te identificeren. Het protocol beschrijft een eenvoudige workflow om snelle screening op mogelijke combinatietherapie met synergetische interactie mogelijk te maken. De algemene stappen van deze workflow bestaan uit het vaststellen van luciferase-gelabelde GSC's, het voorbereiden van matrigel gecoate platen, combinatiegeneesmiddelscreening, analyseren en valideren van de resultaten.

De XG387-cellen vormden neurosferen in het kweekmedium beschreven in tabel 1 in een ultralage aanhechting 6-well kweekplaat of een niet-gecoate plaat5 (figuur 1A). Eerst werd een test uitgevoerd om te controleren of de bio-luminescentie-intensiteit van XG387-Luc-cellen evenredig was met het celnummer. Zoals te zien is in figuur 1B,nam de bio-luminescentie-intensiteit evenredig toe met de celdichtheid en resulteerde in een...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells at JoVE.com

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Een snelle screeningsworkflow om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide glioomstamcellen

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Glioomstamcellen zijn subpopulatie van cellen in het glioom, die meestal resistent zijn tegen chemo en radiotherapie. Hier beschreven we de methode voor snelle identificatie van combinatietherapieën, gericht op glioomstamcellen, in plaats van gedifferentieerde glioomcellen. Vergeleken met andere methoden, die moeizaam en ingewikkeld kunnen zijn.Dit protocol is relatief eenvoudig en snel, om potentiële nuttige medicijncombinaties te identificeren. Begin met het verzamelen van de glioomstamcellen of GSC's uit het kweekmedium en centrifugeer ze gedurende drie minuten bij kamertemperatuur op 70 keer G. Na het verwijderen van het supernatant, verteer de cellen met accutase gedurende vier minuten bij 37 graden Celsius.Pipetteer de cellen herhaaldelijk met behulp van een tip van 200 microliter om te dissociëren en resuspend de celkorrel. Voeg de GSC's met een dichtheid van 200.000 cellen in één milliliter kweekmedium toe aan elke put van een kweekplaat met 12 putten en incubeer ze een nacht. Oh, voeg de volgende dag 30 microliter luciferase-eGFP-virus supernatant toe aan elke put van de plaat.Centrifugeer de cellen op 1000 keer G gedurende twee uur, bij 25 graden Celsius en incubeer ze een nacht. Vervang de volgende dag het medium in de putten door de GSC's te verzamelen, ze te centrifugeren, het supernatant te verwijderen, ze in vers medium te resuspenderen en ze opnieuw te verdrijven. Kweek de cellen nog eens 48 uur.Observeer de plaat onder een fluorescerende microscoop en bevestig het uiterlijk van GFP-positieve cellen. Sorteer en verzamel de GSC's met een hoge fluorescentie met behulp van een flow cell sorter en kweek ze verder. Bestrijk 96 goed optische bodemplaten met een extracellulair matrixmengsel, zoals matrigel, en incubeer ze gedurende een uur bij 37 graden Celsius.Verwijder het overtollige mengsel en spoel de platen voorzichtig eenmaal met PBS, zaad vervolgens XG387-Luc-cellen met een dichtheid van 1000 cellen in 100 microliter kweekmedium en in elke put van de gecoate platen en kweek ze een nacht. Observeer de volgende dag de cellen onder een microscoop om hun hechting aan de plaat te bevestigen. Bereid vervolgens een 200 micromolaire temozolomide-oplossing en twee micromolaire oplossingen van de beoogde middelen, in kweekmedium.Verwijder voor de screening van combinatiegeneesmiddelen het lege medium en voeg het medium met 200 micromolaire temozolomide of twee micromolaire gerichte middelen, of een combinatie van beide, toe aan elke put voor drie technische replicaties per behandeling. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende drie dagen. Maak foto's van de cellulaire bioluminescentie in de plaat met behulp van het IVIS-spectrumbeeldvormingssysteem.Maak met behulp van de ingebouwde software meerdere cirkelvormige gebieden van het interessegebied en kwantificeer de cellulaire bioluminescentie. Om potentiële kandidaten te identificeren die het antiglioblastoomeffect van temozolomide zouden kunnen versterken, werden 20 doelselectieve kleine molecuulremmers geanalyseerd door middel van screening van geneesmiddelencombinaties. De gevoelige indexwaarden van 13 beoogde middelen lagen boven nul en vijf daarvan lagen boven de 0,1.De gevoelige index van de twee belangrijkste kandidaat-geneesmiddelen UMI-77 en A 83-01 was hoger dan 0,25, wat suggereert dat ze kunnen samenwerken met temozolomide. De gecombineerde behandeling van temozolomide en UMI-77 werd geëvalueerd met behulp van een antiproliferatieve test in een titratiematrix van zes bij zes doses. De combinatie-indexwaarden waren minder dan één.En de hoge enkelvoudige agentwaarden waren groter dan nul voor de meeste combinaties van temozolomide en UMI-77 bij verschillende concentraties. Suggereert een algemene synergetische interactie van temozolomide en UMI-77 in zowel XG387 als XG328 GSC's. Dit protocol kan ook worden toegepast bij het vinden van medicijncombinaties met behulp van adherente kankercellen door eenvoudig de plaatcoatingstap te verwijderen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modelleren van osteosarcoom met behulp van Li-Fraumeni syndroom geïnduceerde pluripotente stamcellen patiënt-afgeleide cellen

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Een melanoom patiënt-afgeleide xenograft model

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Een workflow voor gegevensintegratie om medicijncombinaties te identificeren die gericht zijn op synthetische dodelijke interacties

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Gecombineerde voorwaardelijke knockdown en aangepaste sphere vorming test om een stemness-geassocieerd gen van patiënt-afgeleide maagkanker stamcellen studie

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Gepoolde shRNA-bibliotheekscreening om factoren te identificeren die een fenotype van medicijnresistentie moduleren

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...