Name: a rapid screening workflow to identify potential combination therapy for gbm using patient-derived glioma stem cells
Uploaded: 2021-03-28T13:00:00
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Nous remercions la National Natural Science Foundation of China (81672962), la Jiangsu Provincial Innovation Team Program Foundation et la Joint Key Project Foundation de l’Université du Sud-Est et de l’Université de médecine de Nanjing pour leur soutien.

L’échantillon de GBM a été acquis d’un patient lors d’une opération de routine après avoir obtenu le consentement pleinement éclairé du comité d’éthique de la recherche humaine du premier hôpital affilié de l’Université médicale de Nanjing.
1. Isolement et culture des CSC dérivés du patient
<ol><li>Placer le tissu de glioblastome frais réséqué chirurgicalement dans un tube de centrifugeuse de 15 mL rempli de PBS stérile et stocker le tissu sur de la glace jusqu?...

<ol>
	<li>Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+glioblastoma.">Cancer stem cells in glioblastoma.</a> Genes &amp; Development. 29 (12), 1203-1217 (2015).</li><li>Binello, E., Germano, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+stem+cells:+a+novel+framework+for+brain+tumors.">Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors.</a> Cancer Science. 102 (11), 1958-1966 (2011).</li><li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells.">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li><li>Di Veroli, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combenefit:+an+interactive+platform+for+the+analysis+and+visualization+of+drug+combinations.">Combenefit: an interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations.</a> Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+inactivates+BMX-STAT3+in+glioma+stem+cells+to+impair+malignant+growth+and+radioresistance.">Ibrutinib inactivates BMX-STAT3 in glioma stem cells to impair malignant growth and radioresistance.</a> Science Translational Medicine. 10 (443), 1-13 (2018).</li><li>Tan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+synergistic+drug+pairs+targeting+HIV.">Systematic identification of synergistic drug pairs targeting HIV.</a> Nature Biotechnology. 30 (11), 1125-1130 (2012).</li><li>Jansen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinome-wide+RNA+interference+screen+reveals+a+role+for+PDK1+in+acquired+resistance+to+CDK4/6+inhibition+in+ER-positive+breast+cancer.">Kinome-wide RNA interference screen reveals a role for PDK1 in acquired resistance to CDK4/6 inhibition in ER-positive breast cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2488-2499 (2017).</li><li>Malyutina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+sensitivity+scoring+facilitates+the+discovery+of+synergistic+and+efficacious+drug+combinations+in+cancer.">Drug combination sensitivity scoring facilitates the discovery of synergistic and efficacious drug combinations in cancer.</a> PLoS Computational Biology. 15 (5), 1006752 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+High-throughput+drug+combination+screening+and+synergy+scoring.">Methods for High-throughput drug combination screening and synergy scoring.</a> Cancer Systems Biology. 1711, 351-398 (2018).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+synthetic+vulnerability+of+PTEN-deficient+glioblastoma+cells+with+MCL1+inhibitors.">Targeting the synthetic vulnerability of PTEN-deficient glioblastoma cells with MCL1 inhibitors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 19 (10), 2001-2011 (2020).</li></ol>

Dans la présente étude, un protocole qui peut être appliqué pour identifier une thérapie combinée potentielle pour gbM en utilisant des CSCG dérivés du patient a été décrit. Contrairement au modèle métrique standard de synergie/additivité tel que les méthodes Loewe, BLISS ou HSA, un flux de travail simple et rapide a été utilisé qui ne nécessite pas qu’une paire de médicaments soit combinée à plusieurs concentrations de manière factoriele complète comme les méthodes traditionnelles. Dans ce flu...

Le glioblastome (GBM) est le type de tumeur cérébrale primaire le plus courant et le plus agressif. Actuellement, la survie globale des patients atteints de GBM qui ont reçu un traitement maximal (une combinaison de chirurgie, de chimiothérapie et de radiothérapie) est encore inférieure à 15 mois; il est donc urgent de prévoir des thérapies nouvelles et efficaces pour le GBM.
La présence de cellules souches de gliome (CSG) dans le GBM constitue un défi considérable pour le traitement conventionnel car ces cellules souches jouent un rôle pivot dans le maintien du microenvironnement tumoral, la résistance aux médicaments et la récidive tumorale1. Par conséquent, le ciblage des CSC pourrait être une stratégie prometteuse pour le traitement gbm2. Néanmoins, un inconvénient majeur pour l’efficacité du médicament dans le GBM est sa nature hétérogénétique, y compris, mais sans s’y limiter, la différence de mutations génétiques, de sous-types mixtes, de régulation épigénétique et de microenvironnement tumoral, ce qui les rend très réfractaires au traitement. Après de nombreux essais cliniques ratés, les scientifiques et les chercheurs cliniques ont réalisé que le traitement ciblé à agent unique est probablement incapable de contrôler pleinement la progression de cancers très hétérogènes tels que le GBM. Alors que des combinaisons de médicaments soigneusement sélectionnées ont été approuvées pour leur efficacité en renforçant de manière synergique l’effet les unes des autres, fournissant ainsi une solution prometteuse pour le traitement du GBM.
Bien qu’il existe de nombreuses façons d’évaluer les interactions médicamenteuses d’une combinaison de médicaments, telles que les valeurs CI (Indice de combinaison), HSA (agent unique le plus élevé) et Bliss, etc.3,4, ces méthodes de calcul sont généralement basées sur des combinaisons de concentrations multiples. En effet, ces méthodes peuvent fournir une évaluation positive de l’interaction médicament-médicament, mais peuvent être très laborieuses si elles sont appliquées dans le criblage à haut débit. Pour simplifier le processus, un flux de travail de dépistage permettant d’identifier rapidement les combinaisons de médicaments potentielles qui inhibent la croissance des CSC provenant de biopsies chirurgicales de patients GBM a été développé. Un indice de sensibilité (SI) qui reflète la différence entre l’effet combiné attendu et l’effet combiné observé a été introduit dans cette méthode pour quantifier l’effet synergique de chaque médicament, de sorte que les candidats potentiels peuvent être facilement identifiés par le classement SI. Pendant ce temps, ce protocole démontre un exemple de dépistage pour identifier le ou les candidats potentiels qui peuvent mettre en synergie l’effet anti-gliome avec le témozolomide, la chimiothérapie de première intention pour le traitement GBM, parmi 20 petits inhibiteurs moléculaires.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluta Max</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>P: 10,000 units/ml&#160;&#160;&#160;&#160; S:&#160; 10,000 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2088876</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 1. The&#160;formulation&#160;of GSC&#160;complete culture medium.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABT-737</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective and BH3 mimetic&#160;Bcl-2,&#160;Bcl-xL&#160;and&#160;Bcl-w&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adavosertib (MK-1775)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Wee1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZD5991</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Potent inhibitor of TGF-&#946; type I receptor&#160;ALK5 kinase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP57380</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent&#160;MNK1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dactolisib (BEZ235)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Dual ATP-competitive&#160;PI3K&#160;and&#160;mTOR&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dasatinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Dual&#160;Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR&#160;tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gefitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linifanib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of&#160;VEGFR&#160;and&#160;PDGFR&#160;family</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Inhibitor of&#160;c-Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML141</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Non-competitive inhibitor of&#160;Cdc42 GTPase&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSI-930</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;CDK4&#160;and&#160;CDK6&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 202190</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;p38 MAP kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepantronium bromide (YM-155)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Survivin&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS 359</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent FLT3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMI-77</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;estrogen receptor (ER)&#160;modulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid screening workflow to identify potential combination therapy for gbm using patient-derived glioma stem cells

Les cellules souches du gliome (CSC) sont une petite fraction des cellules cancéreuses qui jouent un rôle essentiel dans l’initiation tumorale, l’angiogenèse et la résistance aux médicaments dans le glioblastome (GBM), la tumeur cérébrale primaire la plus répandue et la plus dévastatrice. La présence de CSG rend le GBM très réfractaire à la plupart des agents ciblés individuels, de sorte que des méthodes de dépistage à haut débit sont nécessaires pour identifier des combinaisons thérapeutiques efficaces potentielles. Le protocole décrit un flux de travail simple pour permettre un dépistage rapide de la thérapie combinée potentielle avec interaction synergique. Les étapes générales de ce flux de travail consistent à établir des CSG marqués à la luciférase, à préparer des plaques revêtues de matrigel, à dépister les médicaments combinés, à analyser et à valider les résultats.

Les cellules XG387 ont formé des neurosphères dans le milieu de culture décrit dans le tableau 1 dans une plaque de culture à 6 puits à fixation ultra-faible ou une plaque5 non revêtue(figure 1A). Tout d’abord, un test a été effectué pour vérifier si l’intensité de bio-luminescence des cellules XG387-Luc était proportionnelle au nombre de cellules. Comme le montre la figure 1B, l’intensité de la biolumi...

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A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Un flux de travail de dépistage rapide pour identifier la thérapie combinée potentielle pour le GBM à l’aide de cellules souches de gliome dérivées du patient

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Les cellules souches du gliome sont une sous-population de cellules du gliome, qui sont généralement résistantes à la chimiothérapie et à la radiothérapie. Nous avons décrit ici la méthode d’identification rapide des thérapies combinées, ciblant les cellules souches du gliome, au lieu des cellules de gliome différenciées. Par rapport à d’autres méthodes, qui peuvent être laborieuses et compliquées.Ce protocole est relativement simple et rapide, pour identifier les combinaisons de médicaments potentiellement utiles. Commencez par prélever les cellules souches de gliome ou GSC dans le milieu de culture et centrifugez-les à 70 fois G pendant trois minutes à température ambiante. Après avoir retiré le surnageant, digérez les cellules avec de l’accutase pendant quatre minutes à 37 degrés Celsius.À l’aide d’une pointe de 200 microlitres, pipettez les cellules à plusieurs reprises pour les dissocier et ressuspendez la pastille cellulaire. Ajouter les CSM à une densité de 200 000 cellules dans un millilitre de milieu de culture, dans chaque puits d’une plaque de culture de 12 puits, et les incuber pendant la nuit. Oh le lendemain, ajoutez 30 microlitres de surnageant du virus luciférase-eGFP dans chaque puits de la plaque.Centrifugez les cellules à 1000 fois G pendant deux heures, à 25 degrés Celsius et incubez-les pendant la nuit. Le lendemain, remplacez le milieu dans les puits en collectant les CGV, en les centrifugant, en retirant le surnageant, en les resusmettant en milieu frais et en les replaquant. Culturez les cellules pendant encore 48 heures.Observez la plaque sous un microscope fluorescent et confirmez l’apparition de cellules GFP positives. Triez et collectez les CSC à haute fluorescence à l’aide d’un trieur de cellules à flux et essez-les en culture. Enduire, 96 plaques de fond optiques avec un mélange de matrice extracellulaire, comme le matrigel, et les incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius.Retirez l’excès de mélange et rincez doucement les plaques une fois avec du PBS, puis ensemencez des cellules XG387-Luc à une densité de 1000 cellules dans 100 microlitres de milieu de culture, et à chaque puits des plaques enduites et les culturez pendant la nuit. Le lendemain, observez les cellules au microscope pour confirmer leur fixation à la plaque. Ensuite, préparez une solution de témozolomide de 200 micromolaires et deux solutions micromolaires des agents ciblés, en milieu de culture.Pour le dépistage des médicaments combinés, retirez le milieu vierge et ajoutez le milieu contenant soit 200 témozolomides micromolaires ou deux agents micromolaires ciblés, ou une combinaison des deux, dans chaque puits pour trois répétitions techniques par traitement. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours. Prenez des images de la bioluminescence cellulaire dans la plaque à l’aide du système d’imagerie à spectre IVIS.À l’aide du logiciel intégré, créez plusieurs zones circulaires de la région d’intérêt et quantifiez la bioluminescence cellulaire. Afin d’identifier des candidats potentiels susceptibles d’améliorer l’effet antiglioblastome du témozolomide, 20 inhibiteurs sélectifs de petites molécules cibles ont été analysés par le biais d’un dépistage combiné de médicaments. Les valeurs d’indice sensibles de 13 agents ciblés étaient supérieures à zéro et cinq d’entre eux étaient supérieures à 0,1.L’indice sensible des deux principaux médicaments candidats UMI-77 et A 83-01 était supérieur à 0,25, ce qui suggère leur potentiel de synergie avec le témozolomide. Le traitement combiné du témozolomide et de l’UMI-77 a été évalué à l’aide d’un dosage anti-prolifératif dans une matrice de titration à six doses par six. Les valeurs de l’indice combiné étaient inférieures à un.Et les valeurs élevées d’agent unique étaient supérieures à zéro pour la plupart des combinaisons de témozolomide et d’UMI-77 à différentes concentrations. Suggérant une interaction synergique globale du témozolomide et de l’UMI-77 dans les CSG XG387 et XG328. Ce protocole peut également être appliqué pour trouver une combinaison de médicaments en utilisant des cellules cancéreuses adhérentes en supprimant simplement l’étape de revêtement de la plaque.

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