Name: a rapid screening workflow to identify potential combination therapy for gbm using patient-derived glioma stem cells
Uploaded: 2021-03-28T13:00:00
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Ringraziamo la National Natural Science Foundation of China (81672962), la Jiangsu Provincial Innovation Team Program Foundation e la Joint Key Project Foundation della Southeast University e della Nanjing Medical University per il loro sostegno.

Il campione gbM è stato acquisito da un paziente durante un'operazione di routine dopo aver ottenuto il consenso pienamente informato dal comitato etico della ricerca umana del primo ospedale affiliato dell'Università di Medicina di Nanchino.
1. Isolamento e coltura delle GSC derivate dal paziente
<ol><li>Posizionare il tessuto di glioblastoma fresco resecato chirurgicamente in un tubo di centrifuga da 15 ml riempito con PBS sterile e conservare il tessuto sul ghiaccio fino a un'ulteriore ...

<ol>
	<li>Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+glioblastoma.">Cancer stem cells in glioblastoma.</a> Genes &amp; Development. 29 (12), 1203-1217 (2015).</li><li>Binello, E., Germano, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+stem+cells:+a+novel+framework+for+brain+tumors.">Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors.</a> Cancer Science. 102 (11), 1958-1966 (2011).</li><li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells.">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li><li>Di Veroli, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combenefit:+an+interactive+platform+for+the+analysis+and+visualization+of+drug+combinations.">Combenefit: an interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations.</a> Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+inactivates+BMX-STAT3+in+glioma+stem+cells+to+impair+malignant+growth+and+radioresistance.">Ibrutinib inactivates BMX-STAT3 in glioma stem cells to impair malignant growth and radioresistance.</a> Science Translational Medicine. 10 (443), 1-13 (2018).</li><li>Tan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+synergistic+drug+pairs+targeting+HIV.">Systematic identification of synergistic drug pairs targeting HIV.</a> Nature Biotechnology. 30 (11), 1125-1130 (2012).</li><li>Jansen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinome-wide+RNA+interference+screen+reveals+a+role+for+PDK1+in+acquired+resistance+to+CDK4/6+inhibition+in+ER-positive+breast+cancer.">Kinome-wide RNA interference screen reveals a role for PDK1 in acquired resistance to CDK4/6 inhibition in ER-positive breast cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2488-2499 (2017).</li><li>Malyutina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+sensitivity+scoring+facilitates+the+discovery+of+synergistic+and+efficacious+drug+combinations+in+cancer.">Drug combination sensitivity scoring facilitates the discovery of synergistic and efficacious drug combinations in cancer.</a> PLoS Computational Biology. 15 (5), 1006752 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+High-throughput+drug+combination+screening+and+synergy+scoring.">Methods for High-throughput drug combination screening and synergy scoring.</a> Cancer Systems Biology. 1711, 351-398 (2018).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+synthetic+vulnerability+of+PTEN-deficient+glioblastoma+cells+with+MCL1+inhibitors.">Targeting the synthetic vulnerability of PTEN-deficient glioblastoma cells with MCL1 inhibitors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 19 (10), 2001-2011 (2020).</li></ol>

Nel presente studio, è stato descritto un protocollo che può essere applicato per identificare potenziali terapie di combinazione per GBM utilizzando GSC derivate dal paziente. A differenza del modello metrico standard di sinergia / additività come i metodi Loewe, BLISS o HSA, è stato utilizzato un flusso di lavoro semplice e rapido che non richiede che una coppia di farmaci sia combinata a concentrazioni multiple in modo fattoriale completo come i metodi tradizionali. In questo flusso di lavoro, SI (indice di sensib...

Il glioblastoma (GBM) è il tipo più comune e aggressivo di tumore cerebrale primario. Attualmente, la sopravvivenza globale dei pazienti GBM che hanno ricevuto il massimo trattamento (una combinazione di chirurgia, chemioterapia e radioterapia) è ancora inferiore a 15 mesi; quindi sono urgentemente necessarie terapie nuove ed efficaci per GBM.
La presenza di cellule staminali di glioma (GSC) nel GBM costituisce una sfida considerevole per il trattamento convenzionale in quanto queste cellule staminali svolgono ruoli di perno nel mantenimento del microambiente tumorale, della resistenza ai farmaci e della recidiva tumorale1. Pertanto, il targeting delle GSC potrebbe essere una strategia promettente per il trattamento GBM2. Tuttavia, un importante svantaggio per l'efficacia del farmaco in GBM è la sua natura eterogenetica, inclusa ma non limitata alla differenza di mutazioni genetiche, sottotipi misti, regolazione epigenetica e microambiente tumorale che li rende molto refrattari per il trattamento. Dopo molti studi clinici falliti, scienziati e ricercatori clinici si sono resi conto che la terapia mirata a singolo agente è probabilmente incapace di controllare completamente la progressione di tumori altamente eterogenei come il GBM. Considerando che, combinazioni di farmaci accuratamente selezionate sono state approvate per la loro efficacia migliorando sinergicamente l'effetto l'una dell'altra, fornendo così una soluzione promettente per il trattamento GBM.
Sebbene ci siano molti modi per valutare le interazioni farmaco-farmaco di una combinazione di farmaci, come i valori CI (Combination Index), HSA (Highest Single Agent) e Bliss, ecc. 3,4, questi metodi dicalcolosono solitamente basati su combinazioni di concentrazione multiple. In effetti, questi metodi possono fornire una valutazione affermativa dell'interazione farmaco-farmaco, ma possono essere molto laboriosi se applicati nello screening ad alto rendimento. Per semplificare il processo, è stato sviluppato un flusso di lavoro di screening per identificare rapidamente le potenziali combinazioni di farmaci che inibiscono la crescita delle GSC originate da biopsie chirurgiche del paziente GBM. Un indice di sensibilità (SI) che riflette la differenza tra l'effetto combinato atteso e l'effetto combinato osservato è stato introdotto in questo metodo per quantificare l'effetto sinergizzante di ciascun farmaco, in modo che i potenziali candidati possano essere facilmente identificati dalla classifica SI. Nel frattempo, questo protocollo dimostra uno screening di esempio per identificare i potenziali candidati che possono sinergizzare l'effetto anti-glioma con temozolomide, la chemioterapia di prima linea per il trattamento GBM, tra 20 piccoli inibitori molecolari.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluta Max</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>P: 10,000 units/ml&#160;&#160;&#160;&#160; S:&#160; 10,000 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2088876</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 1. The&#160;formulation&#160;of GSC&#160;complete culture medium.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABT-737</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective and BH3 mimetic&#160;Bcl-2,&#160;Bcl-xL&#160;and&#160;Bcl-w&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adavosertib (MK-1775)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Wee1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZD5991</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Potent inhibitor of TGF-&#946; type I receptor&#160;ALK5 kinase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP57380</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent&#160;MNK1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dactolisib (BEZ235)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Dual ATP-competitive&#160;PI3K&#160;and&#160;mTOR&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dasatinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Dual&#160;Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR&#160;tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gefitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linifanib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of&#160;VEGFR&#160;and&#160;PDGFR&#160;family</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Inhibitor of&#160;c-Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML141</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Non-competitive inhibitor of&#160;Cdc42 GTPase&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSI-930</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;CDK4&#160;and&#160;CDK6&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 202190</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;p38 MAP kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepantronium bromide (YM-155)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Survivin&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS 359</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent FLT3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMI-77</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;estrogen receptor (ER)&#160;modulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid screening workflow to identify potential combination therapy for gbm using patient-derived glioma stem cells

Le cellule staminali del glioma (GSC) sono una piccola frazione di cellule tumorali che svolgono ruoli essenziali nell'inizio del tumore, nell'angiogenesi e nella resistenza ai farmaci nel glioblastoma (GBM), il tumore cerebrale primario più diffuso e devastante. La presenza di GSC rende il GBM molto refrattario alla maggior parte dei singoli agenti mirati, quindi sono necessari metodi di screening ad alto rendimento per identificare potenziali terapie di combinazione efficaci. Il protocollo descrive un semplice flusso di lavoro per consentire uno screening rapido per la potenziale terapia di combinazione con interazione sinergica. I passaggi generali di questo flusso di lavoro consistono nello stabilire GSC con tag luciferasi, preparare piastre rivestite di matrigel, screening farmacologico combinato, analisi e convalida dei risultati.

Le cellule XG387 hanno formato neurosfere nel terreno di coltura descritto nella Tabella 1 in una piastra di coltura a 6 pozzetti di attacco ultra-basso o in una piastra non rivestita5 (Figura 1A). In primo luogo, è stato eseguito un test per verificare se l'intensità di bioluminescenza delle cellule XG387-Luc fosse proporzionale al numero di cellule. Come mostrato in Figura 1B,l'intensità della bioluminescenza è aume...

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A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Un flusso di lavoro di screening rapido per identificare la potenziale terapia combinata per GBM utilizzando cellule staminali di glioma derivate dal paziente

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Le cellule staminali del glioma sono sotto-popolazioni di cellule nel glioma, che di solito sono resistenti alla chemio e alla radioterapia. Qui abbiamo descritto il metodo per la rapida identificazione di terapie combinate, mirate alle cellule staminali del glioma, invece delle cellule di glioma differenziate. Rispetto ad altri metodi, che possono essere laboriosi e complicati.Questo protocollo è relativamente semplice e rapido, per identificare potenziali combinazioni di farmaci utili. Inizia raccogliendo le cellule staminali del glioma o GSC dal terreno di coltura e centrifugandole a 70 volte G per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il surnatante, digerire le cellule con l'accutasi per quattro minuti a 37 gradi Celsius.Utilizzando una punta da 200 microlitri, pipettare ripetutamente le cellule per dissociarsi e risospendere il pellet cellulare. Aggiungere le GSC a una densità di 200.000 cellule in un millilitro di terreno di coltura, in ciascun pozzetto di una piastra di coltura da 12 pozzi, e incubarle durante la notte. Oh il giorno dopo, aggiungi 30 microlitri di surnatante del virus luciferasi-eGFP in ogni pozzo della piastra.Centrifugare le cellule a 1000 volte G per due ore, a 25 gradi Celsius e incubarle durante la notte. Il giorno seguente, sostituire il mezzo nei pozzi raccogliendo le GSC, centrifugandole, rimuovendo il surnatante, riutilizzandole in terreno fresco e ripiattandole. Coltivate le cellule per altre 48 ore.Osservare la piastra al microscopio fluorescente e confermare la comparsa di cellule GFP-positive. Ordinare e raccogliere le GSC con un'alta fluorescenza utilizzando un selezionatore di celle a flusso e coltivatele ulteriormente. Rivestire, 96 placche di fondo ben ottiche con una miscela di matrice extracellulare, come il matrigel, e incubarle per un'ora a 37 gradi Celsius.Rimuovere la miscela in eccesso e risciacquare delicatamente le piastre una volta con PBS, quindi seminare le cellule XG387-Luc ad una densità di 1000 cellule in 100 microlitri di terreno di coltura, e per ogni pozzetti delle piastre rivestite e coltivatele durante la notte. Il giorno seguente, osservare le cellule al microscopio per confermare il loro attaccamento alla piastra. Preparare quindi una soluzione di temozolomide micromolare 200 micromolari e due soluzioni micromolari degli agenti mirati, in terreno di coltura.Per lo screening farmacologico combinato, rimuovere il mezzo vuoto e aggiungere il mezzo contenente 200 temozolomide micromolare o due agenti mirati micromolari, o una combinazione di entrambi, in ciascun pozzetto per tre repliche tecniche per trattamento. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre giorni. Scatta immagini della bioluminescenza cellulare nella piastra utilizzando il sistema di imaging dello spettro IVIS.Utilizzando il software integrato, creare più aree circolari della regione di interesse e quantificare la bioluminescenza cellulare. Per identificare potenziali candidati che potrebbero migliorare l'effetto antiglioblastoma di temozolomide, sono stati analizzati 20 inibitori selettivi di piccole molecole bersaglio attraverso lo screening di combinazioni di farmaci. I valori dell'indice sensibile di 13 agenti bersaglio erano superiori a zero e cinque di essi erano superiori a 0,1.L'indice sensibile dei primi due farmaci candidati UMI-77 e A 83-01, era superiore a 0,25, suggerendo il loro potenziale di sinergia con temozolomide. Il trattamento combinato di temozolomide e UMI-77 è stato valutato utilizzando un test anti-proliferativo in una matrice di titolazione a sei dosi per sei. I valori dell'indice di combinazione erano inferiori a uno.E gli alti valori di singolo agente erano maggiori di zero per la maggior parte delle combinazioni di temozolomide e UMI-77 a diverse concentrazioni. Suggerendo un'interazione sinergica complessiva di temozolomide e UMI-77 in entrambe le GSC XG387 e XG328. Questo protocollo può anche essere applicato nella ricerca di combinazioni di farmaci utilizzando cellule tumorali aderenti semplicemente rimuovendo la fase di rivestimento della piastra.

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