Name: a rapid screening workflow to identify potential combination therapy for gbm using patient-derived glioma stem cells
Uploaded: 2021-03-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells at JoVE.com

Vi takker The National Natural Science Foundation of China (81672962), Jiangsu Provincial Innovation Team Program Foundation og Joint Key Project Foundation ved Southeast University og Nanjing Medical University for deres støtte.

GBM-prøven ble anskaffet fra en pasient under en rutineoperasjon etter å ha fått fullt informert samtykke fra human forskningsetisk komité ved The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University.
1. Isolasjon og kultur av pasientavledede GSC-er
<ol><li>Legg ferskt kirurgisk resektert glioblastomvev i et 15 ml sentrifugerør fylt med steril PBS og oppbevar vevet på is inntil videre.</li>
	<li>Hakk GBM-vevet i omtrent 0,5 til 1 mm diameter stykker ved hjelp av disseksjonssaks og v...

<ol>
	<li>Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+glioblastoma.">Cancer stem cells in glioblastoma.</a> Genes &amp; Development. 29 (12), 1203-1217 (2015).</li><li>Binello, E., Germano, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+stem+cells:+a+novel+framework+for+brain+tumors.">Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors.</a> Cancer Science. 102 (11), 1958-1966 (2011).</li><li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells.">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li><li>Di Veroli, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combenefit:+an+interactive+platform+for+the+analysis+and+visualization+of+drug+combinations.">Combenefit: an interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations.</a> Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+inactivates+BMX-STAT3+in+glioma+stem+cells+to+impair+malignant+growth+and+radioresistance.">Ibrutinib inactivates BMX-STAT3 in glioma stem cells to impair malignant growth and radioresistance.</a> Science Translational Medicine. 10 (443), 1-13 (2018).</li><li>Tan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+synergistic+drug+pairs+targeting+HIV.">Systematic identification of synergistic drug pairs targeting HIV.</a> Nature Biotechnology. 30 (11), 1125-1130 (2012).</li><li>Jansen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinome-wide+RNA+interference+screen+reveals+a+role+for+PDK1+in+acquired+resistance+to+CDK4/6+inhibition+in+ER-positive+breast+cancer.">Kinome-wide RNA interference screen reveals a role for PDK1 in acquired resistance to CDK4/6 inhibition in ER-positive breast cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2488-2499 (2017).</li><li>Malyutina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+sensitivity+scoring+facilitates+the+discovery+of+synergistic+and+efficacious+drug+combinations+in+cancer.">Drug combination sensitivity scoring facilitates the discovery of synergistic and efficacious drug combinations in cancer.</a> PLoS Computational Biology. 15 (5), 1006752 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+High-throughput+drug+combination+screening+and+synergy+scoring.">Methods for High-throughput drug combination screening and synergy scoring.</a> Cancer Systems Biology. 1711, 351-398 (2018).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+synthetic+vulnerability+of+PTEN-deficient+glioblastoma+cells+with+MCL1+inhibitors.">Targeting the synthetic vulnerability of PTEN-deficient glioblastoma cells with MCL1 inhibitors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 19 (10), 2001-2011 (2020).</li></ol>

I den nåværende studien ble det beskrevet en protokoll som kan anvendes for å identifisere potensiell kombinasjonsterapi for GBM ved hjelp av pasientavledede GSC-er. I motsetning til standard synergy/additivity metrisk modell som Loewe, BLISS eller HSA metoder, ble det brukt en enkel og rask arbeidsflyt som ikke krever at et legemiddelpar kombineres ved flere konsentrasjoner på en full factorial måte som de tradisjonelle metodene. I denne arbeidsflyten ble SI (sensitivitetsindeks) som stammer fra en studie for å ev...

Glioblastom (GBM) er den vanligste og aggressive typen primær hjernesvulst. For tiden er den totale overlevelsen til GBM-pasienter som fikk maksimal behandling (en kombinasjon av kirurgi, kjemoterapi og strålebehandling) fortsatt kortere enn 15 måneder; så nye og effektive terapier for GBM er presserende nødvendig.
Tilstedeværelsen av glioma stamceller (GSC) i GBM utgjør en betydelig utfordring for den konvensjonelle behandlingen, da disse stamcellene spiller pivotroller i vedlikehold av tumormikromiljø, legemiddelresistens og tumorrescurrence1. Derfor kan målretting av GSC-er være en lovende strategi for GBM-behandling2. Likevel er en stor ulempe for legemiddeleffekten i GBM dens heterogenetiske natur, inkludert, men ikke begrenset til, forskjellen i genetiske mutasjoner, blandede undertyper, epigenetisk regulering og tumormikromiljø som gjør dem svært ildfaste for behandling. Etter mange mislykkede kliniske studier innså forskere og kliniske forskere at enkeltagent målrettet terapi sannsynligvis ikke er i stand til å kontrollere utviklingen av svært heterogene kreftformer som GBM. Mens nøye utvalgte legemiddelkombinasjoner har blitt godkjent for deres effektivitet ved synergistisk å forbedre effekten av hverandre, og dermed gi en lovende løsning for GBM-behandling.
Selv om det er mange måter å evaluere legemiddelinteraksjonene i en legemiddelkombinasjon, for eksempel CI (Combination Index), HSA (Highest Single Agent) og Bliss-verdier, etc.3,4, er disse beregningsmetodene vanligvis basert på flere konsentrasjonskombinasjoner. Faktisk kan disse metodene gi bekreftende vurdering av legemiddelinteraksjon, men kan være svært arbeidskrevende hvis de brukes i screening med høy gjennomstrømning. For å forenkle prosessen ble det utviklet en screeningarbeidsflyt for raskt å identifisere de potensielle legemiddelkombinasjonene som hemmer veksten av GSC-er fra kirurgiske biopsier av pasienten GBM. En sensitivitetsindeks (SI) som gjenspeiler forskjellen på forventet kombinert effekt og den observerte kombinerte effekten ble introdusert i denne metoden for å kvantifisere synergiserende effekten av hvert legemiddel, slik at potensielle kandidater lett kan identifiseres av SI-rangeringen. I mellomtiden demonstrerer denne protokollen et eksempelskjermbilde for å identifisere potensielle kandidater som kan synergisere anti-glioma-effekten med temozolomid, førstelinje kjemoterapi for GBM-behandling, blant 20 små molekylære hemmere.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluta Max</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>P: 10,000 units/ml&#160;&#160;&#160;&#160; S:&#160; 10,000 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2088876</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 1. The&#160;formulation&#160;of GSC&#160;complete culture medium.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABT-737</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective and BH3 mimetic&#160;Bcl-2,&#160;Bcl-xL&#160;and&#160;Bcl-w&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adavosertib (MK-1775)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Wee1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZD5991</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Potent inhibitor of TGF-&#946; type I receptor&#160;ALK5 kinase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP57380</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent&#160;MNK1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dactolisib (BEZ235)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Dual ATP-competitive&#160;PI3K&#160;and&#160;mTOR&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dasatinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Dual&#160;Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR&#160;tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gefitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linifanib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of&#160;VEGFR&#160;and&#160;PDGFR&#160;family</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Inhibitor of&#160;c-Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML141</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Non-competitive inhibitor of&#160;Cdc42 GTPase&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSI-930</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;CDK4&#160;and&#160;CDK6&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 202190</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;p38 MAP kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepantronium bromide (YM-155)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Survivin&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS 359</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent FLT3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMI-77</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;estrogen receptor (ER)&#160;modulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid screening workflow to identify potential combination therapy for gbm using patient-derived glioma stem cells

Glioma stamceller (GSC) er en liten brøkdel av kreftceller som spiller viktige roller i tumorinitiering, angiogenese og legemiddelresistens i glioblastom (GBM), den mest utbredte og ødeleggende primære hjernesvulsten. Tilstedeværelsen av GSC-er gjør GBM svært ildfast for de fleste individuelle målrettede midler, så det kreves screeningmetoder med høy gjennomstrømning for å identifisere potensielle effektive kombinasjonsterapeutiske midler. Protokollen beskriver en enkel arbeidsflyt for å muliggjøre rask screening for potensiell kombinasjonsterapi med synergistisk interaksjon. De generelle trinnene i denne arbeidsflyten består i å etablere luciferase-taggede GSC-er, forberede matrigelbelagte plater, kombinere legemiddelscreening, analysere og validere resultatene.

XG387-cellene dannet nevrosfærer i kulturmediet beskrevet i tabell 1 i en ultra-lav feste 6-brønns kulturplate eller en ikke-belagt plate5 (Figur 1A). Først ble det utført en test for å sjekke om bio-luminescensintensiteten fra XG387-Luc-celler var proporsjonal med cellenummeret. Som vist i figur 1Bøkte bio-luminescensintensiteten proporsjonalt med celletettheten og resulterte i en lineær korreksjon mellom dem (Pea...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells at JoVE.com

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

En arbeidsflyt for rask screening for å identifisere potensiell kombinasjonsterapi for GBM ved bruk av pasientavledede gliomastammeceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Glioma stamceller er underpopulasjon av celler i glioma, som vanligvis er motstandsdyktige mot kjemo og strålebehandling. Her beskrev vi metoden for rask identifisering av kombinasjonsterapier, rettet mot glioma stamceller, i stedet for differensierte gliomaceller. Sammenlignet med andre metoder, som kan være en arbeidskrevende og komplisert.Denne protokollen er en relativt enkel og rask, for å identifisere potensielle nyttige legemiddelkombinasjoner. Begynn med å samle glioma stamceller eller GSC fra kulturmediet, og sentrifuger dem på 70 ganger G i tre minutter ved romtemperatur. Etter å ha fjernet supernatanten, fordøye cellene med accutase i fire minutter ved 37 grader Celsius.Bruk en 200 mikroliterspiss, pipette cellene gjentatte ganger for å dissosiere, og resuspendere cellepelleten. Tilsett GSC-ene med en tetthet på 200 000 celler i ett milliliter kulturmedium, i hver brønn på en 12 brønnkulturplate, og inkuber dem over natten. Åh neste dag, legge til 30 mikroliter luciferase-eGFP virus supernatant i hver brønn av platen.Sentrifuger cellene ved 1000 ganger G i to timer, ved 25 grader Celsius og inkuber dem over natten. Påfølgende dag, erstatt mediet i brønnene ved å samle GSC-ene, sentrifugere dem, fjerne supernatanten, resuspendere dem i friskt medium og replating dem. Kultur cellene i ytterligere 48 timer.Vær oppmerksom på platen under et fluorescerende mikroskop og bekreft utseendet til GFP-positive celler. Sorter og samle GSC-ene med høy fluorescens ved hjelp av en flowcellesortering og kultur dem videre. Frakk, 96 godt optiske bunnplater med en ekstracellulær matriseblanding, for eksempel matrigel, og inkuber dem i en time ved 37 grader Celsius.Fjern overflødig blanding og skyll platene forsiktig en gang med PBS, deretter frø XG387-Luc-celler med en tetthet på 1000 celler i 100 mikroliter kulturmedium, og til hver brønn av de belagte platene og kultur dem over natten. Påfølgende dag, observere cellene under et mikroskop for å bekrefte deres vedlegg til platen. Deretter forbereder du en 200 mikromolar temozolomidløsning og to mikromolarløsninger av de målrettede midlene, i kulturmedium.For kombinasjonsmedisinscreening, fjern det tomme mediet og legg til mediet som inneholder enten 200 mikromolar temozolomid eller to mikromolar målrettet middel, eller en kombinasjon av begge deler, i hver brønn for tre tekniske repliker per behandling. Inkuber platen ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i tre dager. Ta bilder av cellulær bioluminescens i platen ved hjelp av IVIS-spektrumavbildningssystemet.Ved hjelp av den innebygde programvaren, lag flere sirkulære områder av interesseområdet og kvantifisere den cellulære bioluminescensen. For å identifisere potensielle kandidater som kunne forbedre antiglioblastomeffekten av temozolomid, ble 20 mål selektive små molekylhemmere analysert gjennom legemiddelkombinasjonsscreening. De sensitive indeksverdiene til 13 målrettede agenter var over null, og fem av dem var over 0,1.Den følsomme indeksen for de to beste kandidatmedisinene UMI-77 og A 83-01 var høyere enn 0,25, noe som tyder på deres potensial til å synergisere med temozolomid. Den kombinerte behandlingen av temozolomid og UMI-77 ble evaluert ved hjelp av en antiproliferasjonsanalyse i en seks-seks dose titreringsmatrise. Kombinasjonsindeksverdiene var mindre enn én.Og de høye enkeltagentverdiene var større enn null for de fleste kombinasjonene av temozolomid og UMI-77 ved forskjellige konsentrasjoner. Foreslår en generell synergistisk interaksjon mellom temozolomid og UMI-77 i både XG387 og XG328 GSC. Denne protokollen kan også brukes til å finne legemiddelkombinasjon ved hjelp av tilhengerkreftceller ved ganske enkelt å fjerne platebeleggtrinnet.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokoll for Rapid Post mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Genomet hele RNAi Screening å identifisere vert faktorer som modulerer kan viruset terapi

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modellering Osteosarcoma bruker Li-Fraumeni syndrom pasient-avledede Induced Pluripotent stamceller

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

En melanom pasient-avledet Xenograft modell

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologiske pasient avledet 3D Spheroids for anti-neoplastic Drug screening å målrette Cancer stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Bruke Human indusert Pluripotent stamceller for generering av tumor antigen-spesifikke T celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

En arbeidsflyt for dataintegrering for å identifisere stoffkombinasjoner rettet mot syntetiske dødelige interaksjoner

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Kombinert betinget knockdown og tilpasset sfæreformasjonsanalyse for å studere et stemness-assosiert gen av pasientavledede magekreft stamceller

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Narkotikascreening av primær pasient avledet tumor xenografts i sebrafisk

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Samlet shRNA-bibliotekscreening for å identifisere faktorer som modulerer en legemiddelresistensfenotype

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...