Name: a rapid screening workflow to identify potential combination therapy for gbm using patient-derived glioma stem cells
Uploaded: 2021-03-28T13:00:00
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Agradecemos à Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81672962), à Fundação do Programa de Inovação Provincial de Jiangsu e à Joint Key Project Foundation da Universidade do Sudeste e à Universidade Médica de Nanjing pelo apoio.

A amostra GBM foi adquirida de um paciente durante uma operação de rotina após obter o consentimento totalmente informado pelo comitê de ética em pesquisa humana do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Nanjing.
1. Isolamento e cultura de GSCs derivados do paciente
<ol><li>Coloque tecido glioblastoma ressecado cirurgicamente fresco em um tubo de centrífuga de 15 mL cheio de PBS estéril e armazene o tecido no gelo até uma nova operação.</li>
	<li>Pique o tecido GBM e...

<ol>
	<li>Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+glioblastoma.">Cancer stem cells in glioblastoma.</a> Genes &amp; Development. 29 (12), 1203-1217 (2015).</li><li>Binello, E., Germano, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+stem+cells:+a+novel+framework+for+brain+tumors.">Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors.</a> Cancer Science. 102 (11), 1958-1966 (2011).</li><li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells.">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li><li>Di Veroli, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combenefit:+an+interactive+platform+for+the+analysis+and+visualization+of+drug+combinations.">Combenefit: an interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations.</a> Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+inactivates+BMX-STAT3+in+glioma+stem+cells+to+impair+malignant+growth+and+radioresistance.">Ibrutinib inactivates BMX-STAT3 in glioma stem cells to impair malignant growth and radioresistance.</a> Science Translational Medicine. 10 (443), 1-13 (2018).</li><li>Tan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+synergistic+drug+pairs+targeting+HIV.">Systematic identification of synergistic drug pairs targeting HIV.</a> Nature Biotechnology. 30 (11), 1125-1130 (2012).</li><li>Jansen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinome-wide+RNA+interference+screen+reveals+a+role+for+PDK1+in+acquired+resistance+to+CDK4/6+inhibition+in+ER-positive+breast+cancer.">Kinome-wide RNA interference screen reveals a role for PDK1 in acquired resistance to CDK4/6 inhibition in ER-positive breast cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2488-2499 (2017).</li><li>Malyutina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+sensitivity+scoring+facilitates+the+discovery+of+synergistic+and+efficacious+drug+combinations+in+cancer.">Drug combination sensitivity scoring facilitates the discovery of synergistic and efficacious drug combinations in cancer.</a> PLoS Computational Biology. 15 (5), 1006752 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+High-throughput+drug+combination+screening+and+synergy+scoring.">Methods for High-throughput drug combination screening and synergy scoring.</a> Cancer Systems Biology. 1711, 351-398 (2018).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+synthetic+vulnerability+of+PTEN-deficient+glioblastoma+cells+with+MCL1+inhibitors.">Targeting the synthetic vulnerability of PTEN-deficient glioblastoma cells with MCL1 inhibitors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 19 (10), 2001-2011 (2020).</li></ol>

No presente estudo, foi descrito um protocolo que pode ser aplicado para identificar uma potencial terapia de combinação para GBM usando GSCs derivados do paciente. Ao contrário do modelo métrico de sinergia/aditividade padrão, como os métodos Loewe, BLISS ou HSA, foi utilizado um fluxo de trabalho simples e rápido que não requer que um par de drogas seja combinado em múltiplas concentrações de forma fatorial completa como os métodos tradicionais. Neste fluxo de trabalho, o SI (índice de sensibilidade) que ?...

Glioblastoma (GBM) é o tipo mais comum e agressivo de tumor cerebral primário. Atualmente, a sobrevida geral de pacientes com GBM que receberam tratamento máximo (uma combinação de cirurgia, quimioterapia e radioterapia) ainda é menor que 15 meses; por isso terapias novas e eficazes para GBM são urgentemente necessárias.
A presença de células-tronco de glioma (GSCs) no GBM constitui um desafio considerável para o tratamento convencional, uma vez que essas células-tronco desempenham papéis pivôs na manutenção do microambiente tumoral, resistência a medicamentos e recorrência do tumor1. Portanto, direcionar GSCs pode ser uma estratégia promissora para o tratamento GBM2. No entanto, uma grande desvantagem para a eficácia da droga no GBM é sua natureza heterogenética, incluindo, mas não se limitando à diferença de mutações genéticas, subtipos mistos, regulação epigenética e microambiente tumoral, o que os torna muito refratários para o tratamento. Depois de muitos testes clínicos fracassados, cientistas e pesquisadores clínicos perceberam que a terapia-alvo de um único agente é provavelmente incapaz de controlar totalmente a progressão de cânceres altamente heterogêneos, como o GBM. Considerando que, combinações de medicamentos cuidadosamente selecionadas foram aprovadas para sua eficácia, aumentando sinérgicamente o efeito uns dos outros, fornecendo assim uma solução promissora para o tratamento de GBM.
Embora existam muitas maneiras de avaliar as interações medicamentosa-droga de uma combinação de drogas, como o CI (Índice de Combinação), HSA (Highest Single Agent) e os valores bliss, etc.3,4, esses métodos de cálculo são geralmente baseados em múltiplas combinações de concentração. De fato, esses métodos podem fornecer avaliação afirmativa da interação medicamentosa-droga, mas podem ser muito trabalhosos se forem aplicados na triagem de alto rendimento. Para simplificar o processo, foi desenvolvido um fluxo de trabalho de triagem para identificar rapidamente as combinações potenciais de medicamentos que inibem o crescimento de GSCs originados de biópsias cirúrgicas do GBM do paciente. Um Índice de Sensibilidade (SI) que reflete a diferença do efeito combinado esperado e o efeito combinado observado foi introduzido neste método para quantificar o efeito sinérgico de cada droga, de modo que os candidatos potenciais podem ser facilmente identificados pelo ranking SI. Enquanto isso, este protocolo demonstra uma tela de exemplo para identificar os potenciais candidatos que podem sinergizar o efeito anti-glioma com temozolomide, a quimioterapia de primeira linha para o tratamento de GBM, entre 20 pequenos inibidores moleculares.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluta Max</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>P: 10,000 units/ml&#160;&#160;&#160;&#160; S:&#160; 10,000 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2088876</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 1. The&#160;formulation&#160;of GSC&#160;complete culture medium.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABT-737</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective and BH3 mimetic&#160;Bcl-2,&#160;Bcl-xL&#160;and&#160;Bcl-w&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adavosertib (MK-1775)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Wee1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZD5991</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Potent inhibitor of TGF-&#946; type I receptor&#160;ALK5 kinase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP57380</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent&#160;MNK1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dactolisib (BEZ235)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Dual ATP-competitive&#160;PI3K&#160;and&#160;mTOR&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dasatinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Dual&#160;Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR&#160;tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gefitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linifanib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of&#160;VEGFR&#160;and&#160;PDGFR&#160;family</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Inhibitor of&#160;c-Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML141</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Non-competitive inhibitor of&#160;Cdc42 GTPase&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSI-930</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;CDK4&#160;and&#160;CDK6&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 202190</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;p38 MAP kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepantronium bromide (YM-155)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Survivin&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS 359</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent FLT3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMI-77</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;estrogen receptor (ER)&#160;modulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid screening workflow to identify potential combination therapy for gbm using patient-derived glioma stem cells

As células-tronco de glioma (GSCs) são uma pequena fração de células cancerosas que desempenham papéis essenciais na iniciação do tumor, angiogênese e resistência a medicamentos no glioblastoma (GBM), o tumor cerebral primário mais prevalente e devastador. A presença de GSCs torna o GBM muito refratária para a maioria dos agentes alvos individuais, de modo que métodos de triagem de alto rendimento são necessários para identificar potenciais terapêuticas de combinação eficaz. O protocolo descreve um fluxo de trabalho simples para permitir uma triagem rápida para terapia de combinação potencial com interação sinérgica. As etapas gerais deste fluxo de trabalho consistem em estabelecer GSCs com marca de luciferase, preparar placas revestidas de matrigel, triagem combinada de medicamentos, analisar e validar os resultados.

As células XG387 formaram neuroesferas no meio de cultura descrito na Tabela 1 em uma placa de cultura de 6 poços de apego ultra-baixa ou uma placa não revestida5 (Figura 1A). Primeiro, foi realizado um teste para verificar se a intensidade de biolumescência das células XG387-Luc era proporcional ao número celular. Como mostrado na Figura 1B,a intensidade da biolumescência aumentou proporcionalmente à densidade ce...

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A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Um fluxo de trabalho de triagem rápida para identificar terapia de combinação potencial para GBM usando células-tronco glioma derivadas do paciente

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Glioma stem As células-tronco são sub-população de células no glioma, que geralmente são resistentes à quimioterapia e radioterapia. Aqui descrevemos o método de identificação rápida de terapias combinadas, visando células-tronco glioma, em vez de células glioma diferenciadas. Comparado com outros métodos, o que pode ser um trabalhoso e complicado.Este protocolo é relativamente simples e rápido, para identificar potenciais combinações de drogas úteis. Comece coletando as células-tronco de glioma ou GSCs do meio de cultura, e centrifugando-as a 70 vezes G por três minutos à temperatura ambiente. Depois de remover o supernante, digerir as células com accutase por quatro minutos a 37 graus Celsius.Usando uma ponta de 200 microliter, pipeta as células repetidamente para dissociar, e resuspensar a pelota celular. Adicione os GSCs a uma densidade de 200.000 células em um mililitro de cultura média, em cada poço de uma placa de cultura de 12 poços, e incuba-los durante a noite. Oh no dia seguinte, adicione 30 microliters de luciferase-eGFP vírus supernante em cada poço da placa.Centrifugar as células a 1000 vezes G por duas horas, a 25 graus Celsius e incuba-las durante a noite. No dia seguinte, substitua o meio nos poços coletando os GSCs, centrifugando-os, removendo o supernascimento, reutilizando-os em meio fresco e ressuculando-os. Cultue as células por mais 48 horas.Observe a placa sob um microscópio fluorescente e confirme o aparecimento de células GFP positivos. Classifique e colete os GSCs com uma alta fluorescência usando um classificador de células de fluxo e cultuá-los ainda mais. Cubra, 96 placas de fundo ópticas com uma mistura de matriz extracelular, como o matrigel, e incuba-as por uma hora a 37 graus Celsius.Remova a mistura em excesso e enxágue suavemente as placas uma vez com PBS, em seguida, sementes células XG387-Luc a uma densidade de 1000 células em 100 microliters de meio cultura, e para cada poço das placas revestidas e cultuá-las durante a noite. No dia seguinte, observe as células sob um microscópio para confirmar sua ligação com a placa. Em seguida, prepare uma solução de 200 temozolomidas de micromolar e duas soluções micromolar dos agentes alvos, no meio da cultura.Para a triagem combinada de drogas, remova o meio em branco e adicione o meio contendo 200 temozolomida micromolar ou dois agentes-alvo micromolar, ou uma combinação de ambos, em cada poço para três réplicas técnicas por tratamento. Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três dias. Tire imagens da bioluminescência celular na placa usando o sistema de imagem de espectro IVIS.Usando o software embutido, crie várias áreas circulares da região de interesse e quantifique a bioluminescência celular. Para identificar potenciais candidatos que poderiam aumentar o efeito antiglioblastoma do temozolomide, 20 inibidores seletivos de pequenas moléculas foram analisados através da triagem de combinação de drogas. Os valores de índice sensíveis de 13 agentes-alvo estavam acima de zero e cinco deles acima de 0,1.O índice sensível das duas principais drogas candidatas UMI-77 e A 83-01, foram superiores a 0,25, sugerindo seu potencial de sinergizar com temozolomide. O tratamento combinado de temozolomida e UMI-77 foi avaliado utilizando um ensaio anti-proliferativo em uma matriz de titulação de seis por seis doses. Os valores do índice de combinação foram inferiores a um.E os altos valores de agente único foram maiores que zero para a maioria das combinações de temozolomide e UMI-77 em diferentes concentrações. Sugerindo uma interação sinérgica geral de temozolomide e UMI-77 em GSCs XG387 e XG328. Este protocolo também pode ser aplicado em encontrar combinação de drogas usando células cancerígenas aderentes, simplesmente removendo a etapa de revestimento da placa.

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