Name: a rapid screening workflow to identify potential combination therapy for gbm using patient-derived glioma stem cells
Uploaded: 2021-03-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells at JoVE.com

Мы благодарим Национальный фонд естественных наук Китая (81672962), Фонд программы инновационной команды провинции Цзянсу и Фонд совместных ключевых проектов Юго-Восточного университета и Нанкинского медицинского университета за их поддержку.

Образец GBM был получен от пациента во время обычной операции после получения полностью информированного согласия комитета по этике исследований человека Первой аффилированной больницы Нанкинскому медицинскому университету.
1. Выделение и культура ГСК, полученных от пац...

<ol>
	<li>Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+glioblastoma.">Cancer stem cells in glioblastoma.</a> Genes &amp; Development. 29 (12), 1203-1217 (2015).</li><li>Binello, E., Germano, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+stem+cells:+a+novel+framework+for+brain+tumors.">Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors.</a> Cancer Science. 102 (11), 1958-1966 (2011).</li><li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells.">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li><li>Di Veroli, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combenefit:+an+interactive+platform+for+the+analysis+and+visualization+of+drug+combinations.">Combenefit: an interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations.</a> Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+inactivates+BMX-STAT3+in+glioma+stem+cells+to+impair+malignant+growth+and+radioresistance.">Ibrutinib inactivates BMX-STAT3 in glioma stem cells to impair malignant growth and radioresistance.</a> Science Translational Medicine. 10 (443), 1-13 (2018).</li><li>Tan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+synergistic+drug+pairs+targeting+HIV.">Systematic identification of synergistic drug pairs targeting HIV.</a> Nature Biotechnology. 30 (11), 1125-1130 (2012).</li><li>Jansen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinome-wide+RNA+interference+screen+reveals+a+role+for+PDK1+in+acquired+resistance+to+CDK4/6+inhibition+in+ER-positive+breast+cancer.">Kinome-wide RNA interference screen reveals a role for PDK1 in acquired resistance to CDK4/6 inhibition in ER-positive breast cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2488-2499 (2017).</li><li>Malyutina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+sensitivity+scoring+facilitates+the+discovery+of+synergistic+and+efficacious+drug+combinations+in+cancer.">Drug combination sensitivity scoring facilitates the discovery of synergistic and efficacious drug combinations in cancer.</a> PLoS Computational Biology. 15 (5), 1006752 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+High-throughput+drug+combination+screening+and+synergy+scoring.">Methods for High-throughput drug combination screening and synergy scoring.</a> Cancer Systems Biology. 1711, 351-398 (2018).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+synthetic+vulnerability+of+PTEN-deficient+glioblastoma+cells+with+MCL1+inhibitors.">Targeting the synthetic vulnerability of PTEN-deficient glioblastoma cells with MCL1 inhibitors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 19 (10), 2001-2011 (2020).</li></ol>

В настоящем исследовании был описан протокол, который может быть применен для идентификации потенциальной комбинированной терапии ГБМ с использованием ГСК, полученных от пациента. В отличие от стандартной метрической модели синергии/аддитивности, такой как методы Loewe, BLISS или HSA, был и?...

Глиобластома (ГБМ) является наиболее распространенным и агрессивным типом первичной опухоли головного мозга. В настоящее время общая выживаемость пациентов с ГБМ, получивших максимальное лечение (сочетание хирургического вмешательства, химиотерапии и лучевой терапии), по-прежнему короче 15 месяцев; поэтому срочно необходимы новые и эффективные методы лечения ГБМ.
Наличие стволовых клеток глиомы (GSC) в GBM представляет собой значительную проблему для традиционного лечения, поскольку эти стволовые клетки играют ключевую роль в поддержании микроокружения опухоли, лекарственной устойчивости и рецидива опухоли1. Таким образом, нацеливание на ГСК может быть многообещающей стратегией для лечения ГБМ2. Тем не менее, основным недостатком эффективности препарата при ГБМ является его гетерогенетическая природа, включая, но не ограничиваясь, разницей в генетических мутациях, смешанных подтипах, эпигенетической регуляции и микроокружении опухоли, что делает их очень рефрактерными для лечения. После многих неудачных клинических испытаний ученые и клинические исследователи поняли, что таргетная терапия с одним агентом, вероятно, не способна полностью контролировать прогрессирование высоко гетерогенных видов рака, таких как GBM. Принимая во внимание, что тщательно отобранные комбинации лекарств были одобрены для их эффективности путем синергетического усиления эффекта друг друга, обеспечивая тем самым многообещающее решение для лечения ГБМ.
Хотя существует много способов оценки лекарственно-лекарственного взаимодействия лекарственной комбинации, таких как CI (комбинированный индекс), HSA (самый высокий одиночный агент) и значения Bliss и т. Д.3,4,эти методы расчета обычно основаны на комбинациях нескольких концентраций. Действительно, эти методы могут обеспечить утвердительную оценку лекарственного взаимодействия, но могут быть очень трудоемкими, если они применяются при высокопроизводительном скрининге. Чтобы упростить процесс, был разработан процесс скрининга для быстрого выявления потенциальных комбинаций лекарств, которые ингибируют рост ГСК, полученных из хирургических биопсий пациента GBM. Индекс чувствительности (СИ), который отражает разницу ожидаемого комбинированного эффекта и наблюдаемого комбинированного эффекта, был введен в этот метод для количественной оценки синергетического эффекта каждого лекарственного средства, поэтому потенциальные кандидаты могут быть легко идентифицированы по рейтингу СИ. Между тем, этот протокол демонстрирует пример скрининга для идентификации потенциального кандидата (кандидатов), который может синергизировать эффект антиглиомы с темозоломидом, химиотерапией первой линии для лечения GBM, среди 20 малых молекулярных ингибиторов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluta Max</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>P: 10,000 units/ml&#160;&#160;&#160;&#160; S:&#160; 10,000 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2088876</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 1. The&#160;formulation&#160;of GSC&#160;complete culture medium.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABT-737</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective and BH3 mimetic&#160;Bcl-2,&#160;Bcl-xL&#160;and&#160;Bcl-w&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adavosertib (MK-1775)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Wee1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZD5991</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Potent inhibitor of TGF-&#946; type I receptor&#160;ALK5 kinase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP57380</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent&#160;MNK1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dactolisib (BEZ235)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Dual ATP-competitive&#160;PI3K&#160;and&#160;mTOR&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dasatinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Dual&#160;Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR&#160;tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gefitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linifanib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of&#160;VEGFR&#160;and&#160;PDGFR&#160;family</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Inhibitor of&#160;c-Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML141</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Non-competitive inhibitor of&#160;Cdc42 GTPase&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSI-930</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;CDK4&#160;and&#160;CDK6&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 202190</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;p38 MAP kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepantronium bromide (YM-155)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Survivin&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS 359</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent FLT3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMI-77</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;estrogen receptor (ER)&#160;modulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid screening workflow to identify potential combination therapy for gbm using patient-derived glioma stem cells

Стволовые клетки глиомы (GSC) представляют собой небольшую часть раковых клеток, которые играют важную роль в инициации опухоли, ангиогенезе и лекарственной устойчивости при глиобластоме (GBM), наиболее распространенной и разрушительной первичной опухоли головного мозга. Наличие ГСК делает GBM очень рефрактерным к большинству отдельных целевых агентов, поэтому для выявления потенциальных эффективных комбинированных терапевтических средств требуются высокопроизводительный скрининг. Протокол описывает простой рабочий процесс, позволяющий быстро проводить скрининг потенциальной комбинированной терапии с синергетическим взаимодействием. Общие этапы этого рабочего процесса состоят из установления ГСК, помеченных люциферазой, подготовки пластин с матригелевым покрытием, скрининга комбинированных препаратов, анализа и проверки результатов.

Клетки XG387 образовывали невросферы в питательной среде, описанной в таблице 1, в ультранизком прикреплении 6-скважинной культурной пластины или нешерстной пластины5 (фиг.1А). Во-первых, был проведен тест, чтобы проверить, была ли интенсивность биолюм?...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells at JoVE.com

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Быстрый процесс скрининга для определения потенциальной комбинированной терапии GBM с использованием стволовых клеток глиомы, полученных от пациента

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Стволовые клетки глиомы представляют собой субпопудрения клеток в глиоме, которые обычно устойчивы к химио- и лучевой терапии. Здесь мы описали метод быстрой идентификации комбинированной терапии, нацеленной на стволовые клетки глиомы, вместо дифференцированных клеток глиомы. По сравнению с другими методами, которые могут быть трудоемкими и сложными.Этот протокол является относительно простым и быстрым, чтобы выявить потенциальные полезные комбинации лекарств. Начните с сбора стволовых клеток глиомы или ГСК из питательной среды и центрифугирования их в 70 раз G в течение трех минут при комнатной температуре. После удаления супернатанта переварите клетки с аккутазой в течение четырех минут при 37 градусах Цельсия.Используя наконечник на 200 микролитров, несколько раз пипетка клеток диссоциирует и повторно суспендирует гранулу клетки. Добавьте ГСК плотностью 200 000 клеток в одном миллилитрах питательной среды в каждую лунку 12-луночной культурной пластины и инкубируют их в течение ночи. На следующий день добавьте 30 микролитров супернатанта вируса люциферазы-eGFP в каждую лунку пластины.Центрифугируют клетки в 1000 раз G в течение двух часов, при 25 градусах Цельсия и инкубируют их в течение ночи. На следующий день замените среду в скважинах, собрав ГСК, центрифугируя их, удаляя супернатант, повторно испаскивая их в свежей среде и повторно покрывая их. Культивьять клетки еще 48 часов.Понаблюдайте за пластинкой под флуоресцентным микроскопом и подтвердите появление GFP-положительных клеток. Сортируйте и собирайте ГСК с высокой флуоресценцией с помощью сортировщика проточных клеток и культивируйте их дальше. Обложите 96 хорошо оптическими нижними пластинами с внеклеточной матричной смесью, такой как матригель, и инкубируют их в течение одного часа при 37 градусах Цельсия.Удалите излишки смеси и аккуратно промойте пластины один раз PBS, затем засейте клетки XG387-Luc плотностью 1000 клеток в 100 микролитрах питательной среды, а в каждую лунку покрытые пластины и культивируйте их на ночь. На следующий день понаблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы подтвердить их прикрепление к пластине. Далее готовят 200 микромолярный раствор темозоломида и два микромолярных раствора целевых агентов, в культуральная среда.Для скрининга комбинированных лекарственных средств удалите пустую среду и добавьте среду, содержащую либо 200 микромолярный темозоломид, либо два микромолярных целевых агента, либо комбинацию обоих, в каждую скважину для трех технических реплик на лечение. Инкубируют пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение трех дней. Сделайте снимки клеточной биолюминесценции в пластине с помощью системы визуализации спектра IVIS.Используя встроенное программное обеспечение, создайте несколько круговых областей интересуемой области и количественно оцените клеточную биолюминесценцию. Чтобы определить потенциальных кандидатов, которые могли бы усилить антиглиобластомный эффект темозоломида, 20 целевых селективных ингибиторов малых молекул были проанализированы с помощью скрининга комбинации препаратов. Чувствительные значения индекса 13 целевых агентов были выше нуля, а пять из них были выше 0,1.Чувствительный индекс двух лучших препаратов-кандидатов UMI-77 и A 83-01 был выше 0,25, что свидетельствует об их потенциале синергизма с темозоломидом. Комбинированное лечение темозоломидом и UMI-77 оценивали с использованием антипролиферативного анализа в матрице титрования шести на шесть доз. Значения комбинированного индекса были меньше одного.А высокие значения одного агента были больше нуля для большинства комбинаций темозоломида и UMI-77 в разных концентрациях. Предположение об общем синергетическом взаимодействии темозоломида и UMI-77 в ГСК XG387 и XG328. Этот протокол также может быть применен при поиске комбинации лекарств с использованием адгезивных раковых клеток путем простого удаления пластинчатого покрытия.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Протокол для быстрой Посмертное культуре клеток диффузной Характеристическая Понтийской глиомы (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Геном всей RNAi скрининг для выявления факторов хоста, которые модулируют вирус онколитического терапии

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Моделирование остеосаркома, используя синдром ли Фраумени, которую пациент производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Меланома пациента-производные Ксенотрансплантат Модель

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Физиологические пациент выведенных 3D сфероидов для анти-неопластических наркотиков скрининга целевой рак стволовых клеток

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для поколения опухолевых антигенов конкретных Т-клеток

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Рабочий процесс интеграции данных для выявления комбинаций лекарств, нацеленных на синтетические смертельные взаимодействия

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Комбинированные Условный Нокдаун и Адаптированные Сфера Формирование Анализ для изучения Stemness-Ассоциированный ген пациента полученных стволовых клеток рака желудка

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Скрининг наркотиков первичного пациента, полученных опухоли Xenografts в зебрафиш

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Объединенный скрининг библиотеки шРНК для выявления факторов, модулирующих фенотип лекарственной устойчивости

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...