Name: a rapid screening workflow to identify potential combination therapy for gbm using patient-derived glioma stem cells
Uploaded: 2021-03-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells at JoVE.com

Vi tackar National Natural Science Foundation of China (81672962), Jiangsu Provincial Innovation Team Program Foundation och Joint Key Project Foundation of Southeast University och Nanjing Medical University för deras stöd.

GBM-exemplaret förvärvades från en patient under en rutinoperation efter att ha fått fullt informerat samtycke från human research ethics committee vid The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University.
1. Isolering och odling av patientbaserade GSCs
<ol><li>Placera färsk kirurgiskt rekterad glioblastomvävnad i ett 15 ml centrifugeringsrör fyllt med steril PBS och förvara vävnaden på is tills den är vidare.</li>
	<li>Hacka GBM-vävnaden i bitar med en diameter på cirka...

<ol>
	<li>Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+glioblastoma.">Cancer stem cells in glioblastoma.</a> Genes &amp; Development. 29 (12), 1203-1217 (2015).</li><li>Binello, E., Germano, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+stem+cells:+a+novel+framework+for+brain+tumors.">Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors.</a> Cancer Science. 102 (11), 1958-1966 (2011).</li><li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells.">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li><li>Di Veroli, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combenefit:+an+interactive+platform+for+the+analysis+and+visualization+of+drug+combinations.">Combenefit: an interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations.</a> Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+inactivates+BMX-STAT3+in+glioma+stem+cells+to+impair+malignant+growth+and+radioresistance.">Ibrutinib inactivates BMX-STAT3 in glioma stem cells to impair malignant growth and radioresistance.</a> Science Translational Medicine. 10 (443), 1-13 (2018).</li><li>Tan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+synergistic+drug+pairs+targeting+HIV.">Systematic identification of synergistic drug pairs targeting HIV.</a> Nature Biotechnology. 30 (11), 1125-1130 (2012).</li><li>Jansen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinome-wide+RNA+interference+screen+reveals+a+role+for+PDK1+in+acquired+resistance+to+CDK4/6+inhibition+in+ER-positive+breast+cancer.">Kinome-wide RNA interference screen reveals a role for PDK1 in acquired resistance to CDK4/6 inhibition in ER-positive breast cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2488-2499 (2017).</li><li>Malyutina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+sensitivity+scoring+facilitates+the+discovery+of+synergistic+and+efficacious+drug+combinations+in+cancer.">Drug combination sensitivity scoring facilitates the discovery of synergistic and efficacious drug combinations in cancer.</a> PLoS Computational Biology. 15 (5), 1006752 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+High-throughput+drug+combination+screening+and+synergy+scoring.">Methods for High-throughput drug combination screening and synergy scoring.</a> Cancer Systems Biology. 1711, 351-398 (2018).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+synthetic+vulnerability+of+PTEN-deficient+glioblastoma+cells+with+MCL1+inhibitors.">Targeting the synthetic vulnerability of PTEN-deficient glioblastoma cells with MCL1 inhibitors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 19 (10), 2001-2011 (2020).</li></ol>

I den aktuella studien beskrevs ett protokoll som kan tillämpas för att identifiera potentiell kombinationsbehandling för GBM med patientbaserade GSCs. Till skillnad från standardsynergi/additivitetsmåttsmodellen som Loewe-, BLISS- eller HSA-metoder användes ett enkelt och snabbt arbetsflöde som inte kräver att ett läkemedelspar kombineras vid flera koncentrationer på ett fullständigt faktoriellt sätt som de traditionella metoderna. I detta arbetsflöde introducerades SI (känslighetsindex) som härstammar fr...

Glioblastoma (GBM) är den vanligaste och aggressiva typen av primär hjärntumör. För närvarande är den totala överlevnaden för GBM-patienter som fick maximal behandling (en kombination av kirurgi, kemoterapi och strålbehandling) fortfarande kortare än 15 månader; så nya och effektiva terapier för GBM är brådskande.
Förekomsten av gliom stamceller (GSCs) i GBM utgör en betydande utmaning för den konventionella behandlingen eftersom dessa stamliknande celler spelar pivot roller i underhållet av tumör microenvironment, läkemedelsresistens och tumör återkommande1. Därför kan inriktning på GSCs vara en lovande strategi för GBM behandling2. En stor nackdel för läkemedlets effekt i GBM är dock dess heterogenetiska natur, inklusive men inte begränsat till skillnaden i genetiska mutationer, blandade subtyper, epigenetisk reglering och tumörmikromiljö som gör dem mycket eldfasta för behandling. Efter många misslyckade kliniska prövningar insåg forskare och kliniska forskare att målinriktad behandling med en enda agent förmodligen inte helt kan kontrollera utvecklingen av mycket heterogena cancerformer som GBM. Noggrant utvalda läkemedelskombinationer har godkänts för deras effektivitet genom att synergistiskt förbättra effekten av varandra, vilket ger en lovande lösning för GBM-behandling.
Även om det finns många sätt att utvärdera läkemedelsinteraktionerna i en läkemedelskombination, såsom CI (Kombinationsindex), HSA (Högsta enskilda medel) och Bliss-värden, etc.3,4, baseras dessa beräkningsmetoder vanligtvis på flera koncentrationskombinationer. Dessa metoder kan faktiskt ge bekräftande bedömning av läkemedelsinteraktion men kan vara mycket mödosamma om de tillämpas vid screening med hög genomströmning. För att förenkla processen utvecklades ett screeningarbetsflöde för att snabbt identifiera de potentiella läkemedelskombinationer som hämmar tillväxten av GSCs från kirurgiska tarmbiopsier av patienten GBM. Ett känslighetsindex (SI) som återspeglar skillnaden mellan den förväntade kombinerade effekten och den observerade kombinerade effekten infördes i denna metod för att kvantifiera synergiseringseffekten av varje läkemedel, så att de potentiella kandidaterna lätt kan identifieras av SI-rankningen. Under tiden visar detta protokoll en exempelskärm för att identifiera den potentiella kandidaten/kandidaterna som kan synergisera anti-gliom-effekten med temozolomid, första linjens kemoterapi för GBM-behandling, bland 20 små molekylära hämmare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluta Max</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>P: 10,000 units/ml&#160;&#160;&#160;&#160; S:&#160; 10,000 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2088876</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 1. The&#160;formulation&#160;of GSC&#160;complete culture medium.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABT-737</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective and BH3 mimetic&#160;Bcl-2,&#160;Bcl-xL&#160;and&#160;Bcl-w&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adavosertib (MK-1775)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Wee1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZD5991</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Potent inhibitor of TGF-&#946; type I receptor&#160;ALK5 kinase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP57380</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent&#160;MNK1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dactolisib (BEZ235)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Dual ATP-competitive&#160;PI3K&#160;and&#160;mTOR&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dasatinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Dual&#160;Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR&#160;tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gefitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linifanib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of&#160;VEGFR&#160;and&#160;PDGFR&#160;family</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Inhibitor of&#160;c-Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML141</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Non-competitive inhibitor of&#160;Cdc42 GTPase&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSI-930</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;CDK4&#160;and&#160;CDK6&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 202190</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;p38 MAP kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepantronium bromide (YM-155)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Survivin&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS 359</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent FLT3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMI-77</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;estrogen receptor (ER)&#160;modulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid screening workflow to identify potential combination therapy for gbm using patient-derived glioma stem cells

Gliom stamceller (GSCs) är en liten del av cancerceller som spelar väsentliga roller i tumörinitiering, angiogenes och läkemedelsresistens i glioblastom (GBM), den vanligaste och förödande primära hjärntumören. Förekomsten av GSCs gör GBM mycket eldfast för de flesta enskilda riktade agenter, så screeningmetoder med hög genomströmning krävs för att identifiera potentiella effektiva kombinationsterapier. Protokollet beskriver ett enkelt arbetsflöde för att möjliggöra snabb screening för potentiell kombinationsterapi med synergistisk interaktion. De allmänna stegen i detta arbetsflöde består i att upprätta luciferasmärkta GSCs, förbereda matrigelbelagda plattor, kombinera läkemedelsscreening, analysera och validera resultaten.

XG387-cellerna bildade neurosfärer i odlingsmediet som beskrivs i tabell 1 i en ultralåg fastsättningsredskap 6-brunns odlingsplatta eller en icke-belagdplatta 5 (Figur 1A). Först utfördes ett test för att kontrollera om bioluminscensintensiteten från XG387-Luc-cellerna var proportionell mot cellnumret. Som visas i figur 1Bökade bioluminensintensiteten proportionellt mot celltätheten och resulterade i en linjär ...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells at JoVE.com

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Ett snabbt screeningarbetsflöde för att identifiera potentiell kombinationsterapi för GBM med hjälp av patientbaserade Glioma-stamceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Glioma stamceller är subpopulation av celler i gliom, som vanligtvis är resistenta mot cellgifter och strålbehandling. Här beskrev vi metoden för snabb identifiering av kombinationsterapier, riktade mot gliomstamceller, istället för differentierade gliomceller. Jämfört med andra metoder, som kan vara mödosamma och komplicerade.Detta protokoll är ett relativt enkelt och snabbt, för att identifiera potentiella användbara läkemedelskombinationer. Börja med att samla in gliomstamcellerna eller GSC:erna från odlingsmediet och centrifugera dem vid 70 gånger G i tre minuter vid rumstemperatur. Efter att ha tagit bort supernaten, smält cellerna med accutas i fyra minuter vid 37 grader Celsius.Med hjälp av en 200 mikroliterspets, pipett cellerna upprepade gånger för att dissociate och återanvänd cell pellet. Tillsätt GSCs med en densitet av 200 000 celler i en milliliter odlingsmedium, i varje brunn på en 12 brunns odlingsplatta och inkubera dem över natten. Åh nästa dag, tillsätt 30 mikroliter luciferase-eGFP-virus supernatant i varje brunn på plattan.Centrifugera cellerna vid 1000 gånger G i två timmar, vid 25 grader Celsius och inkubera dem över natten. På följande dag, byt ut mediet i brunnarna genom att samla GSCs, centrifugera dem, ta bort supernaten, återanvända dem i färskt medium och replera dem. Odla cellerna i ytterligare 48 timmar.Observera plattan under ett fluorescerande mikroskop och bekräfta utseendet på GFP-positiva celler. Sortera och samla GSCs med en hög fluorescens med hjälp av en flödescellsorterare och odla dem vidare. Kappa, 96 väl optiska bottenplattor med en extracellulär matrisblandning, såsom matrigel, och inkubera dem i en timme vid 37 grader Celsius.Ta bort överskottsblandningen och skölj försiktigt plattorna en gång med PBS, så sedan XG387-Luc-celler med en densitet av 1000 celler i 100 mikroliter odlingsmedium och till varje brunn på de belagda plattorna och odla dem över natten. Observera cellerna under ett mikroskop följande dag för att bekräfta deras fastsättning på plattan. Förbered sedan en 200 mikromolar temozolomide lösning och två mikromolar lösningar av de riktade agenterna, i kulturmedium.För screening av kombinationsläkemedel, avlägsna blindmediet och tillsätt mediet som innehåller antingen 200 mikromolekylär temozolomid eller två mikromolära målämne, eller en kombination av båda, i varje brunn för tre tekniska replikat per behandling. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i tre dagar. Ta bilder av cellbioluminescensen i plattan med hjälp av IVIS-spektrumavbildningssystemet.Med hjälp av den inbyggda programvaran skapar du flera cirkulära områden i intresseområdet och kvantifierar cellulär bioluminescens. För att identifiera potentiella kandidater som kunde förbättra antiglioblastomeffekten av temozolomid analyserades 20 målselektiva små molekylhämmare genom läkemedelskombinationsscreening. De känsliga indexvärdena för 13 riktade agenter var över noll och fem av dem var över 0,1.Det känsliga indexet för de två främsta läkemedelskandidaterna UMI-77 och A 83-01 var högre än 0,25, vilket tyder på deras potential att synergisera med temozolomid. Den kombinerade behandlingen av temozolomid och UMI- 77 utvärderades med hjälp av en antiproliferativ analys i en titreringsmatris med sex gånger sex doser. Kombinationsindexvärdena var mindre än ett.Och de höga värdena för en enda agent var större än noll för de flesta kombinationer av temozolomid och UMI-77 vid olika koncentrationer. Tyder på en övergripande synergistisk interaktion mellan temozolomid och UMI-77 i både XG387 och XG328 GSCs. Detta protokoll kan också tillämpas för att hitta läkemedelskombination med hjälp av vidhäftande cancerceller genom att helt enkelt ta bort plåtbeläggningssteget.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Ett protokoll för Rapid Post mortem Cell Culture av Diffus Intrinsic Pontine Gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Genome-wide RNAi Screening att identifiera värd faktorer som modulerar onkolytisk Virus terapi

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modeling osteosarkom med Li-Fraumeni syndrom patientderiverade inducerade pluripotenta stamceller

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

En melanom patient-derived xenograft modell

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisk patient härledda 3D spheroids för anti-neoplastisk drog screening för att rikta cancer stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Använda humana inducerade pluripotenta stamceller för generering av tumör antigen-specifika T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Ett arbetsflöde för dataintegrering för att identifiera läkemedelskombinationer som riktar sig mot syntetiska dödliga interaktioner

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Kombinerad villkorlig Knockdown och anpassad sfärbildning assay att studera en Stemness-Associated Gene av patient-derived Gastric Cancer Stamceller

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Läkemedelsscreening av primär patient härledd tumör Xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Poolad shRNA-biblioteksscreening för att identifiera faktorer som modulerar en läkemedelsresistensfenotyp

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...