Name: microcrystal electron diffraction of small molecules
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules at JoVE.com

يتم دعم مختبر جونين بأموال من معهد هوارد هيوز الطبي. تم دعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة P41GM136508.

1. تحضير عينات الجزيئات الصغيرة
<ol><li>انقل كمية صغيرة (0.01 - 1 مجم) من المسحوق أو السائل أو المواد الصلبة إلى قنينة أو أنبوب صغير.</li>
	<li>بالنسبة للعينات الموجودة بالفعل في شكل مسحوق ، أغلق الأنبوب باستخدام الغطاء حتى تكون هناك حاجة إلى العينة. جفف العينات السائلة إلى مساحيق قبل محاولات الطريقة ...

<ol>
	<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345 (2013).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED.">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li><li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector.">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li><li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+and+processing.">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP.">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109 (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size.">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking.">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel.">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li><li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination.">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li><li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation.">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li><li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-&#229;ngstr&#246;m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp.">Sub-&#229;ngstr&#246;m cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li><li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products.">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li><li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+with+SerialEM.">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS:+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED.">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li><li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography.">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+catalase+determined+by+MicroED.">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600 (2014).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED.">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li></ol>

عادة ما يكون إعداد العينة عملية تكرارية ، حيث يتم إجراء التحسينات بعد جلسات الفحص وجمع البيانات. بالنسبة لعينات الجزيئات الصغيرة ، غالبا ما يكون من الحكمة أولا محاولة تحضير الشبكة دون تفريغ الشبكات المتوهجة ، نظرا لأن العديد من المستحضرات الصيدلانية تميل إلى أن تكون كارهة للماء...

حيود الإلكترون البلوري الدقيق (MicroED) هو طريقة مجهرية إلكترونية بالتبريد (cryo-EM) لتحديد هياكل الدقة الذرية من بلورات بحجم أقل منميكرومتر 1,2. يتم تطبيق البلورات على شبكات المجهر الإلكتروني القياسي (TEM) ويتم تجميدها إما عن طريق الغطس في الإيثان السائل أو النيتروجين السائل. ثم يتم تحميل الشبكات في TEM تعمل في درجات حرارة مبردة. توجد البلورات على الشبكة ويتم فحصها للتأكد من جودة الحيود الأولية. الدوران المستمر يتم جمع بيانات MicroED من مجموعة فرعية من البلورات التي تم فحصها ، حيث يتم حفظ البيانات باستخدام كاميرا سريعة كفيلم3. يتم تحويل هذه الأفلام إلى تنسيق بلوري قياسي ومعالجتها بشكل متطابق تقريبا كتجربة علم البلورات بالأشعة السينية4.
تم تطوير MicroED في الأصل للتحقيق في بلورات البروتينالدقيقة 1,2. يؤدي عنق الزجاجة في علم بلورات البروتين إلى نمو بلورات كبيرة ومرتبة جيدا لتجارب حيود الأشعة السينية السنكروترونية التقليدية. نظرا لأن الإلكترونات تتفاعل مع أوامر المادة ذات الحجم الأقوى من الأشعة السينية ، فإن قيود حجم البلورة اللازمة لإنتاج حيود يمكن اكتشافه أصغر بكثير5. بالإضافة إلى ذلك ، فإن نسبة أحداث التشتت المرنة إلى غير المرنة أكثر ملاءمة للإلكترونات ، مما يشير إلى أنه يمكن جمع المزيد من البيانات المفيدة مع تعرض إجمالي أصغر5. سمحت التطورات المستمرة بجمع بيانات MicroED من البلورات الدقيقةالأكثر تحديا 6،7،8،9.
في الآونة الأخيرة ، ثبت أن MicroED أداة قوية لتحديد هياكل المستحضرات الصيدلانية ذات الجزيئات الصغيرة من المواد غير المتبلورة على ما يبدو10،11،12،13. يمكن أن تأتي هذه المساحيق مباشرة من زجاجة كاشف تم شراؤها ، أو عمود تنقية ، أو حتى من سحق حبوب منع الحمل إلى مسحوق ناعم10. تبدو هذه المساحيق غير متبلورة بالعين ، ولكنها قد تكون إما مكونة بالكامل من بلورات نانوية أو تحتوي فقط على كميات ضئيلة من الرواسب البلورية النانوية في جزء غير بلوري غير متبلور أكبر. يعد تطبيق المادة على الشبكة أمرا سهلا ، وقد تكون الخطوات اللاحقة لتحديد الكريستال والغربلة وجمع البيانات مؤتمتة في المستقبلالقريب 14. في حين أن البعض الآخر قد يستخدم طرقا مختلفة لإعداد العينات وجمع البيانات ، هنا يتم تفصيل البروتوكولات التي تم تطويرها واستخدامها في مختبر Gonen لإعداد عينات من الجزيئات الصغيرة ل MicroED ولجمع البيانات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td>Any vial or tube will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid clips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid C-rings</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbamazapine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4024-1G</td>
			<td>Any amount will suffice for these experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS based detector</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>CetaD 16M</td>
			<td>We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delphi software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU-D software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Commercial software for the acquisition of MicroED data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slides</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharger</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High PrecisionTweezers</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78325-AC</td>
			<td>Any high precision tweezer will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen vessel</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-800</td>
			<td>A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM software</td>
			<td>UC Boulder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Quantifoil/EMS</td>
			<td>Q310CMA</td>
			<td>Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transmission electron microscope (TEM)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman circular filter paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>90mm or larger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microcrystal electron diffraction of small molecules

تم وصف بروتوكول مفصل لإعداد عينات الجزيئات الصغيرة لتجارب حيود الإلكترون البلوري الدقيق (MicroED). تم تطوير MicroED لحل هياكل البروتينات والجزيئات الصغيرة باستخدام معدات الفحص المجهري الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM) القياسية. بهذه الطريقة ، تم مؤخرا تحديد الجزيئات الصغيرة والببتيدات والبروتينات القابلة للذوبان والبروتينات الغشائية بدقة عالية. يتم تقديم البروتوكولات هنا لإعداد شبكات من المستحضرات الصيدلانية ذات الجزيئات الصغيرة باستخدام عقار كاربامازيبين كمثال. يتم تقديم بروتوكولات لفحص وجمع البيانات. يتم تقديم خطوات إضافية في العملية الشاملة ، مثل تكامل البيانات وتحديد الهيكل والتحسين في مكان آخر. يقدر الوقت اللازم لإعداد شبكات الجزيئات الصغيرة بأقل من 30 دقيقة.

MicroED هي طريقة cryoEM تستفيد من التفاعلات القوية بين الإلكترونات والمادة ، والتي تسمح بالتحقيق في البلورات الصغيرة المتلاشية12,13. بعد هذه الخطوات ، من المتوقع أن يكون هناك فيلم حيود بتنسيق بلوري تم جمعه من البلورات الدقيقة (الفيلم 1). هنا ، يتم عرض التقني...

Watch this Scientific Journal Video about Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules at JoVE.com

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

هنا ، نصف الإجراءات التي تم تطويرها في مختبرنا لإعداد مساحيق بلورات الجزيئات الصغيرة لتجارب حيود الإلكترون البلوري الدقيق (MicroED).

حيود الإلكترون الجهورالوفولفي للجزيئات الصغيرة

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

في هذا الإجراء ، نوضح كيفية الانتقال من مسحوق جزيء صغير إلى بنية ثلاثية الأبعاد في دقائق. هذه تقنية تحويلية لمجتمع الكيمياء. العديد من المركبات لا تنمو بسهولة إلى بلورات كبيرة.باستخدام MicroED ، يمكننا تحديد هياكل الدقة الذرية من بلورات بحجم النانومتر. سيوضح الإجراء الدكتور مايك مارتينوفيتش وهو أستاذ في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس. للبدء ، انقل كمية صغيرة من المسحوق أو السائل أو المواد الصلبة إلى قنينة أو أنبوب صغير.بالنسبة للعينات الموجودة بالفعل في شكل مسحوق ، أغلق الأنبوب باستخدام الغطاء حتى تكون هناك حاجة إلى العينة. وبالمثل ، جفف العينات السائلة إلى مساحيق. لف الفيلم البلاستيكي حول أحد طرفي شريحة الغطاء الزجاجي.ضع شبكات TEM على الفيلم أعلى شريحة الغطاء مع توجيه جانب الكربون باللون البني لأعلى. بعد ذلك ، ضع الشريحة مع شبكات في غرفة تفريغ التوهج وقم بتفريغ شريحة الغطاء المتوهجة لمدة 30 ثانية تقريبا باستخدام الإعداد السلبي عند 15 بيكوأمبير. قم بتخزين الشبكات على شريحة الغطاء داخل طبق بتري زجاجي مبطن بورق ترشيح قبل إضافة العينة إلى الشبكات.قم بإزالة شبكة TEM ذات التفريغ المتوهج من طبق بتري المغطى باستخدام ملاقط وضعها على ورق ترشيح دائري بحيث يكون جانب الكربون متجها لأعلى. باستخدام ملعقة صغيرة ، قم بإزالة مغرفة صغيرة جدا من المسحوق وضعها على غطاء زجاجي مربع صغير بجوار شبكة TEM على ورق الترشيح. ضع شريحة زجاجية مربعة صغيرة أخرى أو غطاء فوق المسحوق.بالأصابع ، افرك الشريحتين الزجاجيتين معا برفق لعمل مسحوق ناعم. قم بزاوية انزلاق الغطاء وضعه فوق شبكة TEM مباشرة على ورق الترشيح واستمر في فرك انزلاقات الغطاء معا على بعد بضعة سنتيمترات فقط فوق شبكة TEM التي تم تفريغها من التوهج. لاحظ ما إذا كان المسحوق يسقط باتجاه الشبكة.اكشف المسحوق المطحون ناعما عن طريق إزالة إحدى زلات الغطاء الزجاجي. ثم قم بتنظيف المسحوق الناعم برفق من الغطاء على شبكة TEM باستخدام قطعة من ورق الترشيح. أمسك بحافة شبكة TEM باستخدام مجموعة محددة من الملقط ، مع التأكد من أن الأطراف لا تثقب أيا من مربعات الشبكة.ارفع الشبكة من سنتيمتر إلى سنتيمترين فوق ورق الترشيح وقم بزاوية الشبكة بزاوية 90 درجة إلى الورق أدناه. اضغط برفق على الملقط مع الحفاظ على الشبكة منتفخة بإحكام لإزالة أي مسحوق سائب. قم بتجميد الشبكة عن طريق تحريك طرف الملقط مع الشبكة مباشرة في حاوية النيتروجين السائل باليد وانتظر حتى تتوقف الشبكة والملاقط عن الغليان.تحت النيتروجين السائل ، ضع الشبكة في حامل العينة مع توجيه جانب الكربون بحيث تصطدم العينة بالشعاع قبل فيلم دعم الكربون. قم بتحميل حامل العينة في TEM للتأكد من أن الشبكة يتم الاحتفاظ بها دائما في درجات حرارة النيتروجين السائل. بالنسبة لأنظمة اللودر التلقائي ، ضع الشبكات المقطوعة في كاسيت في حاوية مبردة بالنيتروجين السائل ، مما يسمح لروبوتات اللودر التلقائي بقبول الكاسيت مع الحفاظ على العينات آمنة للتنقل بين اللودر التلقائي والعمود.افتح صمامات العمود TEM واضبط التكبير باستخدام لوحات اليد إلى أدنى تكبير ممكن. ابحث عن الشعاع عن طريق ضبط مقبض الشدة على الألواح اليدوية بحيث تكون المنطقة الساطعة المستديرة مرئية على شاشة الفلورسنت. خذ أطلس الشبكة بالكامل بتكبير منخفض باستخدام برنامج مناسب يضمن محاذاة المجهر جيدا لكل من تصوير التكبير المنخفض والعالي قبل جمع بيانات MicroED عالية الدقة.حدد مربعات الشبكة بدون الكربون المكسور والحبيبات السوداء أو الداكنة المرئية على الفيلم. تنقل حول الشبكة إما فعليا باستخدام عصا التحكم الموجودة على الألواح اليدوية أو فعليا على الأطلس الذي تم جمعه للبحث عن مربعات الشبكة غير المكسورة والتي تحتوي على بلورات دقيقة. أضف مركز كل من هذه المربعات إلى قائمة مواقع الشبكة للتحقيق ، والتي يمكن إضافتها إلى دفتر ملاحظات في واجهة مستخدم المجهر أو في برنامج أتمتة المجهر.اضبط التكبير بين 500 إلى 1300x. اضبط الارتفاع المركزي في كل موقع شبكة مخزن وقم بتحديث قيمة z المحفوظة إلى المواضع المذكورة. ابحث إما على شاشة الفلورسنت أو على كاميرا مسطحة عن البقع السوداء الصغيرة أو الحبوب على الشبكة.غالبا ما يكون للعينة الجيدة حواف حادة عند التكبير العالي مما يشير إلى وجود بلورة بالترتيب. انقل بلورة محتملة موجودة إلى وسط الشاشة وقم بزيادة التكبير بحيث يدخل TEM في وضع التكبير العالي. أدخل فتحة منطقة محددة وقم بتغيير فتحة العدسة إلى حجم أكبر أو أصغر للتأكد من أن المساحة المحددة أكبر من البلورة.قم بالتبديل إلى وضع الانكسار عن طريق الضغط على زر الانكسار على لوحات يد TEM للتأكد من إدخال شاشة الفلورسنت. اضبط طول الكاميرا باستخدام مقبض التكبير بحيث تكون الحافة بدقة أنجستروم واحدة على الأقل. اضبط تركيز الحيود بحيث تكون البقعة المركزية حادة وصغيرة قدر الإمكان.باستخدام مقابض إزاحة الحيود ، انقل الشعاع المركزي إلى مركز شاشة الفلورسنت. أدخل توقف الشعاع للتأكد من أن الشعاع خلفه. ارفع شاشة الفلورسنت والتقط تعريضا ضوئيا قصيرا للكاميرا.افحص نمط الانكسار المقابل ، وتأكد من أن النموذج سيحتوي على بقع حادة يتم ترتيبها بانتظام في أعمدة وصفوف. احفظ الإحداثيات البلورية إما في واجهة مستخدم TEM أو عن طريق كتابتها ، ثم كرر فحص الحيود لجميع البلورات المحتملة ذات الأهمية في مربع الشبكة الحالي. قم بتوسيط البلورة التي تم فحصها بتكبير أكبر من 1000x واضبط الارتفاع المركزي للبلورة باستخدام روتين تلقائي أو يدويا.أدخل فتحة المنطقة المحددة التي تناسب حجم الكريستال وشكله على أفضل وجه. قم بإمالة المرحلة في الاتجاهين السلبي والموجب حتى يتم حجب الصورة بواسطة أشرطة الشبكة. ولاحظ هذه الزوايا لأغراض جمع البيانات من خلال قراءة البيانات كل ثانية واحدة على كاميرا حديثة مع وضع قراءة الغالق المتداول.اضبط معدل الدوران عن طريق تحديد النسبة المئوية لسرعة الإمالة القصوى ومتى تتوقف في واجهة مستخدم المجهر أو البرنامج المخصص. حفظ البيانات في مجموعة متنوعة من التنسيقات يقول إما إطارات فردية أو ككومة من الصور. يظهر فيلم الانكسار في شكل بلوري تم جمعه من بلورات دقيقة مجموعة بيانات MicroED ذات دوران مستمر من بلورة صغيرة كاربامازيبين محددة على شبكة TEM.بعد جمع البيانات والتكامل وحل الهيكل ، يتم تحديد بنية عالية الدقة ويعتمد وضوحها على جودة البيانات واكتمالها. يعد تطبيق العينة على الشبكة أمرا بالغ الأهمية للحصول على بيانات جيدة. باتباع هذه الطريقة ، يمكن معالجة البيانات بشكل أكبر باستخدام برنامج البلورات القياسي.إن إثبات أن MicroED هي طريقة قوية للجزيئات الصغيرة قد فتح استخدامها في جميع أنحاء العالم لحل هياكل جديدة من الجزيئات ذات الأهمية الحاسمة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

الجريزوفولفوغرافيا من بلورات البروتين و<em&gt; في سيليولو</em&gt; الانعراج

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

بيوبانينج شبه الآلي المكتبات عرض البكتيريا الببتيد تقارب كاشف اكتشاف وتحليل يعزل الناتجة

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

التقاط حركية التفاعل البروتين قناة أيون مع جزيئات صغيرة بمقايسة التداخلي بيو-طبقة

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

تحليل للتشوهات التي يسببها بيتا-اميلويد فيبرينوجين جلطة هيكل بالتحليل الطيفي، وفحص المجهر الإلكتروني

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

مجهريتتبع جزيء واحد - أداة لتحديد الدول المنافية للجزيئات الخلوية

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

تحضير الصفائح من العينات البيولوجية الزجاجية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ثنائي الحزمة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

شبكات المجهر الإلكتروني للإرسال بالنمط المجهري لتحديد مواقع الخلايا مباشرة ضمن سير عمل التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون للخلية الكاملة

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...