Name: microcrystal electron diffraction of small molecules
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules at JoVE.com

Gonen-laboratoriet støttes af midler fra Howard Hughes Medical Institute. Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health P41GM136508.

1. Forberedelse af prøver af små molekyler
<ol><li>Overfør en lille mængde (0,01 - 1 mg) pulver, væske eller faste stoffer til et lille hætteglas eller rør.</li>
	<li>For prøver, der allerede er i pulverform, forsegles røret med hætten, indtil prøven skal bruges. Væskeprøverne tørres i pulvere forud for forsøg på metode 1 (trin 3) eller 2 (trin 4). BEMÆRK: Prøver opløst i væske kan anvende metode 3 (5.X) nedenfor</li>
</ol>2. Forberedelse af TEM-net
<p class="jove_conten...

<ol>
	<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345 (2013).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED.">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li><li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector.">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li><li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+and+processing.">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP.">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109 (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size.">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking.">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel.">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li><li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination.">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li><li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation.">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li><li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-&#229;ngstr&#246;m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp.">Sub-&#229;ngstr&#246;m cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li><li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products.">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li><li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+with+SerialEM.">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS:+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED.">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li><li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography.">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+catalase+determined+by+MicroED.">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600 (2014).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED.">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li></ol>

Prøveforberedelse er typisk en iterativ proces, hvor optimeringer foretages efter sessioner med screening og dataindsamling. For prøver med små molekyler er det ofte klogt først at forsøge gitterforberedelse uden glødafladning af gitterene, da mange lægemidler har tendens til at være hydrofobe10,11. Hvis nettene har for få nanokrystallinske aflejringer, er det en god idé at prøve igen efter første lysafladning af nettene. Det kan være tilfældet, at ...

Mikrokrystalelektrondiffraktion (MicroED) er en elektronkryomikroskopi (cryo-EM) metode til bestemmelse af atomopløsningsstrukturer fra krystalleri submikrometerstørrelse 1,2. Krystaller påføres standard transmissionselektronmikroskop (TEM) gitter og fryses ved enten at kaste sig ned i flydende ethan eller flydende nitrogen. Gitre indlæses derefter i en TEM, der arbejder ved kryogene temperaturer. Krystaller er placeret på gitteret og screenet for indledende diffraktionskvalitet. Kontinuerlig rotation MicroED-data indsamles fra en delmængde af de screenede krystaller, hvor dataene gemmes ved hjælp af et hurtigt kamera som en film3. Disse film konverteres til et standard krystallografisk format og behandles næsten identisk som et røntgenkrystallografieksperiment4.
MicroED blev oprindeligt udviklet til at undersøge proteinmikrokrystaller 1,2. En flaskehals i proteinkrystallografi vokser store, velordnede krystaller til traditionelle synkrotron røntgendiffraktionseksperimenter. Da elektroner interagerer med stofstørrelsesordener stærkere end røntgenstråler, er begrænsningerne af krystalstørrelsen, der er nødvendige for at producere detekterbar diffraktion, betydeligt mindre5. Derudover er forholdet mellem elastiske og uelastiske spredningshændelser mere gunstigt for elektroner, hvilket tyder på, at mere nyttige data kan indsamles med en mindre samlet eksponering5. Konstant udvikling har gjort det muligt at indsamle MicroED-data fra de mest udfordrende mikrokrystaller 6,7,8,9.
For nylig har MicroED vist sig at være et kraftfuldt værktøj til bestemmelse af strukturerne af lægemidler med små molekyler fra tilsyneladende amorfe materialer10,11,12,13. Disse pulvere kan komme direkte fra en flaske købt reagens, en rensningskolonne eller endda fra at knuse en pille til et fint pulver10. Disse pulvere forekommer amorfe med øjet, men kan enten være helt sammensat af nanokrystaller eller blot indeholde spormængder af nanokrystallinske aflejringer i en større ikke-krystallinsk, amorf fraktion. Anvendelse af materialet på gitteret er let, og de efterfølgende trin med krystalidentifikation, screening og dataindsamling kan endda automatiseres i den nærmeste fremtid14. Mens andre kan bruge forskellige metoder til prøveforberedelse og dataindsamling, er de protokoller, der er udviklet og anvendt i Gonen-laboratoriet til forberedelse af prøver af små molekyler til MicroED og til dataindsamling, detaljeret.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td>Any vial or tube will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid clips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid C-rings</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbamazapine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4024-1G</td>
			<td>Any amount will suffice for these experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS based detector</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>CetaD 16M</td>
			<td>We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delphi software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU-D software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Commercial software for the acquisition of MicroED data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slides</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharger</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High PrecisionTweezers</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78325-AC</td>
			<td>Any high precision tweezer will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen vessel</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-800</td>
			<td>A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM software</td>
			<td>UC Boulder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Quantifoil/EMS</td>
			<td>Q310CMA</td>
			<td>Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transmission electron microscope (TEM)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman circular filter paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>90mm or larger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microcrystal electron diffraction of small molecules

En detaljeret protokol til fremstilling af små molekyleprøver til mikrokrystalelektrondiffraktion (MicroED) eksperimenter er beskrevet. MicroED er udviklet til at løse strukturer af proteiner og små molekyler ved hjælp af standard elektronkryomikroskopi (cryo-EM) udstyr. På denne måde er små molekyler, peptider, opløselige proteiner og membranproteiner for nylig blevet bestemt til høje opløsninger. Protokoller præsenteres her til fremstilling af gitter af småmolekylære lægemidler ved hjælp af lægemidlet carbamazepin som et eksempel. Protokoller til screening og indsamling af data præsenteres. Yderligere trin i den overordnede proces, såsom dataintegration, strukturbestemmelse og forfining, præsenteres andetsteds. Den tid, det tager at forberede de små molekyler, anslås at være mindre end 30 min.

MicroED er en cryoEM-metode, der udnytter de stærke interaktioner mellem elektroner og stof, hvilket gør det muligt at undersøge forsvindende små krystaller12,13. Efter disse trin forventes det at have en diffraktionsfilm i krystallografisk format indsamlet fra mikrokrystaller (film 1). Her demonstreres teknikken ved anvendelse af carbamazepin12. Resultaterne viser et kontinuerligt rotationsmikroED-datasæt fra en carb...

Watch this Scientific Journal Video about Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules at JoVE.com

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Her beskriver vi de procedurer, der er udviklet i vores laboratorium til fremstilling af pulvere af små molekylekrystaller til mikrokrystalelektrondiffraktion (MicroED) eksperimenter.

Mikrokrystalelektrondiffraktion af små molekyler

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

I denne procedure viser vi, hvordan man går videre fra et lille molekylepulver til en tredimensionel struktur på få minutter. Dette er en transformativ teknik for kemisamfundet. Mange forbindelser vokser ikke let til store krystaller.Med MicroED, kan vi bestemme atomopløsningsstrukturer ud fra nanometer størrelse krystaller. Demonstrerer proceduren vil være Dr.Mike Martynowycz, som er professor ved UCLA. Til at begynde med skal du overføre en lille mængde pulver, væske eller faste stoffer til et lille hætteglas eller rør.For prøver, der allerede er i pulverform, forsegles røret med hætten, indtil prøven skal bruges. På samme måde tørres væskeprøverne i pulvere. Sæt plastfilm rundt om den ene ende af et glasdæksel.Placer TEM-gitterene på filmen oven på dækselsglasset med den brune farve kulstofside opad. Placer derefter objektglasset med gitre i glødeudladningskammeret, og glødaflad dækselskyderen i ca. 30 sekunder ved hjælp af den negative indstilling ved 15 picoampere. Opbevar ristene på dækselglasset inde i en petriskål af glas beklædt med filtrerpapir, inden prøven tilsættes ristene.Fjern glødeudladningsgitteret fra den overdækkede petriskål ved hjælp af pincet, og læg det på et cirkulært filterpapir med kulstofsiden opad. Brug en lille spatel til at fjerne en meget lille skefuld pulver og læg den på en lille firkantet glasdæksel lige ved siden af TEM-gitteret på filterpapiret. Placer et andet lille firkantet glasglas eller dæksel oven på pulveret.Med fingrene gnides forsigtigt de to glasglider sammen for at lave et fint pulver. Vinkl dækselgliderne, og placer dem lige over TEM-gitteret på filterpapiret, og fortsæt med at gnide dækselgliderne sammen kun få centimeter over det glødafladede TEM-gitter. Overhold om pulveret falder mod gitteret.Afdæk det fintmalede pulver ved at fjerne en af de to glasdækselsedler. Børst derefter forsigtigt det fine pulver af dækslet på TEM-gitteret ved hjælp af et stykke filterpapir. Tag fat i kanten af TEM-gitteret ved hjælp af et sæt pincetter, og sørg for, at spidserne ikke punkterer nogen af gitterfirkanterne.Løft gitteret en til to centimeter over filterpapiret, og vinkl gitteret 90 grader i forhold til papiret nedenfor. Bank let på pincetten, mens du holder gitteret godt pincet for at fjerne løst pulver. Frys gitteret ved at flytte spidsen af pincetten med gitteret direkte ind i en flydende nitrogenbeholder med hånden, og vent, indtil gitteret og pincetten holder op med at koge.Under flydende nitrogen anbringes gitteret i prøveholderen med kulstofsiden orienteret, således at prøven rammes af strålen forud for kulstofstøttefilmen. Fyld prøveholderen i TEM, idet det sikres, at gitteret altid holdes ved flydende nitrogentemperaturer. For autoloader-systemer skal du placere de klippede gitre i en kassette i en flydende nitrogenkølet beholder, som gør det muligt for auto loader-robotteknologien at acceptere kassetten, samtidig med at prøverne holdes sikre til skift mellem autolæsseren og søjlen.Åbn TEM-søjleventilerne, og juster forstørrelsen ved hjælp af håndpanelerne til den lavest mulige forstørrelse. Find strålen ved at justere intensitetsknappen på håndpanelerne, så et rundt, lyst område er synligt på den fluorescerende skærm. Tag et atlas over hele gitteret ved lav forstørrelse ved hjælp af passende software, der sikrer, at mikroskopet er godt justeret til både lav og høj forstørrelse, inden der indsamles MicroED-data med høj opløsning.Identificer gitterfirkanter uden brudt kulstof og synlige sorte eller mørke korn på filmen. Naviger rundt i gitteret enten fysisk ved hjælp af joysticket på håndpanelerne eller virtuelt på det indsamlede atlas for at søge efter gitterfirkanter, der ikke er brudt og indeholder mikrokrystaller. Tilføj midten af hver af disse firkanter til en liste over gitterplaceringer til undersøgelse, som kan føjes til en notesbog i mikroskopets brugergrænseflade eller i mikroskopautomatiseringssoftwaren.Indstil forstørrelsen mellem 500 og 1300x. Juster den centrerede højde på hver gemt gitterplacering, og opdater den gemte z-værdi til de noterede positioner. Søg enten på den fluorescerende skærm eller på et fladt kamera efter små sorte pletter eller korn på gitteret.En god prøve vil ofte have skarpe kanter ved høj forstørrelse, hvilket tyder på krystal i rækkefølge. Flyt en placeret potentiel krystal til midten af skærmen, og øg forstørrelsen, så TEM går i høj forstørrelsestilstand. Indsæt et markeret områdeblænde, og skift blænden til en større eller mindre størrelse for at sikre, at det markerede område er større end krystallen.Skift til brydningstilstand ved at trykke på brydningsknappen på TEM-håndpanelerne og sikre, at den fluorescerende skærm er indsat. Juster kameralængden ved hjælp af forstørrelsesknappen, så kanten er mindst én angstromopløsning. Juster diffraktionsfokus, så det centrale punkt er så skarpt og lille som muligt.Brug diffraktionsskifteknapperne til at flytte den centrale stråle til midten af den fluorescerende skærm. Indsæt strålestoppet, og sørg for, at bjælken er bag det. Løft den fluorescerende skærm, og tag en kort eksponering på kameraet.Undersøg det tilsvarende brydningsmønster, og sørg for, at mønsteret har skarpe pletter, der regelmæssigt arrangeres i kolonner og rækker. Gem krystalkoordinaterne i enten TEM-brugergrænsefladen eller ved at skrive dem ned, og gentag derefter diffraktionsscreening for alle potentielle krystaller af interesse på det aktuelle gitterkvadrat. Centrer den screenede krystal ved en forstørrelse større end 1000x og juster krystallens centrerede højde ved hjælp af enten en automatisk rutine eller manuelt.Indsæt den markerede områdeblænde, der passer bedst til krystalstørrelsen og -formen. Vip scenen i de negative og positive retninger, indtil billedet er blokeret af gitterbjælkerne. Og bemærk disse vinkler til dataindsamlingsformål ved at læse dataene ud hvert sekund på et moderne kamera med en rullende lukkerudlæsningstilstand.Indstil rotationshastigheden ved at angive procentdelen af den maksimale hældningshastighed, og hvornår du skal stoppe i mikroskopets brugergrænseflade eller dedikeret software. Gem dataene i en række forskellige formater, siger enten individuelle rammer eller som en stak billeder. En brydningsfilm i krystallografisk format indsamlet fra mikrokrystaller viser et kontinuerligt rotationsmikroED-datasæt fra en carbamazepinmikrokrystal identificeret på et TEM-gitter.Efter dataindsamling, integration og strukturløsning bestemmes en struktur med høj opløsning, og dens klarhed afhænger af dataenes kvalitet og fuldstændighed. Anvendelse af prøven på gitteret er afgørende for at opnå gode data. Efter denne metode kan dataene behandles yderligere ved hjælp af standard krystallografisk software.At demonstrere, at MicroED er en kraftfuld metode til små molekyler, har åbnet sin anvendelse over hele verden til at løse nye strukturer af kritisk vigtige molekyler.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Mikrokrystallografi af proteinkrystaller og<em&gt; I Cellulo</em&gt; Diffraktion

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en Atomic Force mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatiske Biopanning af bakteriel Display biblioteker for peptid affinitet reagens opdagelse og analyse af resulterende isolater

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Indfange interaktion kinetik af en Ion-kanal Protein med små molekyler af Bio-lag interferometri Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse af β-Amyloid-induceret afvigelser Fibrin blodprop strukturen af spektroskopi og Scanning elektronmikroskopi

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Enkelt-molekyle tracking mikroskopi-et værktøj til bestemmelse af Difvøse tilstande af Cytosolic molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse af lameller fra glasagtige biologiske prøver ved hjælp af et dobbeltstrålescanningselektronmikroskop til kryo-elektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmission ElektronMikroskopiGitre til direkte cellepositionering i hele celle kryo-elektrontomografi arbejdsprocesser

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...