Name: microcrystal electron diffraction of small molecules
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules at JoVE.com

Het Gonen-lab wordt ondersteund door fondsen van het Howard Hughes Medical Institute. Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health P41GM136508.

1. Monsternemingen van kleine moleculen voorbereiden
<ol><li>Breng een kleine hoeveelheid (0,01 - 1 mg) poeder, vloeistof of vaste stoffen over in een kleine injectieflacon of buis.</li>
	<li>Voor monsters die al in poedervorm zijn, sluit u de buis af met de dop totdat het monster nodig is. Droog de vloeistofmonsters in poeders voordat u methode 1 (stap 3) of 2 (stap 4) probeert uit te voeren. OPMERKING: Monsters opgelost in vloeistof kunnen methode 3 (5.X) hieronder gebruiken</li>
</ol>2. TEM-...

<ol>
	<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345 (2013).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED.">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li><li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector.">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li><li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+and+processing.">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP.">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109 (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size.">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking.">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel.">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li><li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination.">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li><li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation.">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li><li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-&#229;ngstr&#246;m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp.">Sub-&#229;ngstr&#246;m cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li><li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products.">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li><li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+with+SerialEM.">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS:+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED.">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li><li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography.">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+catalase+determined+by+MicroED.">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600 (2014).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED.">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li></ol>

Monstervoorbereiding is meestal een iteratief proces, waarbij optimalisaties worden gemaakt na sessies van screening en gegevensverzameling. Voor monsters met kleine moleculen is het vaak verstandig om eerst te proberen het raster te bereiden zonder de roosters te ontladen, omdat veel geneesmiddelen de neiging hebben hydrofoobte zijn 10,11. Als de roosters te weinig nanokristallijne afzettingen hebben, is het een goed idee om het opnieuw te proberen nadat de roos...

Microcrystal electron diffraction (MicroED) is een elektron cryo-microscopie (cryo-EM) methode voor het bepalen van atomaire resolutie structuren van sub-micrometer grootte kristallen 1,2. Kristallen worden aangebracht op standaard transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) -roosters en bevroren door zich in vloeibaar ethaan of vloeibare stikstof te storten. Roosters worden vervolgens geladen in een TEM die werkt bij cryogene temperaturen. Kristallen bevinden zich op het rooster en worden gescreend op initiële diffractiekwaliteit. MicroED-gegevens met continue rotatie worden verzameld uit een subset van de gescreende kristallen, waarbij de gegevens met een snelle camera worden opgeslagen als een film3. Deze films worden omgezet naar een standaard kristallografisch formaat en bijna identiek verwerkt als een röntgenkristallografie-experiment4.
MicroED is oorspronkelijk ontwikkeld om eiwitmicrokristallen 1,2 te onderzoeken. Een knelpunt in eiwitkristallografie is het kweken van grote, goed geordende kristallen voor traditionele synchrotron röntgendiffractie-experimenten. Omdat elektronen interageren met materieordes van grootte die sterker zijn dan röntgenstralen, zijn de beperkingen van de kristalgrootte die nodig is om detecteerbare diffractie te produceren aanzienlijk kleiner5. Bovendien is de verhouding tussen elastische en inelastische verstrooiingsgebeurtenissen gunstiger voor elektronen, wat suggereert dat meer bruikbare gegevens kunnen worden verzameld met een kleinere totale blootstelling5. Constante ontwikkelingen hebben het mogelijk gemaakt om MicroED-gegevens te verzamelen van de meest uitdagende microkristallen 6,7,8,9.
Onlangs is aangetoond dat MicroED een krachtig hulpmiddel is voor het bepalen van de structuren van geneesmiddelen met kleine moleculen uit schijnbaar amorfe materialen10,11,12,13. Deze poeders kunnen rechtstreeks uit een fles gekocht reagens, een zuiveringskolom of zelfs uit het verpletteren van een pil tot een fijn poederkomen 10. Deze poeders lijken amorf met het oog, maar kunnen volledig zijn samengesteld uit nanokristallen of slechts sporenhoeveelheden nanokristallijne afzettingen bevatten in een grotere niet-kristallijne, amorfe fractie. Het aanbrengen van het materiaal op het raster is eenvoudig en de volgende stappen van kristalidentificatie, screening en gegevensverzameling kunnen in de nabije toekomst zelfs worden geautomatiseerd14. Terwijl anderen verschillende methoden kunnen gebruiken voor monstervoorbereiding en gegevensverzameling, zijn hier de protocollen die zijn ontwikkeld en gebruikt in het Gonen-laboratorium voor het voorbereiden van monsters van kleine moleculen voor MicroED en voor gegevensverzameling gedetailleerd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td>Any vial or tube will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid clips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid C-rings</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbamazapine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4024-1G</td>
			<td>Any amount will suffice for these experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS based detector</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>CetaD 16M</td>
			<td>We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delphi software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU-D software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Commercial software for the acquisition of MicroED data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slides</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharger</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High PrecisionTweezers</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78325-AC</td>
			<td>Any high precision tweezer will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen vessel</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-800</td>
			<td>A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM software</td>
			<td>UC Boulder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Quantifoil/EMS</td>
			<td>Q310CMA</td>
			<td>Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transmission electron microscope (TEM)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman circular filter paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>90mm or larger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microcrystal electron diffraction of small molecules

Een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van kleine molecuulmonsters voor microkristalelektronendiffractie (MicroED) experimenten wordt beschreven. MicroED is ontwikkeld om structuren van eiwitten en kleine moleculen op te lossen met behulp van standaard elektronen cryo-microscopie (cryo-EM) apparatuur. Op deze manier zijn kleine moleculen, peptiden, oplosbare eiwitten en membraaneiwitten onlangs bepaald tot hoge resoluties. Protocollen worden hier gepresenteerd voor het voorbereiden van rasters van geneesmiddelen met kleine moleculen met behulp van het medicijn carbamazepine als voorbeeld. Protocollen voor het screenen en verzamelen van gegevens worden gepresenteerd. Aanvullende stappen in het totale proces, zoals data-integratie, structuurbepaling en verfijning, worden elders gepresenteerd. De tijd die nodig is om de rasters met kleine moleculen voor te bereiden, wordt geschat op minder dan 30 minuten.

MicroED is een cryoEM-methode die gebruik maakt van de sterke interacties tussen elektronen en materie, waardoor het onderzoek van verdwijnend kleine kristallen12,13 mogelijk is. Na deze stappen wordt verwacht dat het een diffractiefilm in kristallografisch formaat heeft die is verzameld uit microkristallen (film 1). Hier wordt de techniek gedemonstreerd met carbamazepine12. De resultaten tonen een microED-dataset met cont...

Watch this Scientific Journal Video about Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules at JoVE.com

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Hier beschrijven we de procedures die in ons laboratorium zijn ontwikkeld voor het bereiden van poeders van kleine molecuulkristallen voor microkristalelektronendiffractie (MicroED) -experimenten.

Microkristal elektronendiffractie van kleine moleculen

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

In deze procedure laten we zien hoe je in enkele minuten van een klein molecuulpoeder naar een driedimensionale structuur kunt gaan. Dit is een transformatieve techniek voor de chemiegemeenschap. Veel verbindingen groeien niet gemakkelijk uit tot grote kristallen.Met MicroED kunnen we atomaire resolutiestructuren bepalen uit kristallen van nanometergrootte. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Mike Martynowycz, die professor is aan de UCLA. Breng om te beginnen een kleine hoeveelheid poeder, vloeistof of vaste stoffen over in een kleine injectieflacon of buis.Voor monsters die al in poedervorm zijn, sluit u de buis af met de dop totdat het monster nodig is. Droog de vloeistofmonsters op dezelfde manier in poeders. Wikkel plastic folie rond het ene uiteinde van een glazen afdekplaat.Plaats de TEM-roosters op de folie bovenop de afdekplaat met de bruine kleur carbon naar boven gericht. Plaats vervolgens de dia met roosters in de gloeiontladingskamer en ontlaad de afdekplaat gedurende ongeveer 30 seconden met behulp van de negatieve instelling op 15 picoampères. Bewaar de roosters op de afdekplaat in een glazen petrischaal bekleed met filterpapier voordat u het monster aan de roosters toevoegt.Verwijder het TEM-rooster met gloeiafvoer van de afgedekte petrischaal met een pincet en plaats het op een cirkelvormig filterpapier met de koolstofzijde naar boven gericht. Verwijder met een kleine spatel een heel klein schepje poeder en plaats het op een kleine vierkante glazen afdekslip net naast het TEM-rooster op het filterpapier. Plaats nog een kleine vierkante glasplaat of afdekplaat bovenop het poeder.Wreef met de vingers de twee glasglaasjes zachtjes tegen elkaar om een fijn poeder te maken. Hoek de afdekslip en plaats ze net boven het TEM-raster op het filterpapier en blijf de afdekplaten slechts een paar centimeter boven het gloeiende TEM-rooster tegen elkaar wrijven. Kijk of het poeder naar het rooster valt.Ontdek het fijngemalen poeder door een van de twee glazen afdekplaten te verwijderen. Borstel vervolgens voorzichtig het fijne poeder van de afdekplaat op het TEM-rooster met behulp van een stuk filterpapier. Pak de rand van het TEM-raster vast met een pincet en zorg ervoor dat de uiteinden geen van de rastervierkanten doorboren.Til het raster één tot twee centimeter boven het filterpapier en hoek het raster 90 graden ten opzichte van het papier eronder. Tik zachtjes op het pincet terwijl u het rooster stevig getweezed houdt om los poeder te verwijderen. Bevries het rooster door de punt van het pincet met het rooster met de hand rechtstreeks in een container met vloeibare stikstof te verplaatsen en wacht tot het rooster en het pincet stoppen met koken.Plaats onder vloeibare stikstof het rooster in de monsterhouder met de koolstofzijde zodanig georiënteerd dat het monster vóór de koolstofsteunfilm door de bundel wordt geraakt. Laad de monsterhouder in de TEM en zorg ervoor dat het rooster altijd op vloeibare stikstoftemperaturen wordt gehouden. Voor automatische ladersystemen plaatst u de geknipte roosters in een cassette in een vloeistofstikstofgekoelde container, waardoor de robotica van de autolader de cassette kan accepteren terwijl de monsters veilig blijven voor shuttling tussen de autolader en de kolom.Open de TEM-kolomkleppen en pas de vergroting met behulp van de handpanelen aan op de laagst mogelijke vergroting. Zoek de bundel door de intensiteitsknop op de handpanelen zo aan te passen dat een rond helder gebied zichtbaar is op het fluorescerende scherm. Neem een all grid atlas bij lage vergroting met behulp van geschikte software die ervoor zorgt dat de microscoop goed is uitgelijnd voor zowel lage als hoge vergrotingsbeeldvorming voordat microED-gegevens met hoge resolutie worden verzameld.Identificeer rastervierkanten zonder gebroken koolstof en zichtbare zwarte of donkere korrels op de film. Navigeer door het raster fysiek met behulp van de joystick op de handpanelen of virtueel op de verzamelde atlas om te zoeken naar rastervierkanten die niet zijn gebroken en microkristallen bevatten. Voeg het midden van elk van deze vierkanten toe aan een lijst met rasterlocaties voor onderzoek, die kan worden toegevoegd aan een notitieboek in de gebruikersinterface van de microscoop of in de automatiseringssoftware van de microscoop.Stel de vergroting in tussen 500 en 1300x. Pas de centrale hoogte op elke opgeslagen rasterlocatie aan en werk de opgeslagen z-waarde bij naar de aangegeven posities. Zoek op het fluorescerende scherm of op een platte camera naar kleine zwarte vlekken of korrels op het raster.Een goed monster heeft vaak scherpe randen bij hoge vergroting die kristal in volgorde suggereren. Verplaats een geplaatst potentiaalkristal naar het midden van het scherm en verhoog de vergroting zodanig dat de TEM in de hoge vergrotingsmodus komt. Plaats een diafragma met een geselecteerd gebied en wijzig het diafragma in een groter of kleiner formaat om ervoor te zorgen dat het geselecteerde gebied groter is dan het kristal.Schakel over naar de defractioneringsmodus door op de defractionatieknop op de TEM-handpanelen te drukken om ervoor te zorgen dat het fluorescerende scherm wordt geplaatst. Pas de lengte van de camera aan met de vergrotingsknop, zodat de rand ten minste één resolutie heeft. Pas de diffractiefocus zo aan dat de centrale spot zo scherp en klein mogelijk is.Verplaats met behulp van de diffractie-pookknoppen de middenbundel naar het midden van het fluorescerende scherm. Plaats de balkstop en zorg ervoor dat de balk erachter zit. Til het fluorescerende scherm op en maak een korte belichting op de camera.Inspecteer het bijbehorende defractioneringspatroon en zorg ervoor dat het patroon scherpe vlekken heeft die regelmatig in kolommen en rijen zijn gerangschikt. Sla de kristalcoördinaten op in de TEM-gebruikersinterface of door ze op te schrijven en herhaal vervolgens diffractiescreening voor alle potentiële kristallen van belang op het huidige rastervierkant. Centreer het gescreende kristal met een vergroting groter dan 1000x en pas de centrale hoogte van het kristal aan met behulp van een automatische routine of met de hand.Voeg de geselecteerde diafragma in die het beste past bij de kristalgrootte en -vorm. Kantel het werkgebied in de negatieve en positieve richting totdat de afbeelding wordt afgesloten door de rasterbalken. En let op deze hoeken voor gegevensverzamelingsdoeleinden door de gegevens elke seconde uit te lezen op een moderne camera met een uitleesmodus voor rolluik.Stel de rotatiesnelheid in door het percentage van de maximale kantelsnelheid op te geven en wanneer te stoppen in de gebruikersinterface van de microscoop of speciale software. Sla de gegevens op in verschillende indelingen, zegt afzonderlijke frames of als een stapel afbeeldingen. Een defractionatiefilm in kristallografisch formaat verzameld uit microkristallen toont een microED-dataset met continue rotatie van een carbamazepine-microkristal geïdentificeerd op een TEM-raster.Na het verzamelen, integreren en structureren van gegevens wordt een structuur met hoge resolutie bepaald en hangt de duidelijkheid ervan af van de kwaliteit en volledigheid van de gegevens. Het toepassen van het voorbeeld op het raster is van cruciaal belang voor het verkrijgen van goede gegevens. Volgens deze methode kunnen de gegevens verder worden verwerkt met behulp van standaard kristallografische software.Door aan te tonen dat MicroED een krachtige methode is voor kleine moleculen, is het gebruik ervan wereldwijd geopend voor het oplossen van nieuwe structuren van kritisch belangrijke moleculen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microkristallografie van eiwitkristallen en<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffractie

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatische Biopanning van bacteriële Display bibliotheken voor Peptide affiniteit reagens detectie en analyse van de resulterende isolaten

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de Bio-laag interferometrie Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse van β-Amyloid-geïnduceerde afwijkingen op fibrine Clot structuur door spectroscopie en Scanning elektronen microscopie

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule tracking microscopie-een hulpmiddel voor het bepalen van de Diffusieve toestanden van cytosolische moleculen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmissie ElektronenMicroscopie Grids naar Direct Cell Positioning binnen Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...