Name: microcrystal electron diffraction of small molecules
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00
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Le laboratoire Gonen est soutenu par des fonds du Howard Hughes Medical Institute. Cette étude a été soutenue par les National Institutes of Health P41GM136508.

1. Préparation d’échantillons de petites molécules
<ol><li>Transférer une petite quantité (0,01 à 1 mg) de poudre, de liquide ou de solides dans un petit flacon ou un tube.</li>
	<li>Pour les échantillons déjà sous forme de poudre, scellez le tube à l’aide du bouchon jusqu’à ce que l’échantillon soit nécessaire. Sécher les échantillons liquides en poudres avant de tenter la méthode 1 (étape 3) ou 2 (étape 4). NOTA: Les échantillons dissous dans un liquide peuvent utiliser la méthode 3 (5....

<ol>
	<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345 (2013).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED.">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li><li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector.">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li><li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+and+processing.">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP.">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109 (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size.">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking.">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel.">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li><li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination.">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li><li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation.">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li><li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-&#229;ngstr&#246;m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp.">Sub-&#229;ngstr&#246;m cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li><li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products.">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li><li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+with+SerialEM.">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS:+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED.">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li><li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography.">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+catalase+determined+by+MicroED.">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600 (2014).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED.">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li></ol>

La préparation des échantillons est généralement un processus itératif, où des optimisations sont effectuées après des séances de dépistage et de collecte de données. Pour les échantillons de petites molécules, il est souvent prudent de tenter d’abord la préparation de la grille sans décharge luminescente les grilles, car de nombreux produits pharmaceutiques ont tendance à être hydrophobes10,11. Si les grilles ont trop peu de dépôts nanocrist...

La diffraction électronique microcristalline (MicroED) est une méthode de cryomicro-microscopie électronique (cryo-EM) pour déterminer les structures de résolution atomique à partir de cristaux de taille inférieureau micromètre 1,2. Les cristaux sont appliqués sur des grilles de microscope électronique à transmission standard (MET) et congelés en plongeant dans de l’éthane liquide ou de l’azote liquide. Les grilles sont ensuite chargées dans un TEM fonctionnant à des températures cryogéniques. Les cristaux sont situés sur la grille et criblés pour la qualité initiale de la diffraction. Les données MicroED à rotation continue sont collectées à partir d’un sous-ensemble des cristaux filtrés, où les données sont enregistrées à l’aide d’une caméra rapide comme film3. Ces films sont convertis en un format cristallographique standard et traités presque à l’identique comme une expérience de cristallographie aux rayons X4.
MicroED a été développé à l’origine pour étudier les microcristaux de protéines 1,2. Un goulot d’étranglement dans la cristallographie des protéines fait pousser de gros cristaux bien ordonnés pour les expériences traditionnelles de diffraction des rayons X synchrotron. Comme les électrons interagissent avec des ordres de grandeur de matière plus forts que les rayons X, les limites de la taille des cristaux nécessaires pour produire une diffraction détectable sont considérablement plus petites5. De plus, le rapport entre les événements de diffusion élastiques et inélastiques est plus favorable pour les électrons, ce qui suggère que des données plus utiles peuvent être collectées avec une exposition globale plus faible5. Des développements constants ont permis de recueillir des données MicroED à partir des microcristaux les plus difficiles 6,7,8,9.
Récemment, MicroED s’est avéré être un outil puissant pour déterminer les structures de produits pharmaceutiques à petites molécules à partir de matériaux apparemment amorphes10,11,12,13. Ces poudres peuvent provenir directement d’une bouteille de réactif acheté, d’une colonne de purification, ou même de l’écrasement d’une pilule en une poudre fine10. Ces poudres semblent amorphes à l’œil, mais peuvent être entièrement composées de nanocristaux ou simplement contenir des traces de dépôts nanocristallins dans une fraction amorphe non cristalline plus grande. L’application du matériau à la grille est facile, et les étapes ultérieures d’identification des cristaux, de criblage et de collecte de données pourraient même être automatisées dans un proche avenir14. Alors que d’autres peuvent utiliser des méthodes différentes pour la préparation des échantillons et la collecte de données, ici les protocoles développés et utilisés dans le laboratoire Gonen pour la préparation d’échantillons de petites molécules pour MicroED et pour la collecte de données sont détaillés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td>Any vial or tube will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid clips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid C-rings</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbamazapine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4024-1G</td>
			<td>Any amount will suffice for these experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS based detector</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>CetaD 16M</td>
			<td>We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delphi software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU-D software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Commercial software for the acquisition of MicroED data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slides</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharger</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High PrecisionTweezers</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78325-AC</td>
			<td>Any high precision tweezer will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen vessel</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-800</td>
			<td>A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM software</td>
			<td>UC Boulder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Quantifoil/EMS</td>
			<td>Q310CMA</td>
			<td>Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transmission electron microscope (TEM)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman circular filter paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>90mm or larger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microcrystal electron diffraction of small molecules

Un protocole détaillé pour la préparation d’échantillons de petites molécules pour les expériences de diffraction électronique microcristalline (MicroED) est décrit. MicroED a été développé pour résoudre des structures de protéines et de petites molécules à l’aide d’un équipement standard de cryomicroscopie électronique (cryo-EM). De cette façon, de petites molécules, des peptides, des protéines solubles et des protéines membranaires ont récemment été déterminés à des résolutions élevées. Les protocoles sont présentés ici pour la préparation de grilles de produits pharmaceutiques à petites molécules en utilisant le médicament carbamazépine comme exemple. Les protocoles de dépistage et de collecte des données sont présentés. Des étapes supplémentaires du processus global, telles que l’intégration des données, la détermination de la structure et le raffinement, sont présentées ailleurs. Le temps nécessaire à la préparation des grilles de petites molécules est estimé à moins de 30 min.

MicroED est une méthode cryoEM qui exploite les interactions fortes entre les électrons et la matière, ce qui permet d’étudier des cristaux de plus en plus petits12,13. Après ces étapes, on s’attend à ce qu’un film de diffraction en format cristallographique prélevé sur des microcristaux (film 1). Ici, la technique est démontrée à l’aide de carbamazépine12. Les résultats montrent un ensemble de donné...

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Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Nous décrivons ici les procédures développées dans notre laboratoire pour la préparation de poudres de cristaux de petites molécules pour des expériences de diffraction électronique microcristalline (MicroED).

Diffraction électronique microcristalline de petites molécules

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Dans cette procédure, nous montrons comment passer d’une poudre de petite molécule à une structure tridimensionnelle en quelques minutes. Il s’agit d’une technique transformatrice pour la communauté de la chimie. De nombreux composés ne se développent pas facilement en gros cristaux.Avec MicroED, nous pouvons déterminer des structures de résolution atomique à partir de cristaux de taille nanométrique. La démonstration de la procédure sera le Dr Mike Martynowycz, professeur à l’UCLA. Pour commencer, transférez une petite quantité de poudre, de liquide ou de solides dans un petit flacon ou un tube.Pour les échantillons déjà sous forme de poudre, scellez le tube à l’aide du bouchon jusqu’à ce que l’échantillon soit nécessaire. De même, sécher les échantillons liquides en poudres. Enroulez un film plastique autour d’une extrémité d’une lame de couvercle en verre.Placez les grilles TEM sur le film au-dessus de la diapositive de couverture avec le côté carbone de couleur marron vers le haut. Ensuite, placez la glissière avec des grilles dans la chambre de décharge luminescente et déchargez la lame de couvercle pendant environ 30 secondes en utilisant le réglage négatif à 15 picoampères. Rangez les grilles sur la lame de couverture dans une boîte de Petri en verre tapissée de papier filtre avant d’ajouter l’échantillon aux grilles.Retirez la grille TEM à décharge luminescente de la boîte de Petri couverte à l’aide d’une pince à épiler et placez-la sur un papier filtre circulaire avec le côté carbone vers le haut. À l’aide d’une petite spatule, retirez une très petite cuillère de poudre et placez-la sur un petit couvercle carré en verre juste à côté de la grille TEM sur le papier filtre. Placez une autre petite lame de verre carrée ou un couvercle sur la poudre.Avec les doigts, frottez doucement les deux lames de verre ensemble pour faire une poudre fine. Inclinez les lamelles de couverture et placez-les juste au-dessus de la grille TEM sur le papier filtre et continuez à frotter les lamelles de couverture ensemble à quelques centimètres au-dessus de la grille TEM déchargée par lueur. Observez si la poudre tombe vers la grille.Découvrir la poudre finement broyée en retirant l’un des deux couvercles en verre. Ensuite, brosser doucement la poudre fine du couvercle sur la grille TEM à l’aide d’un morceau de papier filtre. Saisissez le bord de la grille TEM à l’aide d’une pince à épiler, en vous assurant que les pointes ne perforent aucun des carrés de la grille.Soulevez la grille d’un à deux centimètres au-dessus du papier filtre et inclinez la grille à 90 degrés par rapport au papier en dessous. Tapotez doucement la pince à épiler tout en gardant la grille fermement serrée pour enlever toute poudre en vrac. Congelez la grille en déplaçant la pointe de la pince à épiler directement dans un récipient d’azote liquide à la main et attendez que la grille et la pince à épiler cessent de bouillir.Sous azote liquide, placer la grille dans le porte-échantillon avec le côté carbone orienté de telle sorte que l’échantillon soit frappé par le faisceau avant le film de support de carbone. Charger le porte-échantillon dans le TEM en s’assurant que la grille est toujours maintenue à la température de l’azote liquide. Pour les systèmes de chargement automatique, placez les grilles clipsées dans une cassette dans un récipient refroidi à l’azote liquide, ce qui permet à la robotique du chargeur automatique d’accepter la cassette tout en gardant les échantillons en sécurité pour la navette entre le chargeur automatique et la colonne.Ouvrez les vannes de colonne TEM et réglez le grossissement à l’aide des panneaux manuels au grossissement le plus bas possible. Trouvez le faisceau en ajustant le bouton d’intensité sur les panneaux manuels de sorte qu’une zone lumineuse ronde soit visible sur l’écran fluorescent. Prenez un atlas de grille à faible grossissement à l’aide d’un logiciel approprié garantissant que le microscope est bien aligné pour l’imagerie à faible et à fort grossissement avant de collecter des données MicroED haute résolution.Identifiez les carrés de grille sans carbone cassé et les grains noirs ou foncés visibles sur le film. Naviguez autour de la grille soit physiquement à l’aide du joystick sur les panneaux de main, soit virtuellement sur l’atlas collecté pour rechercher des carrés de grille qui ne sont pas cassés et contiennent des microcristaux. Ajoutez le centre de chacun de ces carrés à une liste d’emplacements de grille pour l’investigation, qui peut être ajoutée à un ordinateur portable dans l’interface utilisateur du microscope ou dans le logiciel d’automatisation du microscope.Réglez le grossissement entre 500 et 1300x. Ajustez la hauteur centrale à chaque emplacement de grille stocké et mettez à jour la valeur z enregistrée aux positions notées. Recherchez sur l’écran fluorescent ou sur une caméra plate de petites taches noires ou des grains sur la grille.Un bon échantillon aura souvent des arêtes vives à fort grossissement suggérant le cristal dans l’ordre. Déplacez un cristal de potentiel localisé vers le centre de l’écran et augmentez le grossissement de sorte que le TEM passe en mode de grossissement élevé. Insérez une ouverture de zone sélectionnée et modifiez l’ouverture pour une taille plus grande ou plus petite pour vous assurer que la zone sélectionnée est plus grande que le cristal.Passez en mode défraction en appuyant sur le bouton de défraction sur les panneaux manuels TEM pour vous assurer que l’écran fluorescent est inséré. Ajustez la longueur de la caméra à l’aide du bouton d’agrandissement de sorte que le bord ait au moins une résolution angström. Ajustez la mise au point de diffraction de manière à ce que la tache centrale soit aussi nette et petite que possible.À l’aide des boutons de changement de vitesse de diffraction, déplacez le faisceau central vers le centre de l’écran fluorescent. Insérez l’arrêt de poutre en vous assurant que le faisceau est derrière lui. Soulevez l’écran fluorescent et prenez une courte exposition sur l’appareil photo.Inspectez le motif de défraction correspondant, en vous assurant que le motif aura des points tranchants qui sont régulièrement disposés en colonnes et en lignes. Enregistrez les coordonnées cristallines dans l’interface utilisateur TEM ou en les écrivant, puis répétez le criblage par diffraction pour tous les cristaux potentiels d’intérêt sur le carré de la grille actuelle. Centrez le cristal grillagé à un grossissement supérieur à 1000x et ajustez la hauteur centrale du cristal à l’aide d’une routine automatique ou à la main.Insérez l’ouverture de zone sélectionnée qui correspond le mieux à la taille et à la forme du cristal. Inclinez la scène dans les directions négative et positive jusqu’à ce que l’image soit obstruée par les barres de grille. Et notez ces angles à des fins de collecte de données en lisant les données toutes les secondes sur un appareil photo moderne avec un mode de lecture à obturateur roulant.Réglez la vitesse de rotation en spécifiant le pourcentage de la vitesse d’inclinaison maximale et le moment de l’arrêt dans l’interface utilisateur du microscope ou dans un logiciel dédié. Enregistrer les données dans une variété de formats dit soit des images individuelles ou sous forme d’une pile d’images. Un film de défraction en format cristallographique recueilli à partir de microcristaux montre un ensemble de données MicroED à rotation continue à partir d’un microcristal de carbamazépine identifié sur une grille MET.Après la collecte, l’intégration et la solution de structure, une structure haute résolution est déterminée et sa clarté dépend de la qualité et de l’exhaustivité des données. L’application de l’échantillon à la grille est essentielle pour acquérir de bonnes données. En suivant cette méthode, les données peuvent être traitées ultérieurement à l’aide d’un logiciel cristallographique standard.La démonstration que MicroED est une méthode puissante pour les petites molécules a ouvert son utilisation dans le monde entier pour résoudre de nouvelles structures de molécules d’importance critique.

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