Name: microcrystal electron diffraction of small molecules
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00
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Das Gonen-Labor wird mit Mitteln des Howard Hughes Medical Institute unterstützt. Diese Studie wurde von den National Institutes of Health P41GM136508 unterstützt.

1. Vorbereitung von niedermolekularen Proben
<ol><li>Übertragen Sie eine kleine Menge (0,01 - 1 mg) Pulver, Flüssigkeit oder Feststoffe in eine kleine Durchstechflasche oder ein Röhrchen.</li>
	<li>Bei Proben, die bereits in Pulverform vorliegen, verschließen Sie das Röhrchen mit der Kappe, bis die Probe benötigt wird. Trocknen Sie die flüssigen Proben zu Pulvern, bevor Sie mit Methode 1 (Schritt 3) oder 2 (Schritt 4) versuchen. Anmerkungen: Für Proben, die in Flüssigkeit aufgelöst sind, kann die nachstehe...

<ol>
	<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345 (2013).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED.">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li><li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector.">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li><li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+and+processing.">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP.">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109 (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size.">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking.">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel.">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li><li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination.">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li><li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation.">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li><li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-&#229;ngstr&#246;m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp.">Sub-&#229;ngstr&#246;m cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li><li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products.">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li><li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+with+SerialEM.">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS:+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED.">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li><li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography.">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+catalase+determined+by+MicroED.">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600 (2014).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED.">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li></ol>

Die Probenvorbereitung ist in der Regel ein iterativer Prozess, bei dem nach Screening- und Datenerfassungssitzungen Optimierungen vorgenommen werden. Bei niedermolekularen Proben ist es oft ratsam, zunächst eine Gitterpräparation zu versuchen, ohne die Gitter zu entladen, da viele Arzneimittel dazu neigen, hydrophobzu sein 10,11. Wenn die Gitter zu wenige nanokristalline Ablagerungen aufweisen, ist es eine gute Idee, es nach der ersten Glimmentladung der Gitte...

Die Mikrokristall-Elektronenbeugung (MicroED) ist eine elektronenkryomikroskopische Methode (Kryo-EM) zur Bestimmung von Strukturen mit atomarer Auflösung aus Kristallen im Submikrometerbereich 1,2. Kristalle werden auf Standardgitter des Transmissionselektronenmikroskops (TEM) aufgebracht und eingefroren, indem sie entweder in flüssiges Ethan oder flüssigen Stickstoff getaucht werden. Die Gitter werden dann in ein TEM geladen, das bei kryogenen Temperaturen arbeitet. Die Kristalle befinden sich auf dem Gitter und werden auf die anfängliche Beugungsqualität geprüft. Kontinuierliche Rotation MicroED-Daten werden von einer Teilmenge der geschirmten Kristalle gesammelt, wo die Daten mit einer schnellen Kamera als Filmgespeichert werden 3. Diese Filme werden in ein kristallographisches Standardformat konvertiert und nahezu identisch wie ein Röntgenkristallographie-Experimentverarbeitet 4.
MicroED wurde ursprünglich entwickelt, um Protein-Mikrokristallezu untersuchen 1,2. Ein Engpass in der Proteinkristallographie ist die Züchtung großer, wohlgeordneter Kristalle für herkömmliche Synchrotron-Röntgenbeugungsexperimente. Da Elektronen mit Materie wechselwirken, die um Größenordnungen stärker ist als Röntgenstrahlung, sind die Grenzen der Kristallgröße, die erforderlich ist, um eine nachweisbare Beugung zu erzeugen,erheblich geringer 5. Darüber hinaus ist das Verhältnis von elastischen zu inelastischen Streuereignissen für Elektronen günstiger, was darauf hindeutet, dass mit einer geringeren Gesamtexposition nützlichere Daten gesammelt werden können5. Ständige Weiterentwicklungen haben es ermöglicht, MicroED-Daten von den anspruchsvollsten Mikrokristallen zu sammeln 6,7,8,9.
Kürzlich hat sich gezeigt, dass MicroED ein leistungsfähiges Werkzeug zur Bestimmung der Strukturen von niedermolekularen Pharmazeutika aus scheinbar amorphen Materialien ist10,11,12,13. Diese Pulver können direkt aus einer Flasche mit gekauftem Reagenz, einer Reinigungssäule oder sogar aus dem Zerkleinern einer Pille zu einem feinen Pulverstammen 10. Diese Pulver erscheinen auf den ersten Blick amorph, können aber entweder vollständig aus Nanokristallen bestehen oder nur Spuren nanokristalliner Ablagerungen in einer größeren nichtkristallinen, amorphen Fraktion enthalten. Das Auftragen des Materials auf das Gitter ist einfach, und die nachfolgenden Schritte der Kristallidentifikation, des Screenings und der Datenerfassung könnten in naher Zukunft sogar automatisiert werden14. Während andere andere Methoden zur Probenvorbereitung und Datenerfassung verwenden, werden hier die Protokolle, die im Gonen-Labor entwickelt und verwendet werden, um Proben kleiner Moleküle für die Mikro-ED und für die Datenerfassung vorzubereiten, detailliert beschrieben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td>Any vial or tube will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid clips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid C-rings</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbamazapine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4024-1G</td>
			<td>Any amount will suffice for these experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS based detector</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>CetaD 16M</td>
			<td>We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delphi software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU-D software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Commercial software for the acquisition of MicroED data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slides</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharger</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High PrecisionTweezers</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78325-AC</td>
			<td>Any high precision tweezer will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen vessel</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-800</td>
			<td>A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM software</td>
			<td>UC Boulder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Quantifoil/EMS</td>
			<td>Q310CMA</td>
			<td>Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transmission electron microscope (TEM)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman circular filter paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>90mm or larger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microcrystal electron diffraction of small molecules

Ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung von niedermolekularen Proben für Mikrokristall-Elektronenbeugungsexperimente (MicroED) wird beschrieben. MicroED wurde entwickelt, um Strukturen von Proteinen und kleinen Molekülen mit Standard-Kryomikroskopiegeräten (Kryo-EM) zu lösen. Auf diese Weise wurden in jüngster Zeit kleine Moleküle, Peptide, lösliche Proteine und Membranproteine mit hoher Auflösung bestimmt. Hier werden Protokolle für die Herstellung von Gittern aus niedermolekularen Arzneimitteln am Beispiel des Medikaments Carbamazepin vorgestellt. Protokolle für das Screening und die Datenerfassung werden vorgestellt. Weitere Schritte im Gesamtprozess, wie z.B. Datenintegration, Strukturbestimmung und Verfeinerung, werden an anderer Stelle vorgestellt. Die Zeit, die für die Präparation der niedermolekularen Gitter benötigt wird, wird auf weniger als 30 Minuten geschätzt.

MicroED ist eine Kryo-EM-Methode, die die starken Wechselwirkungen zwischen Elektronen und Materie nutzt, was die Untersuchung verschwindend kleiner Kristalle ermöglicht12,13. Nach diesen Schritten wird erwartet, dass ein Beugungsfilm im kristallographischen Format aus Mikrokristallen gesammelt wird (Film 1). Hier wird die Technik anhand von Carbamazepin12 demonstriert. Die Ergebnisse zeigen einen MicroED-Datensatz mit ko...

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Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Hier beschreiben wir die in unserem Labor entwickelten Verfahren zur Herstellung von Pulvern aus niedermolekularen Kristallen für Mikrokristall-Elektronenbeugungsexperimente (MicroED).

Mikrokristall-Elektronenbeugung kleiner Moleküle

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

In diesem Verfahren zeigen wir, wie man in wenigen Minuten von einem niedermolekularen Pulver zu einer dreidimensionalen Struktur gelangt. Dies ist eine transformative Technik für die Chemie-Community. Viele Verbindungen wachsen nicht so leicht zu großen Kristallen heran.Mit MicroED können wir Strukturen mit atomarer Auflösung aus Kristallen im Nanometerbereich bestimmen. Das Verfahren wird von Dr. Mike Martynowycz, Professor an der UCLA, demonstriert. Geben Sie zunächst eine kleine Menge Pulver, Flüssigkeit oder Feststoffe in eine kleine Durchstechflasche oder ein Röhrchen.Bei Proben, die bereits in Pulverform vorliegen, verschließen Sie das Röhrchen mit der Kappe, bis die Probe benötigt wird. Trocknen Sie die flüssigen Proben in ähnlicher Weise zu Pulvern. Wickeln Sie Plastikfolie um ein Ende einer Glasabdeckung.Legen Sie die TEM-Gitter mit der braunen Carbonseite nach oben auf die Folie auf dem Deckdia. Legen Sie dann den Objektträger mit Gittern in die Glimmentladungskammer und entladen Sie den Abdeckdia ca. 30 Sekunden lang mit der Negativeinstellung bei 15 Pikoampere. Bewahren Sie die Gitter auf dem Deckobjektträger in einer mit Filterpapier ausgelegten Glas-Petrischale auf, bevor Sie die Probe in die Gitter geben.Entfernen Sie das Glimmentladungs-TEM-Gitter mit einer Pinzette von der abgedeckten Petrischale und legen Sie es mit der Kohleseite nach oben auf ein kreisförmiges Filterpapier. Entfernen Sie mit einem kleinen Spatel einen sehr kleinen Löffel Pulver und legen Sie ihn auf ein kleines quadratisches Glasdeckglas direkt neben dem TEM-Gitter auf dem Filterpapier. Legen Sie einen weiteren kleinen quadratischen Glasträger oder Deckglas auf das Pulver.Reiben Sie die beiden Glasobjektträger mit den Fingern vorsichtig aneinander, um ein feines Pulver herzustellen. Winkeln Sie die Deckgläser an und positionieren Sie sie knapp über dem TEM-Gitter auf dem Filterpapier und reiben Sie die Deckgläser nur wenige Zentimeter über dem glimmentladenen TEM-Gitter weiter aneinander. Beobachte, ob das Pulver in Richtung des Gitters fällt.Decken Sie das fein gemahlene Pulver auf, indem Sie eines der beiden Glasdeckgläser entfernen. Anschließend das feine Pulver mit einem Stück Filterpapier vorsichtig vom Deckglas auf das TEM-Gitter streichen. Fassen Sie den Rand des TEM-Gitters mit einer Pinzette und achten Sie darauf, dass die Spitzen keines der Gitterquadrate durchstechen.Heben Sie das Gitter ein bis zwei Zentimeter über das Filterpapier an und winkeln Sie das Gitter in einem Winkel von 90 Grad zum darunter liegenden Papier ab. Klopfen Sie vorsichtig auf die Pinzette, während Sie das Gitter fest zupfen, um loses Puder zu entfernen. Frieren Sie das Gitter ein, indem Sie die Spitze der Pinzette mit dem Gitter von Hand direkt in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff schieben, und warten Sie, bis das Gitter und die Pinzette aufhören zu kochen.Legen Sie das Gitter unter flüssigem Stickstoff so in den Probenhalter, dass die Kohlenstoffseite so ausgerichtet ist, dass die Probe vor der Kohlenstoffträgerfolie vom Strahl getroffen wird. Legen Sie den Probenhalter in das TEM und stellen Sie sicher, dass das Gitter immer auf Flüssigstickstofftemperatur gehalten wird. Legen Sie bei automatischen Ladesystemen die abgeschnittenen Gitter in eine Kassette in einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Behälter, der es der automatischen Laderoboter ermöglicht, die Kassette aufzunehmen und gleichzeitig die Proben sicher für den Transport zwischen dem automatischen Belader und der Säule zu halten.Öffnen Sie die TEM-Säulenventile und stellen Sie die Vergrößerung mit den Handpulten auf die geringstmögliche Vergrößerung ein. Finden Sie den Strahl, indem Sie den Intensitätsregler an den Handpulten so einstellen, dass ein runder heller Bereich auf dem fluoreszierenden Bildschirm sichtbar ist. Erstellen Sie einen All-Grid-Atlas bei niedriger Vergrößerung mit geeigneter Software, um sicherzustellen, dass das Mikroskop sowohl für die Bildgebung mit niedriger als auch mit hoher Vergrößerung gut ausgerichtet ist, bevor hochauflösende MicroED-Daten erfasst werden.Identifizieren Sie Rasterquadrate ohne gebrochenen Kohlenstoff und sichtbare schwarze oder dunkle Körner auf der Folie. Navigieren Sie entweder physisch mit dem Joystick auf den Handfeldern oder virtuell auf dem gesammelten Atlas durch das Gitter, um nach Gitterquadraten zu suchen, die nicht zerbrochen sind und Mikrokristalle enthalten. Fügen Sie den Mittelpunkt jedes dieser Quadrate zu einer Liste von Rasterpositionen für die Untersuchung hinzu, die einem Notizbuch in der Mikroskop-Benutzeroberfläche oder in der Mikroskop-Automatisierungssoftware hinzugefügt werden kann.Stellen Sie die Vergrößerung zwischen 500 und 1300x ein. Passen Sie die zentrische Höhe an jeder gespeicherten Rasterposition an, und aktualisieren Sie den gespeicherten Z-Wert auf die notierten Positionen. Suchen Sie entweder auf dem fluoreszierenden Bildschirm oder auf einer flachen Kamera nach kleinen schwarzen Flecken oder Körnern auf dem Raster.Eine gute Probe hat bei hoher Vergrößerung oft scharfe Kanten, die darauf hindeuten, dass der Kristall in Ordnung ist. Bewegen Sie einen lokalisierten Potentialkristall in die Mitte des Bildschirms und erhöhen Sie die Vergrößerung so, dass das TEM in den Modus mit hoher Vergrößerung wechselt. Fügen Sie eine Blende für den ausgewählten Bereich ein und ändern Sie die Blende in eine größere oder kleinere Größe, um sicherzustellen, dass der ausgewählte Bereich größer als der Kristall ist.Wechseln Sie in den Defraktionsmodus, indem Sie die Defraktionstaste an den TEM-Handpulten drücken, um sicherzustellen, dass der fluoreszierende Bildschirm eingesetzt ist. Stellen Sie die Kameralänge mit dem Vergrößerungsknopf so ein, dass der Rand mindestens eine Angström-Auflösung hat. Stellen Sie den Beugungsfokus so ein, dass der zentrale Punkt so scharf und klein wie möglich ist.Bewegen Sie den zentralen Strahl mit den Beugungsverschiebungsknöpfen in die Mitte des Fluoreszenzschirms. Setzen Sie den Balkenanschlag ein und stellen Sie sicher, dass sich der Balken dahinter befindet. Heben Sie den fluoreszierenden Bildschirm an und machen Sie eine kurze Belichtung mit der Kamera.Überprüfen Sie das entsprechende Defraktionsmuster und stellen Sie sicher, dass das Muster scharfe Stellen aufweist, die regelmäßig in Spalten und Zeilen angeordnet sind. Speichern Sie die Kristallkoordinaten entweder in der TEM-Benutzeroberfläche oder indem Sie sie aufschreiben, und wiederholen Sie dann das Beugungsscreening für alle potentiellen Kristalle, die auf dem aktuellen Gitterquadrat von Interesse sind. Zentrieren Sie den geschirmten Kristall mit einer Vergrößerung von mehr als 1000x und stellen Sie die zentrische Höhe des Kristalls entweder mit einer automatischen Routine oder von Hand ein.Fügen Sie die ausgewählte Bereichsöffnung ein, die am besten zur Kristallgröße und -form passt. Kippen Sie den Tisch in die negative und positive Richtung, bis das Bild von den Rasterbalken verdeckt wird. Und notieren Sie diese Winkel für die Datenerfassung, indem Sie die Daten jede Sekunde auf einer modernen Kamera mit Rolling-Shutter-Auslesemodus auslesen.Stellen Sie die Rotationsrate ein, indem Sie den Prozentsatz der maximalen Neigungsgeschwindigkeit und den Zeitpunkt des Anhaltens in der Benutzeroberfläche des Mikroskops oder in einer speziellen Software angeben. Speichern Sie die Daten in einer Vielzahl von Formaten, z. B. entweder als einzelne Frames oder als Stapel von Bildern. Ein Defraktionsfilm im kristallographischen Format, der von Mikrokristallen aufgenommen wurde, zeigt einen MicroED-Datensatz mit kontinuierlicher Rotation aus einem Carbamazepin-Mikrokristall, der auf einem TEM-Gitter identifiziert wurde.Nach der Datenerfassung, -integration und -strukturierung wird eine hochauflösende Struktur festgelegt, deren Klarheit von der Qualität und Vollständigkeit der Daten abhängt. Das Anwenden der Stichprobe auf das Raster ist entscheidend für die Erfassung guter Daten. Auf diese Weise können die Daten mit einer kristallographischen Standardsoftware weiterverarbeitet werden.Der Nachweis, dass MicroED eine leistungsfähige Methode für kleine Moleküle ist, hat ihren weltweiten Einsatz für die Lösung neuer Strukturen kritisch wichtiger Moleküle eröffnet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Mikrokristallographie von Proteinkristallen und<em&gt; In Cellulo</em&gt; Beugung

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Forschung

Biochemie

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

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