Name: microcrystal electron diffraction of small molecules
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00
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गोनेन लैब हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट से धन द्वारा समर्थित है। इस अध्ययन को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ पी 41 जीएम 136508 द्वारा समर्थित किया गया था।

1. छोटे अणु नमूने तैयार करना
<ol><li>पाउडर, तरल, या ठोस पदार्थों की एक छोटी मात्रा (0.01 - 1 मिलीग्राम) को एक छोटी शीशी या ट्यूब में स्थानांतरित करें।</li>
	<li>पाउडर के रूप में पहले से ही नमूने के लिए, नमूने की आवश्यकता ह?...

<ol>
	<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345 (2013).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED.">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li><li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector.">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li><li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+and+processing.">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP.">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109 (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size.">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking.">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel.">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li><li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination.">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li><li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation.">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li><li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-&#229;ngstr&#246;m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp.">Sub-&#229;ngstr&#246;m cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li><li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products.">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li><li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+with+SerialEM.">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS:+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED.">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li><li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography.">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+catalase+determined+by+MicroED.">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600 (2014).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED.">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li></ol>

नमूना तैयारी आम तौर पर एक पुनरावृत्ति प्रक्रिया है, जहां स्क्रीनिंग और डेटा संग्रह के सत्रों के बाद अनुकूलन किए जाते हैं। छोटे अणु के नमूनों के लिए, ग्रिड को चमक-निर्वहन के बिना पहले ग्रिड तैयार करने का...

माइक्रोक्रिस्टल इलेक्ट्रॉन विवर्तन (माइक्रोईडी) एक इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) विधि है जो उप-माइक्रोमीटर आकार के क्रिस्टल 1,2 से परमाणु संकल्प संरचनाओं को निर्धारित करती है। क्रिस्टल को मानक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) ग्रिड पर लागू किया जाता है और तरल ईथेन या तरल नाइट्रोजन में गिरकर जमे हुए होते हैं। ग्रिड को तब क्रायोजेनिक तापमान पर संचालित टीईएम में लोड किया जाता है। क्रिस्टल ग्रिड पर स्थित होते हैं और प्रारंभिक विवर्तन गुणवत्ता के लिए जांच की जाती है। निरंतर रोटेशन माइक्रोईडी डेटा स्क्रीन किए गए क्रिस्टल के उप-समूह से एकत्र किया जाता है, जहां डेटा को मूवी 3 के रूप में तेज कैमरे का उपयोग करके सहेजा जाताहै। इन फिल्मों को एक मानक क्रिस्टलोग्राफिक प्रारूप में परिवर्तित किया जाता है और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी प्रयोग 4 के रूप में लगभग समान रूप से संसाधित कियाजाता है।
माइक्रोईडी मूल रूप से प्रोटीन माइक्रोक्रिस्टल 1,2 की जांच के लिए विकसित किया गया था। प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी में एक अड़चन पारंपरिक सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए बड़े, अच्छी तरह से आदेशित क्रिस्टल बढ़ रही है। चूंकि इलेक्ट्रॉन एक्स-रे की तुलना में मजबूत परिमाण के पदार्थ आदेशों के साथ बातचीत करते हैं, पता लगाने योग्य विवर्तन का उत्पादन करने के लिए आवश्यक क्रिस्टल आकार की सीमाएं काफीछोटी हैं। इसके अतिरिक्त, लोचदार से इनलेस्टिक प्रकीर्णन घटनाओं का अनुपात इलेक्ट्रॉनों के लिए अधिक अनुकूल है, यह सुझाव देते हुए कि अधिक उपयोगी डेटा को छोटे समग्र जोखिम के साथ एकत्र किया जा सकताहै। निरंतर विकास ने माइक्रोईडी डेटा को सबसे चुनौतीपूर्ण माइक्रोक्रिस्टल 6,7,8,9 से एकत्र करने की अनुमति दी है।
हाल ही में, माइक्रोईडी को स्पष्ट रूप से अनाकार सामग्री10,11,12,13 से छोटे अणु फार्मास्यूटिकल्स की संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण दिखाया गया है। ये पाउडर सीधे खरीदे गए अभिकर्मक की बोतल, एक शुद्धिकरण स्तंभ, या यहां तक कि एक गोली को एक महीन पाउडर10 में कुचलने से भी आ सकते हैं। ये पाउडर आंखों से अनाकार दिखाई देते हैं, लेकिन या तो पूरी तरह से नैनोक्रिस्टल से बने हो सकते हैं या केवल अधिक गैर-क्रिस्टलीय, अनाकार अंश में नैनोक्रिस्टलाइन जमा की मात्रा का पता लगाते हैं। ग्रिड के लिए सामग्री का अनुप्रयोग आसान है, और क्रिस्टल पहचान, स्क्रीनिंग और डेटा संग्रह के बाद के चरणों को निकट भविष्य में स्वचालित भी किया जा सकताहै। जबकि अन्य नमूना तैयार करने और डेटा संग्रह के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग कर सकते हैं, यहां माइक्रोईडी के लिए छोटे अणुओं के नमूने तैयार करने और डेटा संग्रह के लिए गोनेन प्रयोगशाला में विकसित और उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल विस्तृत हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td>Any vial or tube will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid clips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid C-rings</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbamazapine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4024-1G</td>
			<td>Any amount will suffice for these experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS based detector</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>CetaD 16M</td>
			<td>We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delphi software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU-D software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Commercial software for the acquisition of MicroED data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slides</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharger</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High PrecisionTweezers</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78325-AC</td>
			<td>Any high precision tweezer will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen vessel</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-800</td>
			<td>A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM software</td>
			<td>UC Boulder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Quantifoil/EMS</td>
			<td>Q310CMA</td>
			<td>Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transmission electron microscope (TEM)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman circular filter paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>90mm or larger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microcrystal electron diffraction of small molecules

माइक्रोक्रिस्टल इलेक्ट्रॉन विवर्तन (माइक्रोईडी) प्रयोगों के लिए छोटे अणु के नमूने तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल वर्णित है। माइक्रोईडी को मानक इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) उपकरणों का उपयोग करके प्रोटीन और छोटे अणुओं की संरचनाओं को हल करने के लिए विकसित किया गया है। इस तरह, छोटे अणु, पेप्टाइड्स, घुलनशील प्रोटीन और झिल्ली प्रोटीन हाल ही में उच्च संकल्प के लिए निर्धारित किए गए हैं। एक उदाहरण के रूप में दवा कार्बामाज़ेपिन का उपयोग करके छोटे अणु फार्मास्यूटिकल्स के ग्रिड तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किए गए हैं। स्क्रीनिंग और डेटा एकत्र करने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए जाते हैं। समग्र प्रक्रिया में अतिरिक्त कदम, जैसे डेटा एकीकरण, संरचना निर्धारण और शोधन कहीं और प्रस्तुत किए जाते हैं। छोटे अणु ग्रिड तैयार करने के लिए आवश्यक समय 30 मिनट से कम होने का अनुमान है।

माइक्रोईडी एक क्रायोईएम विधि है जो इलेक्ट्रॉनों और पदार्थ के बीच मजबूत बातचीत का लाभ उठाती है, जो लुप्त छोटे क्रिस्टल12,13 की जांच की अनुमति देती है। इन चरणों के बाद, माइक्रोक्रिस्ट...

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Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

यहां, हम माइक्रोक्रिस्टल इलेक्ट्रॉन विवर्तन (माइक्रोईडी) प्रयोगों के लिए छोटे अणु क्रिस्टल के पाउडर तैयार करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में विकसित प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं।

छोटे अणुओं का माइक्रोक्रिस्टल इलेक्ट्रॉन विवर्तन

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

इस प्रक्रिया में, हम दिखाते हैं कि मिनटों में एक छोटे अणु पाउडर से तीन आयामी संरचना तक कैसे आगे बढ़ना है। यह रसायन विज्ञान समुदाय के लिए एक परिवर्तनकारी तकनीक है। कई यौगिक आसानी से बड़े क्रिस्टल में नहीं बढ़ते हैं।माइक्रोईडी के साथ, हम नैनोमीटर आकार क्रिस्टल से परमाणु संकल्प संरचनाओं को निर्धारित कर सकते हैं। प्रक्रिया का प्रदर्शन डॉ माइक मार्टिनोविक्ज़ होगा जो यूसीएलए में प्रोफेसर हैं। शुरू करने के लिए, पाउडर, तरल या ठोस पदार्थों की एक छोटी मात्रा को एक छोटी शीशी या ट्यूब में स्थानांतरित करें।पाउडर के रूप में पहले से ही नमूने के लिए, नमूने की आवश्यकता होने तक टोपी का उपयोग करके ट्यूब को सील करें। इसी तरह, तरल नमूनों को पाउडर में सुखाएं। ग्लास कवर स्लाइड के एक छोर के चारों ओर प्लास्टिक फिल्म लपेटें।टीईएम ग्रिड को कवर स्लाइड के शीर्ष पर भूरे रंग के कार्बन साइड के साथ फिल्म पर रखें। फिर, ग्रिड के साथ स्लाइड को ग्लो डिस्चार्ज चैंबर में रखें और 15 पिकोएम्पर्स पर नकारात्मक सेटिंग का उपयोग करके कवर स्लाइड को लगभग 30 सेकंड के लिए ग्लो डिस्चार्ज करें। ग्रिड में नमूना जोड़ने से पहले फ़िल्टर पेपर के साथ पंक्तिबद्ध ग्लास पेट्री डिश के अंदर कवर स्लाइड पर ग्रिड स्टोर करें।चिमटी का उपयोग करके कवर किए गए पेट्री डिश से ग्लो डिस्चार्ज टीईएम ग्रिड को हटा दें और इसे कार्बन साइड के साथ एक गोलाकार फिल्टर पेपर पर रखें। एक छोटे स्पैटुला का उपयोग करके, पाउडर का एक बहुत छोटा स्कूप निकालें और इसे फिल्टर पेपर पर टीईएम ग्रिड के बगल में एक छोटे वर्ग ग्लास कवर स्लिप पर रखें। पाउडर के शीर्ष पर एक और छोटी चौकोर ग्लास स्लाइड या कवर स्लिप रखें।उंगलियों से, धीरे से दो ग्लास स्लाइड्स को एक साथ रगड़ें ताकि एक अच्छा पाउडर बनाया जा सके। कवर स्लिप को कोण करें और उन्हें फिल्टर पेपर पर टीईएम ग्रिड के ठीक ऊपर रखें और चमक डिस्चार्ज किए गए टीईएम ग्रिड से कुछ सेंटीमीटर ऊपर कवर स्लिप को एक साथ रगड़ना जारी रखें। देखें कि पाउडर ग्रिड की ओर गिर रहा है या नहीं।दो ग्लास कवर स्लिप में से एक को हटाकर बारीक पिसे हुए पाउडर को उजागर करें। फिर फिल्टर पेपर के एक टुकड़े का उपयोग करके टीईएम ग्रिड पर कवर स्लिप से बारीक पाउडर को धीरे से ब्रश करें। चिमटी के एक सेट का उपयोग करके टीईएम ग्रिड के किनारे को पकड़ें, यह आश्वासन देते हुए कि टिप्स किसी भी ग्रिड वर्ग को पंचर नहीं करते हैं।ग्रिड को फिल्टर पेपर से एक से दो सेंटीमीटर ऊपर उठाएं और ग्रिड को नीचे पेपर पर 90 डिग्री पर कोण दें। किसी भी ढीले पाउडर को हटाने के लिए ग्रिड को मजबूती से रखते हुए चिमटी को धीरे से टैप करें। ग्रिड के साथ चिमटी की नोक को सीधे हाथ से तरल नाइट्रोजन कंटेनर में ले जाकर ग्रिड को फ्रीज करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि ग्रिड और चिमटी उबलना बंद न हो जाए।तरल नाइट्रोजन के तहत, ग्रिड को कार्बन साइड ओरिएंटेड के साथ नमूना धारक में रखें ताकि नमूना कार्बन समर्थन फिल्म से पहले बीम से मारा जाएगा। नमूना धारक को टीईएम में लोड करें यह आश्वासन देते हुए कि ग्रिड को हमेशा तरल नाइट्रोजन तापमान पर रखा जाता है। ऑटो लोडर सिस्टम के लिए, स्लिप्ड ग्रिड को तरल नाइट्रोजन कूल्ड कंटेनर में कैसेट में रखें, जो ऑटो लोडर रोबोटिक्स को ऑटो लोडर और कॉलम के बीच शटलिंग के लिए नमूने को सुरक्षित रखते हुए कैसेट को स्वीकार करने की अनुमति देता है।टीईएम कॉलम वाल्व खोलें और हाथ पैनलों का उपयोग करके आवर्धन को सबसे कम आवर्धन संभव तक समायोजित करें। हाथ के पैनलों पर तीव्रता नॉब को समायोजित करके बीम का पता लगाएं ताकि फ्लोरोसेंट स्क्रीन पर एक गोल उज्ज्वल क्षेत्र दिखाई दे। उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कम आवर्धन पर एक ऑल ग्रिड एटलस लें, यह सुनिश्चित करते हुए कि माइक्रोस्कोप उच्च रिज़ॉल्यूशन माइक्रोईडी डेटा एकत्र करने से पहले कम और उच्च आवर्धन इमेजिंग दोनों के लिए अच्छी तरह से संरेखित है।टूटे हुए कार्बन के बिना ग्रिड वर्गों की पहचान करें और फिल्म पर काले या काले दाने दिखाई दें। ग्रिड के चारों ओर नेविगेट करें या तो हाथ के पैनलों पर जॉयस्टिक का उपयोग करके या वस्तुतः एकत्रित एटलस पर ग्रिड वर्गों की खोज करने के लिए जो टूटे नहीं हैं और जिनमें सूक्ष्म क्रिस्टल हैं। जांच के लिए ग्रिड स्थानों की सूची में इन वर्गों में से प्रत्येक के केंद्र को जोड़ें, जिसे माइक्रोस्कोप उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस या माइक्रोस्कोप स्वचालन सॉफ्टवेयर में नोटबुक में जोड़ा जा सकता है।आवर्धन को 500 से 1300x के बीच सेट करें। प्रत्येक संग्रहीत ग्रिड स्थान पर केंद्रित ऊंचाई समायोजित करें और सहेजे गए जेड-मान को नोट किए गए पदों पर अपडेट करें। ग्रिड पर छोटे काले धब्बे या अनाज के लिए फ्लोरोसेंट स्क्रीन पर या फ्लैट कैमरे पर खोजें।एक अच्छे नमूने में अक्सर उच्च आवर्धन पर तेज किनारे होंगे जो क्रिस्टल को क्रम में सुझाते हैं। स्क्रीन के केंद्र में एक स्थित संभावित क्रिस्टल ले जाएं और आवर्धन को बढ़ाएं ताकि टीईएम उच्च आवर्धन मोड में प्रवेश करे। एक चयनित क्षेत्र एपर्चर डालें और एपर्चर को बड़े या छोटे आकार में बदलें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि चयनित क्षेत्र क्रिस्टल से बड़ा है।टीईएम हैंड पैनलों पर डिफ्रैक्शन बटन दबाकर डिफ्रैक्शन मोड पर स्विच करें, यह आश्वासन देते हुए कि फ्लोरोसेंट स्क्रीन डाली गई है। आवर्धन नॉब का उपयोग करके कैमरे की लंबाई को समायोजित करें ताकि किनारा कम से कम एक एंगस्ट्रॉम रिज़ॉल्यूशन हो। विवर्तन फोकस को समायोजित करें ताकि केंद्रीय स्थान जितना संभव हो उतना तेज और छोटा हो।विवर्तन शिफ्ट नॉब्स का उपयोग करके, केंद्रीय बीम को फ्लोरोसेंट स्क्रीन के केंद्र में ले जाएं। बीम स्टॉप डालें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि बीम इसके पीछे है। फ्लोरोसेंट स्क्रीन उठाएं और कैमरे पर एक छोटा एक्सपोजर लें।संबंधित डिफ्रैक्शन पैटर्न का निरीक्षण करें, यह सुनिश्चित करें कि पैटर्न में तेज धब्बे होंगे जो नियमित रूप से कॉलम और पंक्तियों में व्यवस्थित होते हैं। क्रिस्टल निर्देशांक को या तो टीईएम उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस में सहेजें या उन्हें लिखकर, फिर वर्तमान ग्रिड स्क्वायर पर रुचि के सभी संभावित क्रिस्टल के लिए विवर्तन स्क्रीनिंग दोहराएं। स्क्रीन किए गए क्रिस्टल को 1000x से अधिक आवर्धन पर केंद्रित करें और स्वचालित दिनचर्या या हाथ से क्रिस्टल की केंद्रित ऊंचाई को समायोजित करें।चयनित क्षेत्र एपर्चर डालें जो क्रिस्टल आकार और आकार को सबसे अच्छा फिट बैठता है। चरण को नकारात्मक और सकारात्मक दिशाओं में झुकाएं जब तक कि छवि ग्रिड सलाखों से घिर न जाए। और रोलिंग शटर रीडआउट मोड के साथ आधुनिक कैमरे पर हर एक सेकंड में डेटा को पढ़कर डेटा संग्रह उद्देश्यों के लिए इन कोणों पर ध्यान दें।अधिकतम झुकाव गति का प्रतिशत निर्दिष्ट करके रोटेशन दर सेट करें और माइक्रोस्कोप उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस या समर्पित सॉफ़्टवेयर में कब रुकना है। डेटा को विभिन्न प्रारूपों में सहेजें या तो व्यक्तिगत फ्रेम या छवियों के ढेर के रूप में। माइक्रो क्रिस्टल से एकत्र किए गए क्रिस्टलोग्राफिक प्रारूप में एक डिफ्रैक्शन फिल्म एक टीईएम ग्रिड पर पहचाने गए कार्बामाज़ेपिन माइक्रो क्रिस्टल से एक निरंतर रोटेशन माइक्रोईडी डेटासेट दिखाती है।डेटा संग्रह, एकीकरण और संरचना समाधान के बाद, एक उच्च रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारित की जाती है और इसकी स्पष्टता डेटा की गुणवत्ता और पूर्णता पर निर्भर करती है। नमूना को ग्रिड पर लागू करना अच्छा डेटा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस विधि के बाद, मानक क्रिस्टलोग्राफिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा को आगे संसाधित किया जा सकता है।यह प्रदर्शित करते हुए कि माइक्रोईडी छोटे अणुओं के लिए एक शक्तिशाली विधि है, ने गंभीर रूप से महत्वपूर्ण अणुओं की नई संरचनाओं को हल करने के लिए दुनिया भर में इसका उपयोग खोल दिया है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

प्रोटीन क्रिस्टल की माइक्रोक्रिस्ट्रॉलोग्राफ़ी और<em&gt; सेलुलो में</em&gt; विवर्तन

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

एक परमाणु बल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एकल प्रोटीन अणुओं के बल स्पेक्ट्रोस्कोपी

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

सेमी स्वचालित के लिए बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों के साथ पेप्टाइड समानता एजेंट खोज और परिणामस्वरूप अलग करने का विश्लेषण

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

जैव परत Interferometry परख द्वारा छोटे अणुओं के साथ एक आयन चैनल प्रोटीन के संपर्क कैनेटीक्स पर कब्जा

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

स्पेक्ट्रोस्कोपी और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा फाइब्रिन थक्का संरचना पर β-Amyloid-प्रेरित विषमता का विश्लेषण

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

एकल अणु ट्रैकिंग माइक्रोस्कोपी - Cytosolic अणु के विविध राज्यों का निर्धारण करने के लिए एक उपकरण

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए दोहरी-बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके विट्रियस जैविक नमूनों से लैमेला तैयार करना

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पूरे सेल क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी वर्कफ़्लो के भीतर प्रत्यक्ष सेल पोजिशनिंग के लिए

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...