Name: microcrystal electron diffraction of small molecules
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00
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Il laboratorio Gonen è supportato da fondi dell'Howard Hughes Medical Institute. Questo studio è stato supportato dal National Institutes of Health P41GM136508.

1. Preparazione di campioni di piccole molecole
<ol><li>Trasferire una piccola quantità (0,01 - 1 mg) di polvere, liquido o solidi in un piccolo flaconcino o tubo.</li>
	<li>Per i campioni già in polvere, sigillare il tubo usando il tappo fino a quando il campione è necessario. Essiccare i campioni liquidi in polveri prima di tentare di utilizzare il metodo 1 (fase 3) o 2 (fase 4). NOTA: i campioni disciolti nel liquido possono utilizzare il metodo 3 (5.X) riportato di seguito.</li>
</ol>2. ...

<ol>
	<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345 (2013).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED.">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li><li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector.">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li><li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+and+processing.">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP.">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109 (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size.">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking.">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel.">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li><li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination.">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li><li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation.">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li><li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-&#229;ngstr&#246;m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp.">Sub-&#229;ngstr&#246;m cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li><li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products.">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li><li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+with+SerialEM.">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS:+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED.">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li><li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography.">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+catalase+determined+by+MicroED.">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600 (2014).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED.">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li></ol>

La preparazione dei campioni è in genere un processo iterativo, in cui le ottimizzazioni vengono effettuate dopo sessioni di screening e raccolta dati. Per i campioni di piccole molecole, è spesso prudente tentare prima la preparazione della griglia senza scaricare le griglie, poiché molti farmaci tendono ad essere idrofobici10,11. Se le griglie hanno troppo pochi depositi nanocristallini, è una buona idea riprovare dopo aver scaricato le griglie. Può darsi ...

La diffrazione elettronica a microcristalli (MicroED) è un metodo di criomicroscopia elettronica (cryo-EM) per determinare strutture di risoluzione atomica da cristalli di dimensioni sub-micrometriche 1,2. I cristalli vengono applicati alle griglie standard del microscopio elettronico a trasmissione (TEM) e congelati immergendosi nell'etano liquido o nell'azoto liquido. Le griglie vengono quindi caricate in un TEM che opera a temperature criogeniche. I cristalli si trovano sulla griglia e vengono schermati per la qualità iniziale della diffrazione. I dati MicroED a rotazione continua vengono raccolti da un sottoinsieme dei cristalli schermati, dove i dati vengono salvati utilizzando una fotocamera veloce come un filmato3. Questi filmati vengono convertiti in un formato cristallografico standard ed elaborati in modo quasi identico come un esperimento di cristallografia a raggi X4.
MicroED è stato originariamente sviluppato per studiare i microcristalli proteici 1,2. Un collo di bottiglia nella cristallografia delle proteine sta crescendo cristalli grandi e ben ordinati per i tradizionali esperimenti di diffrazione dei raggi X di sincrotrone. Poiché gli elettroni interagiscono con la materia ordini di grandezza più forte dei raggi X, i limiti della dimensione del cristallo necessari per produrre la diffrazione rilevabile sono considerevolmente più piccoli5. Inoltre, il rapporto tra eventi di scattering elastici e anelastici è più favorevole per gli elettroni, suggerendo che dati più utili possono essere raccolti con un'esposizione complessiva inferiore5. I costanti sviluppi hanno permesso di raccogliere dati MicroED dai microcristalli più impegnativi 6,7,8,9.
Recentemente, MicroED ha dimostrato di essere un potente strumento per determinare le strutture di farmaci a piccole molecole da materiali apparentemente amorfi10,11,12,13. Queste polveri possono provenire direttamente da una bottiglia di reagente acquistato, da una colonna di purificazione o anche dalla frantumazione di una pillola in una polvere fine10. Queste polveri appaiono amorfe ad occhio, ma possono essere interamente composte da nanocristalli o semplicemente contenere tracce di depositi nanocristallini in una maggiore frazione amorfa non cristallina. L'applicazione del materiale alla griglia è facile e le fasi successive di identificazione dei cristalli, screening e raccolta dei dati potrebbero anche essere automatizzate nel prossimo futuro14. Mentre altri possono utilizzare metodi diversi per la preparazione dei campioni e la raccolta dei dati, qui sono dettagliati i protocolli sviluppati e utilizzati nel laboratorio Gonen per la preparazione di campioni di piccole molecole per MicroED e per la raccolta dei dati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td>Any vial or tube will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid clips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid C-rings</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbamazapine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4024-1G</td>
			<td>Any amount will suffice for these experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS based detector</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>CetaD 16M</td>
			<td>We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delphi software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU-D software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Commercial software for the acquisition of MicroED data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slides</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharger</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High PrecisionTweezers</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78325-AC</td>
			<td>Any high precision tweezer will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen vessel</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-800</td>
			<td>A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM software</td>
			<td>UC Boulder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Quantifoil/EMS</td>
			<td>Q310CMA</td>
			<td>Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transmission electron microscope (TEM)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman circular filter paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>90mm or larger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microcrystal electron diffraction of small molecules

Viene descritto un protocollo dettagliato per la preparazione di campioni di piccole molecole per esperimenti di diffrazione elettronica microcristallina (MicroED). MicroED è stato sviluppato per risolvere strutture di proteine e piccole molecole utilizzando apparecchiature standard di criomicroscopia elettronica (crio-EM). In questo modo, piccole molecole, peptidi, proteine solubili e proteine di membrana sono state recentemente determinate ad alte risoluzioni. I protocolli sono presentati qui per la preparazione di griglie di farmaci a piccole molecole usando il farmaco carbamazepina come esempio. Vengono presentati protocolli per lo screening e la raccolta dei dati. Ulteriori passaggi nel processo complessivo, come l'integrazione dei dati, la determinazione della struttura e il perfezionamento, sono presentati altrove. Il tempo necessario per preparare le griglie di piccole molecole è stimato in meno di 30 minuti.

MicroED è un metodo crioEM che sfrutta le forti interazioni tra elettroni e materia, che consente lo studio di cristalli12,13 infinitamente piccoli. Dopo questi passaggi, ci si aspetta di avere un filmato di diffrazione in formato cristallografico raccolto da microcristalli (Filmato 1). Qui, la tecnica è dimostrata usando carbamazepina12. I risultati mostrano un set di dati MicroED a rotazione continua da un microcristal...

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Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Qui, descriviamo le procedure sviluppate nel nostro laboratorio per la preparazione di polveri di cristalli di piccole molecole per esperimenti di diffrazione elettronica microcristallina (MicroED).

Diffrazione elettronica microcristallina di piccole molecole

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

In questa procedura, mostriamo come procedere da una piccola molecola in polvere a una struttura tridimensionale in pochi minuti. Questa è una tecnica trasformativa per la comunità chimica. Molti composti non crescono facilmente in grandi cristalli.Con MicroED, possiamo determinare strutture di risoluzione atomica da cristalli di dimensioni nanometriche. A dimostrare la procedura sarà il Dr.Mike Martynowycz, professore alla UCLA. Per iniziare, trasferire una piccola quantità di polvere, liquido o solido in una piccola fiala o tubo.Per i campioni già in polvere, sigillare il tubo usando il tappo fino a quando il campione è necessario. Allo stesso modo, asciugare i campioni liquidi in polvere. Avvolgere la pellicola di plastica attorno a un'estremità di un vetrino di copertura.Posizionare le griglie TEM sulla pellicola sopra la diapositiva del coperchio con il lato in carbonio di colore marrone rivolto verso l'alto. Quindi, posizionare il vetrino con le griglie nella camera di scarico del bagliore e scaricare il vetrino del coperchio per circa 30 secondi utilizzando l'impostazione negativa a 15 picoamperes. Conservare le griglie sul vetrino di copertina all'interno di una piastra di Petri di vetro rivestita con carta da filtro prima di aggiungere il campione alle griglie.Rimuovere la griglia TEM a scarica di bagliore dalla capsula di Petri coperta usando una pinzetta e posizionarla su una carta da filtro circolare con il lato in carbonio rivolto verso l'alto. Usando una piccola spatola, rimuovere un pallino molto piccolo di polvere e posizionarlo su un piccolo vetrino quadrato di vetro proprio accanto alla griglia TEM sulla carta da filtro. Posizionare un altro piccolo vetrino quadrato o un foglietto di copertura sopra la polvere.Con le dita, strofinare delicatamente i due vetrini di vetro insieme per ottenere una polvere fine. Inclinare le diapositive del coperchio e posizionarle appena sopra la griglia TEM sulla carta da filtro e continuare a strofinare le diapositive del coperchio insieme a pochi centimetri sopra la griglia TEM scaricata a bagliore. Osserva se la polvere sta cadendo verso la griglia.Scoprire la polvere finemente macinata rimuovendo uno dei due vetrini di copertura. Quindi spazzolare delicatamente la polvere fine dalla linguetta di copertura sulla griglia TEM usando un pezzo di carta da filtro. Afferrare il bordo della griglia TEM utilizzando un set di pinzette, assicurandosi che le punte non forino nessuno dei quadrati della griglia.Sollevare la griglia da uno a due centimetri sopra la carta da filtro e inclinare la griglia di 90 gradi rispetto alla carta sottostante. Picchiettare delicatamente le pinzette mantenendo la griglia saldamente intrecciata per rimuovere la polvere sciolta. Congelare la griglia spostando a mano la punta delle pinzette con la griglia direttamente in un contenitore di azoto liquido e attendere che la griglia e le pinzette smettano di bollire.Sotto azoto liquido, posizionare la griglia nel supporto del campione con il lato del carbonio orientato in modo tale che il campione venga colpito dal fascio prima del film di supporto del carbonio. Caricare il portacampioni nel TEM assicurandosi che la griglia sia sempre mantenuta a temperature di azoto liquido. Per i sistemi di caricamento automatico, posizionare le griglie tagliate in una cassetta in un contenitore raffreddato ad azoto liquido, che consente alla robotica del caricatore automatico di accettare la cassetta mantenendo i campioni sicuri per la spola tra il caricatore automatico e la colonna.Aprire le valvole a colonna TEM e regolare l'ingrandimento utilizzando i pannelli manuali al minor ingrandimento possibile. Trova il raggio regolando la manopola dell'intensità sui pannelli manuali in modo che un'area luminosa rotonda sia visibile sullo schermo fluorescente. Prendere un atlante a griglia a basso ingrandimento utilizzando un software appropriato che assicura che il microscopio sia ben allineato per l'imaging a basso e alto ingrandimento prima di raccogliere dati MicroED ad alta risoluzione.Identificare i quadrati della griglia senza carbonio rotto e grani neri o scuri visibili sul film. Naviga intorno alla griglia fisicamente usando il joystick sui pannelli delle mani o virtualmente sull'atlante raccolto per cercare i quadrati della griglia che non sono rotti e contengono micro cristalli. Aggiungi il centro di ciascuno di questi quadrati a un elenco di posizioni della griglia per l'indagine, che può essere aggiunto a un taccuino nell'interfaccia utente del microscopio o nel software di automazione del microscopio.Impostare l'ingrandimento tra 500 e 1300x. Regolare l'altezza centrale in ogni posizione della griglia memorizzata e aggiornare il valore z salvato nelle posizioni annotate. Cerca sullo schermo fluorescente o su una fotocamera piatta piccole macchie nere o grani sulla griglia.Un buon campione avrà spesso spigoli vivi ad alto ingrandimento che suggeriscono il cristallo in ordine. Spostare un cristallo potenziale posizionato al centro dello schermo e aumentare l'ingrandimento in modo che il TEM entri in modalità di ingrandimento elevato. Inserire un'apertura dell'area selezionata e impostarla su una dimensione maggiore o minore per assicurarsi che l'area selezionata sia più grande del cristallo.Passare alla modalità di defrazione premendo il pulsante di defrazione sui pannelli manuali TEM per assicurarsi che lo schermo fluorescente sia inserito. Regolare la lunghezza della fotocamera utilizzando la manopola di ingrandimento in modo che il bordo abbia almeno una risoluzione angstrom. Regolare la messa a fuoco di diffrazione in modo che il punto centrale sia il più nitido e piccolo possibile.Utilizzando le manopole del cambio di diffrazione, spostare il fascio centrale al centro dello schermo fluorescente. Inserire l'arresto del raggio assicurandosi che il raggio sia dietro di esso. Sollevare lo schermo fluorescente e fare una breve esposizione sulla fotocamera.Ispezionare il modello di defrazione corrispondente, assicurandosi che il modello abbia punti acuti disposti regolarmente in colonne e righe. Salva le coordinate dei cristalli nell'interfaccia utente TEM o scrivendole, quindi ripeti lo screening di diffrazione per tutti i potenziali cristalli di interesse sul quadrato della griglia corrente. Centrare il cristallo schermato con un ingrandimento superiore a 1000x e regolare l'altezza centrica del cristallo utilizzando una routine automatica o a mano.Inserire l'apertura dell'area selezionata che meglio si adatta alle dimensioni e alla forma del cristallo. Inclinare lo stage nelle direzioni negativa e positiva fino a quando l'immagine non viene occlusa dalle barre della griglia. E nota questi angoli per scopi di raccolta dati leggendo i dati ogni secondo su una fotocamera moderna con una modalità di lettura rolling shutter.Impostare la velocità di rotazione specificando la percentuale della velocità massima di inclinazione e quando fermarsi nell'interfaccia utente del microscopio o nel software dedicato. Salva i dati in una varietà di formati dice singoli fotogrammi o come una pila di immagini. Un filmato di defrazione in formato cristallografico raccolto da microcristalli mostra un set di dati MicroED a rotazione continua da un microcristallo di carbamazepina identificato su una griglia TEM.Dopo la raccolta, l'integrazione e la soluzione della struttura dei dati, viene determinata una struttura ad alta risoluzione e la sua chiarezza dipende dalla qualità e dalla completezza dei dati. L'applicazione del campione alla griglia è fondamentale per acquisire dati validi. Seguendo questo metodo, i dati possono essere ulteriormente elaborati utilizzando un software cristallografico standard.Dimostrare che MicroED è un metodo potente per piccole molecole ha aperto il suo uso in tutto il mondo per risolvere nuove strutture di molecole di importanza critica.

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