Name: microcrystal electron diffraction of small molecules
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00
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Gonen 연구소는 Howard Hughes Medical Institute의 기금으로 지원됩니다. 이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health) P41GM136508의 지원을 받았다.

1. 소분자 시료 준비
<ol><li>소량(0.01 - 1 mg)의 분말, 액체 또는 고체를 작은 바이알이나 튜브에 옮깁니다.</li>
	<li>이미 분말 형태의 샘플의 경우 샘플이 필요할 때까지 캡을 사용하여 튜브를 밀봉합니다. 방법 1(단계 3) 또는 방법 2(단계 4)를 시도하기 전에 액체 샘플을 분말로 건조시킵니다. 참고: samples액체에 용해된 파일은 아래의 방법 3(5.X)을 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>2. TEM ?...

<ol>
	<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345 (2013).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED.">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li><li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector.">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li><li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+and+processing.">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP.">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109 (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size.">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking.">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel.">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li><li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination.">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li><li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation.">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li><li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-&#229;ngstr&#246;m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp.">Sub-&#229;ngstr&#246;m cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li><li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products.">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li><li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+with+SerialEM.">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS:+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED.">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li><li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography.">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+catalase+determined+by+MicroED.">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600 (2014).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED.">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li></ol>

시료 전처리는 일반적으로 스크리닝 및 데이터 수집 세션 후에 최적화가 이루어지는 반복적인 프로세스입니다. 소분자 샘플의 경우, 많은 의약품이 소수성인 경향이 있기 때문에 그리드를 글로우 방전하지 않고 그리드 준비를 먼저 시도하는 것이 종종 현명합니다10,11. 그리드에 나노 결정 침전물이 너무 적으면 그리드를 먼저 글로우 방전한 후 다시 시...

Microcrystal electron diffraction (MicroED)은 서브 마이크로미터 크기의 결정 1,2로부터 원자 분해능 구조를 결정하기 위한 전자 극저온 현미경(cryo-EM) 방법입니다. 결정은 표준 투과 전자 현미경 (TEM) 그리드에 적용되고 액체 에탄 또는 액체 질소에 뛰어 들어 동결됩니다. 그런 다음 그리드는 극저온에서 작동하는 TEM에 로드됩니다. 결정은 그리드에 위치하며 초기 회절 품질을 위해 스크리닝됩니다. 연속 회전 MicroED 데이터는 스크리닝된 결정의 하위 집합에서 수집되며, 여기서 데이터는 고속 카메라를 사용하여 동영상으로 저장됩니다3. 이들 영화는 표준 결정학 형식으로 변환되어 X선 결정학 실험과 거의 동일하게 처리된다4.
MicroED는 원래 단백질 미세 결정 1,2를 조사하기 위해 개발되었습니다. 단백질 결정학의 병목 현상은 전통적인 싱크로트론 X선 회절 실험을 위해 크고 잘 정돈된 결정을 성장시키는 것입니다. 전자가 X선보다 훨씬 더 강한 물질과 상호 작용하기 때문에 검출 가능한 회절을 생성하는 데 필요한 결정 크기의 한계는 상당히 작습니다5. 또한, 탄성 산란 사건에 대한 탄성 산란 사건의 비율은 전자에 더 유리하며, 이는 더 작은 전체 노출로 더 유용한 데이터를 수집할 수 있음을 시사한다5. 지속적인 개발로 인해 가장 까다로운 미세 결정 6,7,8,9에서 MicroED 데이터를 수집할 수 있었습니다.
최근에, MicroED는 겉보기에 비정질 물질로부터 소분자 의약품의 구조를 결정하기 위한 강력한 도구인 것으로 나타났다10,11,12,13. 이러한 분말은 구입한 시약 병, 정제 컬럼 또는 알약을 미세 분말로 분쇄하여 직접 얻을 수 있습니다10. 이 분말은 눈으로 볼 때 비정질로 보이지만 완전히 나노 결정으로 구성되거나 더 큰 비결정질, 비정질 분획에 미량의 나노 결정 침전물을 포함 할 수 있습니다. 그리드에 대한 물질의 적용은 용이하며, 결정 식별, 스크리닝 및 데이터 수집의 후속 단계는 가까운 장래에 자동화될 수도 있다(14). 다른 사람들은 샘플 준비 및 데이터 수집을 위해 다른 방법을 사용할 수 있지만, 여기에서는 MicroED 및 데이터 수집을 위한 소분자 샘플 준비를 위해 Gonen 실험실에서 개발 및 사용되는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td>Any vial or tube will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid clips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid C-rings</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbamazapine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4024-1G</td>
			<td>Any amount will suffice for these experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS based detector</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>CetaD 16M</td>
			<td>We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delphi software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU-D software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Commercial software for the acquisition of MicroED data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slides</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharger</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High PrecisionTweezers</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78325-AC</td>
			<td>Any high precision tweezer will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen vessel</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-800</td>
			<td>A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM software</td>
			<td>UC Boulder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Quantifoil/EMS</td>
			<td>Q310CMA</td>
			<td>Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transmission electron microscope (TEM)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman circular filter paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>90mm or larger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microcrystal electron diffraction of small molecules

미세결정 전자 회절(MicroED) 실험을 위한 소분자 샘플을 준비하기 위한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다. MicroED는 표준 전자 극저온 현미경(Cryo-EM) 장비를 사용하여 단백질 및 소분자의 구조를 해결하기 위해 개발되었습니다. 이러한 방식으로, 소분자, 펩티드, 가용성 단백질 및 막 단백질은 최근 고분해능으로 결정되었습니다. 카바마제핀이라는 약물을 예로 들어 소분자 의약품 그리드를 준비하기 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 데이터를 선별하고 수집하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 데이터 통합, 구조 결정 및 개선과 같은 전체 프로세스의 추가 단계는 다른 곳에서 제공됩니다. 소분자 그리드를 준비하는 데 필요한 시간은 30분 미만으로 추정됩니다.

MicroED는 전자와 물질 사이의 강한 상호 작용을 활용하는 cryoEM 방법으로, 사라지는 작은 결정12,13을 조사할 수 있습니다. 이러한 단계 후에, 미세결정으로부터 수집된 결정학적 형태의 회절 영화가 있을 것으로 예상된다(영화 1). 여기서, 이 기술은 카르바마제핀12를 사용하여 시연된다. 결과는 TEM 그리드에서 식별된 카르바?...

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Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

여기에서는 미세 결정 전자 회절(MicroED) 실험을 위한 소분자 결정 분말을 준비하기 위해 실험실에서 개발된 절차를 설명합니다.

작은 분자의 미세 결정 전자 회절

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

이 절차에서는 소분자 분말에서 3차원 구조로 몇 분 안에 진행하는 방법을 보여줍니다. 이것은 화학 커뮤니티를 위한 혁신적인 기술입니다. 많은 화합물은 쉽게 큰 결정으로 성장하지 않습니다.MicroED를 사용하면 나노미터 크기의 결정에서 원자 분해능 구조를 결정할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 UCLA의 교수 인 Mike Martynowycz 박사가 될 것입니다. 시작하려면 소량의 분말, 액체 또는 고체를 작은 바이알이나 튜브에 옮깁니다.이미 분말 형태의 샘플의 경우 샘플이 필요할 때까지 캡을 사용하여 튜브를 밀봉합니다. 유사하게, 액체 샘플을 분말로 건조시킨다. 유리 커버 슬라이드의 한쪽 끝에 플라스틱 필름을 감습니다.TEM 그리드를 갈색 탄소 면이 위를 향하도록 하여 커버 슬라이드 상단의 필름에 놓습니다. 그런 다음 그리드가 있는 슬라이드를 글로우 방전 챔버에 넣고 30피코암페어에서 음수 설정을 사용하여 약 15초 동안 커버 슬라이드를 글로우 방전합니다. 그리드에 샘플을 추가하기 전에 여과지가 늘어선 유리 페트리 접시 내부의 커버 슬라이드에 그리드를 보관하십시오.핀셋을 사용하여 덮인 페트리 접시에서 글로우 방전 TEM 그리드를 제거하고 탄소 면이 위를 향하도록 하여 원형 여과지에 놓습니다. 작은 주걱을 사용하여 아주 작은 스쿱의 분말을 제거하고 여과지의 TEM 그리드 바로 옆에 있는 작은 정사각형 유리 커버 슬립에 놓습니다. 분말 위에 또 다른 작은 정사각형 유리 슬라이드 또는 커버 슬립을 놓습니다.손가락으로 두 개의 유리 슬라이드를 부드럽게 문질러 미세한 가루를 만듭니다. 커버 슬립의 각도를 조정하고 여과지의 TEM 그리드 바로 위에 배치하고 글로우 방전 TEM 그리드 바로 위에 커버 슬립을 계속 문지릅니다. 분말이 그리드 쪽으로 떨어지는지 관찰합니다.두 개의 유리 커버 슬립 중 하나를 제거하여 잘게 분쇄된 분말을 추출합니다. 그런 다음 여과지를 사용하여 덮개 슬립에서 미세 분말을 TEM 그리드로 부드럽게 털어냅니다. 핀셋 세트를 사용하여 TEM 그리드의 가장자리를 잡고 팁이 그리드 사각형에 구멍을 뚫지 않도록 합니다.그리드를 여과지 위로 1-2cm 들어 올리고 그리드를 아래 용지에 대해 90도 각도로 기울입니다. 그리드를 단단히 핀셋으로 유지하면서 핀셋을 부드럽게 두드려 느슨한 가루를 제거합니다. 그리드가 있는 핀셋 끝을 손으로 액체 질소 용기에 직접 움직여 그리드를 얼리고 그리드와 핀셋이 끓는 것을 멈출 때까지 기다립니다.액체 질소 하에서, 샘플이 탄소 지지 필름 전에 빔에 부딪히도록 탄소 측면이 방향이 되도록 샘플 홀더에 그리드를 놓습니다. 샘플 홀더를 TEM에 로드하여 그리드가 항상 액체 질소 온도로 유지되도록 합니다. 자동 로더 시스템의 경우, 잘린 그리드를 액체 질소 냉각 용기의 카세트에 넣으면 자동 로더 로봇이 자동 로더와 컬럼 사이를 이동할 수 있도록 샘플을 안전하게 유지하면서 카세트를 수용할 수 있습니다.TEM 컬럼 밸브를 열고 핸드 패널을 사용하여 가능한 가장 낮은 배율로 배율을 조정합니다. 형광 스크린에 둥글고 밝은 영역이 보이도록 핸드 패널의 강도 노브를 조정하여 빔을 찾습니다. 고해상도 MicroED 데이터를 수집하기 전에 적절한 소프트웨어를 사용하여 저배율의 모든 그리드 아틀라스를 사용하여 현미경이 저배율 및 고배율 이미징 모두에 대해 잘 정렬되도록 합니다.필름에 깨진 탄소와 눈에 띄는 검은색 또는 어두운 입자가 없는 격자 사각형을 식별합니다. 핸드 패널의 조이스틱을 사용하여 물리적으로 그리드를 탐색하거나 수집된 아틀라스에서 가상으로 그리드를 탐색하여 깨지지 않고 미세 결정이 포함된 그리드 사각형을 검색합니다. 이러한 각 사각형의 중심을 조사를 위해 그리드 위치 목록에 추가하면 현미경 사용자 인터페이스 또는 현미경 자동화 소프트웨어의 노트북에 추가할 수 있습니다.배율을 500에서 1300x 사이로 설정합니다. 저장된 각 그리드 위치에서 중심 높이를 조정하고 저장된 z-값을 기록된 위치로 업데이트합니다. 형광 화면이나 평면 카메라에서 그리드의 작은 검은 점이나 입자를 검색합니다.좋은 샘플은 종종 고배율에서 날카로운 모서리를 가지며 결정을 순서대로 암시합니다. 위치된 전위 수정을 화면 중앙으로 이동하고 TEM이 고배율 모드로 들어가도록 배율을 높입니다. 선택한 영역 조리개를 삽입하고 조리개를 더 크거나 작은 크기로 변경하여 선택한 영역이 크리스탈보다 커지도록 합니다.형광 스크린이 삽입되었는지 확인하는 TEM 핸드 패널의 굴절 버튼을 눌러 굴절 모드로 전환합니다. 확대 노브를 사용하여 가장자리가 옹스트롬 해상도 이상이 되도록 카메라 길이를 조정합니다. 중심 지점이 가능한 한 선명하고 작도록 회절 초점을 조정합니다.회절 이동 노브를 사용하여 중앙 빔을 형광 스크린의 중앙으로 이동합니다. 빔이 뒤에 있는지 확인하면서 빔 스톱을 삽입하십시오. 형광등을 들어 올리고 카메라에 짧은 노출을 취합니다.해당 굴절 패턴을 검사하여 패턴에 열과 행에 규칙적으로 배열된 날카로운 점이 있는지 확인합니다. TEM 사용자 인터페이스에 결정 좌표를 저장하거나 기록한 다음 현재 그리드 사각형에서 관심 있는 모든 잠재적 결정에 대해 회절 스크리닝을 반복합니다. 차폐된 크리스탈을 1000x보다 큰 배율로 중앙에 놓고 자동 루틴을 사용하거나 손으로 크리스탈의 중심 높이를 조정합니다.크리스탈 크기와 모양에 가장 잘 맞는 선택한 영역 조리개를 삽입합니다. 스테이지를 음수 및 양수 방향으로 기울여 이미지가 격자 막대에 의해 가려질 때까지 진행합니다. 그리고 롤링 셔터 판독 모드가 있는 최신 카메라에서 1초마다 데이터를 읽어 데이터 수집을 위해 이러한 각도를 기록해 두십시오.현미경 사용자 인터페이스 또는 전용 소프트웨어에서 최대 틸트 속도의 백분율과 정지 시점을 지정하여 회전 속도를 설정합니다. 데이터를 다양한 형식으로 저장하면 개별 프레임 또는 이미지 스택으로 저장됩니다. 마이크로 결정에서 수집된 결정학적 형식의 굴절 영화는 TEM 그리드에서 식별된 카르바마제핀 마이크로 결정의 연속 회전 MicroED 데이터 세트를 보여줍니다.데이터 수집, 통합 및 구조 솔루션 후 고해상도 구조가 결정되며 그 명확성은 데이터의 품질과 완전성에 달려 있습니다. 그리드에 샘플을 적용하는 것은 좋은 데이터를 얻는 데 중요합니다. 이 방법에 따라 표준 결정학 소프트웨어를 사용하여 데이터를 추가로 처리할 수 있습니다.MicroED가 소분자에 대한 강력한 방법임을 입증함으로써 매우 중요한 분자의 새로운 구조를 해결하는 데 전 세계적으로 사용되었습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

단백질 결정의 미세 결정학 및<em&gt; 셀룰로에서</em&gt; 회절

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연구

생화학

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단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

전세포 극저온-전자 단층 촬영 워크플로우 내의 직접 세포 위치지정에 마이크로패턴 전송 전자 현미경 검사기 그리드

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...