Name: microcrystal electron diffraction of small molecules
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules at JoVE.com

Gonen-laboratoriet støttes av midler fra Howard Hughes Medical Institute. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health P41GM136508.

1. Forberedelse av små molekylprøver
<ol><li>Overfør en liten mengde (0,01 - 1 mg) pulver, væske eller faste stoffer til et lite hetteglass eller rør.</li>
	<li>For prøver som allerede er i pulverform, forsegl røret med hetten til prøven er nødvendig. Tørk væskeprøvene i pulver før forsøk på metode 1 (trinn 3) eller 2 (trinn 4). MERK: Prøver oppløst i væske kan bruke metode 3 (5.X) nedenfor</li>
</ol>2. Klargjøre TEM-nett
MERK: Noen TEM-er med auto...

<ol>
	<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345 (2013).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED.">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li><li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector.">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li><li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+and+processing.">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP.">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109 (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size.">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking.">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel.">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li><li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination.">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li><li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation.">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li><li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-&#229;ngstr&#246;m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp.">Sub-&#229;ngstr&#246;m cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li><li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products.">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li><li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+with+SerialEM.">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS:+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED.">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li><li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography.">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+catalase+determined+by+MicroED.">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600 (2014).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED.">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li></ol>

Prøvepreparering er vanligvis en iterativ prosess, der optimaliseringer gjøres etter økter med screening og datainnsamling. For småmolekylære prøver er det ofte klokt å først forsøke klargjøring av nettet uten å glødetømme ristene, siden mange legemidler har en tendens til å være hydrofobe10,11. Hvis ristene har for få nanokrystallinske avsetninger, er det en god ide å prøve igjen etter først å ha utladet ristene. Det kan være slik at krystal...

Mikrokrystallelektrondiffraksjon (MicroED) er en elektronkryomikroskopi (kryo-EM) metode for bestemmelse av atomoppløsningsstrukturer fra krystallermed submikrometerstørrelse 1,2. Krystaller påføres standard transmisjonselektronmikroskop (TEM) gitter og fryses ved enten å stupe inn i flytende etan eller flytende nitrogen. Rutenett lastes deretter inn i en TEM som opererer ved kryogene temperaturer. Krystaller er plassert på rutenettet og skjermet for innledende diffraksjonskvalitet. Kontinuerlig rotasjon MicroED-data samles inn fra en delmengde av de skjermede krystallene, der dataene lagres ved hjelp av et raskt kamera som en film3. Disse filmene konverteres til et standard krystallografisk format og behandles nesten identisk som et røntgenkrystallografieksperiment4.
MicroED ble opprinnelig utviklet for å undersøke proteinmikrokrystaller 1,2. En flaskehals i proteinkrystallografi vokser store, velordnede krystaller for tradisjonelle synkrotronrøntgendiffraksjonseksperimenter. Som elektroner interagerer med materieordener av størrelse sterkere enn røntgenstråler, er begrensningene av krystallstørrelsen som trengs for å produsere detekterbar diffraksjon betydelig mindre5. I tillegg er forholdet mellom elastiske og uelastiske spredningshendelser gunstigere for elektroner, noe som tyder på at mer nyttige data kan samles med en mindre total eksponering5. Konstant utvikling har gjort det mulig å samle inn MicroED-data fra de mest utfordrende mikrokrystallene 6,7,8,9.
Nylig har MicroED vist seg å være et kraftig verktøy for å bestemme strukturer av småmolekylære legemidler fra tilsynelatende amorfe materialer10,11,12,13. Disse pulverene kan komme rett fra en flaske kjøpt reagens, en rensekolonne, eller til og med fra å knuse en pille til et fint pulver10. Disse pulverene virker amorfe ved øyet, men kan enten være helt sammensatt av nanokrystaller eller bare inneholde spor av nanokrystallinske avsetninger i en større ikke-krystallinsk, amorf fraksjon. Påføring av materialet til rutenettet er lettvint, og de påfølgende trinnene med krystallidentifikasjon, screening og datainnsamling kan til og med bli automatisert i nær fremtid14. Mens andre kan bruke forskjellige metoder for prøvepreparering og datainnsamling, er protokollene utviklet og brukt i Gonen-laboratoriet for fremstilling av prøver av små molekyler for MicroED og for datainnsamling detaljert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td>Any vial or tube will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid clips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid C-rings</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbamazapine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4024-1G</td>
			<td>Any amount will suffice for these experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS based detector</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>CetaD 16M</td>
			<td>We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delphi software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU-D software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Commercial software for the acquisition of MicroED data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slides</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharger</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High PrecisionTweezers</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78325-AC</td>
			<td>Any high precision tweezer will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen vessel</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-800</td>
			<td>A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM software</td>
			<td>UC Boulder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Quantifoil/EMS</td>
			<td>Q310CMA</td>
			<td>Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transmission electron microscope (TEM)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman circular filter paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>90mm or larger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microcrystal electron diffraction of small molecules

En detaljert protokoll for fremstilling av små molekylprøver for mikrokrystallelektrondiffraksjon (MicroED) eksperimenter er beskrevet. MicroED er utviklet for å løse strukturer av proteiner og små molekyler ved hjelp av standard elektronkryomikroskopi (cryo-EM) utstyr. På denne måten har små molekyler, peptider, oppløselige proteiner og membranproteiner nylig blitt bestemt til høye oppløsninger. Protokoller presenteres her for å forberede rutenett av småmolekylære legemidler ved bruk av stoffet karbamazepin som et eksempel. Protokoller for screening og innsamling av data presenteres. Flere trinn i den generelle prosessen, for eksempel dataintegrering, strukturbestemmelse og forbedring, presenteres andre steder. Tiden det tar å klargjøre småmolekylære rister er estimert til å være mindre enn 30 min.

MicroED er en cryoEM-metode som utnytter de sterke interaksjonene mellom elektroner og materie, noe som muliggjør undersøkelse av forsvinnende små krystaller12,13. Etter disse trinnene forventes det å ha en diffraksjonsfilm i krystallografisk format samlet fra mikrokrystaller (film 1). Her er teknikken demonstrert ved bruk av karbamazepin12. Resultatene viser et kontinuerlig rotasjons MicroED-datasett fra en karbamazep...

Watch this Scientific Journal Video about Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules at JoVE.com

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Her beskriver vi prosedyrene utviklet i vårt laboratorium for fremstilling av pulver av småmolekylære krystaller for mikrokrystallelektrondiffraksjon (MicroED) eksperimenter.

Mikrokrystallelektrondiffraksjon av små molekyler

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

I denne prosedyren viser vi hvordan du går videre fra et lite molekylpulver til en tredimensjonal struktur på få minutter. Dette er en transformativ teknikk for kjemisamfunnet. Mange forbindelser vokser ikke lett til store krystaller.Med MicroED kan vi bestemme atomoppløsningsstrukturer fra krystaller på nanometerstørrelse. Demonstrere prosedyren vil være Dr.Mike Martynowycz som er professor ved UCLA. For å begynne, overfør en liten mengde pulver, væske eller faste stoffer til et lite hetteglass eller rør.For prøver som allerede er i pulverform, forsegl røret med hetten til prøven er nødvendig. Tørk på samme måte væskeprøvene i pulver. Pakk plastfilmen rundt den ene enden av et glassdeksel.Plasser TEM-rutenettene på filmen på toppen av dekselet med den brune fargekarbonsiden vendt oppover. Plasser deretter lysbildet med rister i glødeutladningskammeret og lad dekselet i ca. 30 sekunder ved å bruke den negative innstillingen ved 15 picoampere. Oppbevar ristene på dekselet lysbildet inne i et glass petriskål foret med filterpapir før du legger prøven til rutenettene.Fjern TEM-gitteret for glødeutladning fra den dekkede petriskålen ved hjelp av pinsett og legg den på et sirkulært filterpapir med karbonsiden vendt oppover. Bruk en liten slikkepott til å fjerne en veldig liten skje med pulver og legg den på en liten firkantet glassdekselslip like ved siden av TEM-rutenettet på filterpapiret. Legg en annen liten firkantet glassglass eller deksel slip på toppen av pulveret.Med fingrene gned du forsiktig de to glassglassene sammen for å lage et fint pulver. Vinkle deksellappene og plasser dem rett over TEM-rutenettet på filterpapiret og fortsett å gni dekselglidningene sammen bare noen få centimeter over det utladede TEM-rutenettet. Vær oppmerksom på om pulveret faller mot risten.Avdekk det finmalte pulveret ved å fjerne en av de to glassdekselslippene. Børst deretter det fine pulveret forsiktig av fra dekselet på TEM-rutenettet med et stykke filterpapir. Ta tak i kanten av TEM-rutenettet ved hjelp av et sett med pinsett, slik at spissene ikke punkterer noen av rutenettrutene.Løft rutenettet en til to centimeter over filterpapiret og vinkle rutenettet 90 grader mot papiret under. Bank forsiktig på pinsetten mens du holder risten godt pinset for å fjerne løst pulver. Frys risten ved å flytte spissen av pinsetten med risten direkte inn i en beholder med flytende nitrogen for hånd og vent til risten og pinsetten slutter å koke.Under flytende nitrogen plasserer du rutenettet i prøveholderen med karbonsiden orientert slik at prøven vil bli truffet av strålen før karbonstøttefilmen. Legg prøveholderen i TEM, og sørg for at risten alltid holdes ved flytende nitrogentemperaturer. For autolastersystemer, plasser de klippede ristene i en kassett i en flytende nitrogenkjølt beholder, noe som gjør at billasterrobotikken kan godta kassetten mens prøvene holdes trygge for skytteltrafikk mellom billasteren og kolonnen.Åpne TEM-kolonneventilene og juster forstørrelsen ved hjelp av håndpanelene til lavest mulig forstørrelse. Finn strålen ved å justere intensitetsknappen på håndpanelene slik at et rundt lyst område er synlig på lysstoffrørskjermen. Ta et all grid-atlas ved lav forstørrelse ved hjelp av passende programvare som sikrer at mikroskopet er godt justert for både lav og høy forstørrelse før du samler inn høyoppløselige MicroED-data.Identifiser rutenett uten ødelagt karbon og synlige svarte eller mørke korn på filmen. Naviger rundt i rutenettet enten fysisk ved hjelp av joysticken på håndpanelene eller virtuelt på det innsamlede atlaset for å søke etter rutenett som ikke er ødelagt og inneholder mikrokrystaller. Legg til midten av hver av disse rutene i en liste over rutenettplasseringer for undersøkelse, som kan legges til en notatbok i mikroskopets brukergrensesnitt eller i programvaren for automatisering av mikroskop.Angi forstørrelsen mellom 500 og 1300x. Juster sentriske høyden på hver lagrede rutenettplassering og oppdater den lagrede z-verdien til de angitte posisjonene. Søk enten på fluorescerende skjerm eller på et flatt kamera for små svarte flekker eller korn på rutenettet.En god prøve vil ofte ha skarpe kanter ved høy forstørrelse som tyder på krystall i rekkefølge. Flytt en plassert potensiell krystall til midten av skjermen og øk forstørrelsen slik at TEM går inn i høy forstørrelsesmodus. Sett inn en valgt områdeåpning og endre blenderåpningen til en større eller mindre størrelse for å sikre at det valgte området er større enn krystallen.Bytt til defraksjonsmodus ved å trykke på brytningsknappen på TEM-håndpanelene, og forsikre deg om at lysstoffrøret er satt inn. Juster kameralengden med forstørrelsesknappen slik at kanten har minst én angstromoppløsning. Juster diffraksjonsfokuset slik at det sentrale punktet er så skarpt og lite som mulig.Bruk diffraksjonsskiftknappene til å flytte sentralstrålen til midten av lysstoffrøret. Sett inn strålestoppet og sørg for at strålen er bak den. Løft den fluorescerende skjermen og ta en kort eksponering på kameraet.Inspiser det tilsvarende brytningsmønsteret, og sørg for at mønsteret har skarpe flekker som regelmessig ordnes i kolonner og rader. Lagre krystallkoordinatene i enten TEM-brukergrensesnittet eller ved å skrive dem ned, og gjenta deretter diffraksjonsscreening for alle potensielle krystaller av interesse på gjeldende rutenett. Sentrer den skjermede krystallen ved en forstørrelse større enn 1000x og juster den sentriske høyden på krystallen ved hjelp av enten en automatisk rutine eller for hånd.Sett inn det valgte området blenderåpning som passer best til krystall størrelse og form. Vipp scenen i negativ og positiv retning til bildet er okkludert av rutenettstolpene. Og legg merke til disse vinklene for datainnsamlingsformål ved å lese dataene ut hvert sekund på et moderne kamera med rullende lukkeravlesningsmodus.Still inn rotasjonshastigheten ved å spesifisere prosentandelen av maksimal tilthastighet og når du skal stoppe i mikroskopets brukergrensesnitt eller dedikert programvare. Lagre dataene i en rekke formater, sier enten individuelle rammer eller som en stabel med bilder. En brytningsfilm i krystallografisk format samlet fra mikrokrystaller viser et kontinuerlig rotasjonsmikroED-datasett fra en karbamazepin mikrokrystall identifisert på et TEM-rutenett.Etter datainnsamling, integrasjon og strukturløsning bestemmes en høyoppløselig struktur, og klarheten avhenger av kvaliteten og fullstendigheten til dataene. Bruk av prøven i rutenettet er avgjørende for å samle inn gode data. Etter denne metoden kan dataene behandles videre ved hjelp av standard krystallografisk programvare.Demonstrere at MicroED er en kraftig metode for små molekyler har åpnet sin bruk over hele verden for å løse nye strukturer av kritisk viktige molekyler.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Mikrokrystallografi av proteinkrystaller og<em&gt; I Cellulo</em&gt; Diffraksjon

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Tvinge spektroskopi enkelt Protein molekyler med en Atomic Force mikroskopet

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatisert Biopanning av bakteriell vise bibliotekene for peptid affinitet reagens oppdagelsen og analyse av resulterende isolerer

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Fange samhandling Kinetics en Ion kanal protein med små molekyler av Bio-lags Interferometry analysen

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse av β-Amyloid-indusert unormalt Fibrin Clot struktur av spektroskopi og skanning elektronmikroskop

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molekylet Tracking mikroskopi-et verktøy for fastsettelse av Diffusive statene cytosolic molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Forbereder lameller fra glassaktige biologiske prøver ved hjelp av et dual-beam skanning elektronmikroskop for kryo-elektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikropattering overføring elektronmikroskopinett til direkte celleposisjonering i hele celler Cryo-Electron Tomography Arbeidsflyter

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...