Name: microcrystal electron diffraction of small molecules
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules at JoVE.com

Лаборатория Гонена поддерживается средствами Медицинского института Говарда Хьюза. Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения P41GM136508.

1. Подготовка образцов малых молекул
<ol><li>Переведите небольшое количество (0,01 - 1 мг) порошка, жидкости или твердых веществ в небольшой флакон или пробирку.</li>
	<li>Для образцов, уже находящихся в виде порошка, запечатайте пробирку с помощью колпачка до тех пор, пока образец не понадобится. ?...

<ol>
	<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345 (2013).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED.">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li><li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector.">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li><li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+and+processing.">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP.">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109 (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size.">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking.">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel.">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li><li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination.">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li><li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation.">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li><li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-&#229;ngstr&#246;m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp.">Sub-&#229;ngstr&#246;m cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li><li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products.">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li><li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+with+SerialEM.">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS:+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED.">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li><li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography.">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+catalase+determined+by+MicroED.">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600 (2014).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED.">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li></ol>

Пробоподготовка обычно представляет собой итеративный процесс, при котором оптимизация производится после сеансов скрининга и сбора данных. Для низкомолекулярных образцов часто целесообразно сначала попытаться получить решетку без тлеющей разрядки решеток, поскольку многие фармац...

Микрокристаллическая дифракция электронов (MicroED) - это метод электронной криомикроскопии (крио-ЭМ) для определения структур атомного разрешения из кристаллов субмикрометрового размера 1,2. Кристаллы наносятся на сетки стандартного просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) и замораживаются путем погружения в жидкий этан или жидкий азот. Затем решетки загружаются в ПЭМ, работающую при криогенных температурах. Кристаллы располагаются на сетке и экранируются на начальное дифракционное качество. Данные MicroED непрерывного вращения собираются из подмножества экранированных кристаллов, где данные сохраняются с помощью быстрой камеры в виде видеоролика3. Эти фильмы преобразуются в стандартный кристаллографический формат и обрабатываются почти так же, как эксперимент по рентгеновской кристаллографии4.
MicroED был первоначально разработан для исследования белковых микрокристаллов 1,2. Узким местом в кристаллографии белков является выращивание больших, хорошо упорядоченных кристаллов для традиционных экспериментов по синхротронной рентгеновской дифракции. Поскольку электроны взаимодействуют с веществом на порядки сильнее, чем рентгеновские лучи, ограничения размера кристалла, необходимого для получения обнаруживаемой дифракции, значительно меньше5. Кроме того, соотношение событий упругого и неупругого рассеяния более благоприятно для электронов, что позволяет предположить, что при меньшем общем воздействии можно собрать больше полезных данных5. Постоянные разработки позволили собирать данные MicroED из самых сложных микрокристаллов 6,7,8,9.
Недавно было показано, что MicroED является мощным инструментом для определения структур низкомолекулярных фармацевтических препаратов из явно аморфных материалов10,11,12,13. Эти порошки могут поступать прямо из бутылки с покупным реагентом, очистительной колонки или даже из измельчения таблетки в мелкий порошок10. Эти порошки кажутся аморфными на глаз, но могут либо полностью состоять из нанокристаллов, либо просто содержать следовые количества нанокристаллических отложений в большей некристаллической, аморфной фракции. Нанесение материала на сетку является простым, и последующие этапы идентификации кристаллов, скрининга и сбора данных могут быть даже автоматизированы в ближайшем будущем14. В то время как другие могут использовать другие методы для подготовки образцов и сбора данных, здесь подробно описаны протоколы, разработанные и используемые в лаборатории Гонена для подготовки образцов малых молекул для MicroED и для сбора данных.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td>Any vial or tube will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid clips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid C-rings</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbamazapine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4024-1G</td>
			<td>Any amount will suffice for these experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS based detector</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>CetaD 16M</td>
			<td>We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delphi software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU-D software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Commercial software for the acquisition of MicroED data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slides</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharger</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High PrecisionTweezers</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78325-AC</td>
			<td>Any high precision tweezer will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen vessel</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-800</td>
			<td>A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM software</td>
			<td>UC Boulder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Quantifoil/EMS</td>
			<td>Q310CMA</td>
			<td>Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transmission electron microscope (TEM)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman circular filter paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>90mm or larger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microcrystal electron diffraction of small molecules

Описан подробный протокол подготовки образцов малых молекул для экспериментов по дифракции электронов микрокристаллов (MicroED). MicroED был разработан для решения структур белков и малых молекул с использованием стандартного оборудования электронной криомикроскопии (крио-ЭМ). Таким образом, небольшие молекулы, пептиды, растворимые белки и мембранные белки недавно были определены с высоким разрешением. Представлены протоколы подготовки сеток низкомолекулярных лекарственных препаратов на примере препарата карбамазепин. Представлены протоколы скрининга и сбора данных. Дополнительные этапы общего процесса, такие как интеграция данных, определение структуры и уточнение, представлены в другом разделе. Время, необходимое для подготовки низкомолекулярных сеток, оценивается менее чем в 30 минут.

MicroED - это метод криоЭМ, который использует сильные взаимодействия между электронами и веществом, что позволяет исследовать исчезающе малые кристаллы12,13. Ожидается, что после этих этапов будет получен дифракционный фильм в кристаллографическом формате, ...

Watch this Scientific Journal Video about Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules at JoVE.com

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Здесь мы описываем разработанные в нашей лаборатории процедуры получения порошков низкомолекулярных кристаллов для экспериментов по дифракции электронов микрокристаллов (MicroED).

Микрокристаллическая дифракция электронов малых молекул

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

В этой процедуре мы покажем, как за считанные минуты перейти от мелкомолекулярного порошка к трехмерной структуре. Это преобразующий метод для химического сообщества. Многие соединения нелегко превращаются в крупные кристаллы.С помощью MicroED мы можем определять структуры с атомным разрешением из кристаллов нанометрового размера. Продемонстрирует процедуру доктор Майк Мартынович, профессор Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе. Для начала перелейте небольшое количество порошка, жидкости или твердых веществ в небольшой флакон или тюбик.Для образцов, уже находящихся в виде порошка, запечатайте пробирку с помощью колпачка до тех пор, пока образец не понадобится. Точно так же высушите жидкие образцы в порошки. Оберните полиэтиленовую пленку вокруг одного конца предметного стекла.Поместите сетки ПЭМ на пленку поверх покровного стекла карбоновой стороной коричневого цвета вверх. Затем поместите предметное стекло с решетками в камеру тлеющего разряда и нагнетайте свечение защитного стекла в течение примерно 30 секунд, используя отрицательную настройку на 15 пикоампер. Храните решетки на покровном предметном стекле внутри стеклянной чашки Петри, выстланной фильтровальной бумагой, прежде чем добавлять образец в сетки.Снимите решетку ПЭМ тлеющего разряда с закрытой чашки Петри с помощью пинцета и поместите ее на круглую фильтровальную бумагу карбоновой стороной вверх. С помощью небольшого шпателя удалите очень маленькую ложку порошка и поместите ее на небольшую квадратную стеклянную крышку рядом с сеткой ТЕМ на фильтровальной бумаге. Поместите еще одно небольшое квадратное предметное стекло или защитное стекло поверх порошка.Пальцами аккуратно потрите два предметных стекла друг о друга, чтобы получился мелкий порошок. Наклоните накладки крышки и расположите их чуть выше сетки ПЭМ на фильтровальной бумаге и продолжайте тереть шликеры друг о друга всего в нескольких сантиметрах над разряженной сеткой ПЭМ. Наблюдайте, падает ли порошок на сетку.Раскройте мелко измельченный порошок, сняв одно из двух шликеров стеклянной крышки. Затем аккуратно смахните мелкий порошок с крышки, нанесите на сетку ПЭМ с помощью кусочка фильтровальной бумаги. Возьмитесь за край сетки ПЭМ с помощью набора пинцетов, убедившись, что кончики не проколют ни один из квадратов сетки.Поднимите сетку на один-два сантиметра над фильтровальной бумагой и наклоните сетку под углом 90 градусов к бумаге внизу. Аккуратно постучите по пинцету, удерживая сетку плотно прижатым, чтобы удалить рассыпчатый порошок. Заморозьте решетку, переместив кончик пинцета с сеткой прямо в емкость с жидким азотом вручную, и подождите, пока сетка и пинцет не перестанут кипеть.Под жидким азотом поместите решетку в держатель образца так, чтобы углеродная сторона была ориентирована таким образом, чтобы образец был поражен лучом перед углеродной опорной пленкой. Загрузите держатель образца в ПЭМ, убедившись, что решетка всегда поддерживается при температуре жидкого азота. Для систем автоматического загрузчика поместите обрезанные решетки в кассету в контейнере с жидким азотом, что позволяет робототехнике автопогрузчика принимать кассету, сохраняя при этом образцы безопасными для перемещения между автозагрузчиком и колонной.Откройте клапаны колонны ТЭМ и отрегулируйте увеличение с помощью ручных панелей на минимально возможное увеличение. Найдите луч, отрегулировав ручку интенсивности на ручных панелях так, чтобы на флуоресцентном экране была видна круглая яркая область. Возьмите атлас всей сетки с малым увеличением с помощью соответствующего программного обеспечения, убедившись, что микроскоп хорошо выровнен как для малого, так и для большого увеличения, прежде чем собирать данные MicroED с высоким разрешением.Определите квадраты сетки без разрушенного углерода и видимых черных или темных зерен на пленке. Перемещайтесь по сетке либо физически с помощью джойстика на ручных панелях, либо виртуально по собранному атласу для поиска квадратов сетки, которые не разбиты и содержат микрокристаллы. Добавьте центр каждого из этих квадратов в список мест расположения сетки для исследования, который можно добавить в записную книжку в пользовательском интерфейсе микроскопа или в программном обеспечении автоматизации микроскопа.Установите увеличение от 500 до 1300x. Отрегулируйте центрическую высоту в каждом месте сохраненной сетки и обновите сохраненное z-значение до отмеченных позиций. Ищите на флуоресцентном экране или на плоской камере небольшие черные пятна или зерна на сетке.Хороший образец часто будет иметь острые края при большом увеличении, предполагая, что кристалл в порядке. Переместите расположенный потенциальный кристалл в центр экрана и увеличьте увеличение таким образом, чтобы ПЭМ перешел в режим большого увеличения. Вставьте выбранную область апертуры и измените диафрагму на больший или меньший размер, чтобы убедиться, что выбранная область больше, чем кристалл.Переключитесь в режим дефракции, нажав кнопку дефракции на ручных панелях ПЭМ, убедившись, что люминесцентный экран вставлен. Отрегулируйте длину камеры с помощью ручки увеличения таким образом, чтобы разрешение края было не менее одного ангстрема. Отрегулируйте дифракционный фокус таким образом, чтобы центральное пятно было как можно более резким и маленьким.С помощью ручек дифракционного сдвига переместите центральный луч в центр флуоресцентного экрана. Вставьте упор балки, убедившись, что балка находится позади нее. Поднимите флуоресцентный экран и сделайте короткую выдержку на камере.Осмотрите соответствующий паттерн дефракции, убедившись, что в узоре будут острые пятна, которые регулярно располагаются в столбцах и строках. Сохраните координаты кристаллов либо в пользовательском интерфейсе ПЭМ, либо записав их, а затем повторите дифракционный скрининг для всех интересующих потенциальных кристаллов на текущем квадрате сетки. Отцентрируйте экранированный кристалл с увеличением более 1000x и отрегулируйте центрическую высоту кристалла с помощью автоматической процедуры или вручную.Вставьте выбранную область апертуры, которая наилучшим образом соответствует размеру и форме кристалла. Наклоняйте сцену в отрицательном и положительном направлениях до тех пор, пока изображение не будет закрыто полосами сетки. И обратите внимание на эти углы для целей сбора данных, считывая данные каждую секунду на современной камере с режимом считывания со скользящим затвором.Установите скорость вращения, указав процент от максимальной скорости наклона и время остановки в пользовательском интерфейсе микроскопа или в специальном программном обеспечении. Сохранять данные в различных форматах можно либо в отдельных кадрах, либо в виде стопки изображений. Фильм о преломлении в кристаллографическом формате, собранный из микрокристаллов, показывает набор данных MicroED непрерывного вращения из микрокристалла карбамазепина, идентифицированного на сетке ПЭМ.После сбора, интеграции и структурного решения данных определяется структура с высоким разрешением, от качества и полноты которых зависит ее четкость. Применение выборки к сетке имеет решающее значение для получения достоверных данных. Следуя этому методу, данные могут быть дополнительно обработаны с использованием стандартного кристаллографического программного обеспечения.Демонстрация того, что MicroED является мощным методом для малых молекул, открыла его использование во всем мире для решения новых структур критически важных молекул.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Микрокристаллизация кристаллов белков и<em&gt; Разное</em&gt; Дифракция

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Спектроскопия силы одного белковых молекул с помощью атомно-силового микроскопа

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Полуавтоматическая Biopanning бактериальной отображения библиотек пептид сродство реагент обнаружения и анализа результате изолятов

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Захват кинетика взаимодействия ионного канала белка с малых молекул в Assay интерферометрии био слоя

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Анализ отклонений β-амилоид индуцированной фибринового сгустка структуры спектроскопии и растровая электронная микроскопия

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Одномолекулярная слежение за микроскопией - инструмент для определения диффузивных состояний цитосолильных молекул

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Получение ламелей из биологических образцов стекловидного тела с помощью двухлучевого сканирующего электронного микроскопа для криоэлектронной томографии

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Микроструктурирование просвечивающих электронных микроскопических сеток для прямого позиционирования клеток в рабочих процессах криоэлектронной томографии цельноклеточной криоэлектронной томографии

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...