Name: microcrystal electron diffraction of small molecules
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00
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El laboratorio Gonen cuenta con el apoyo de fondos del Instituto Médico Howard Hughes. Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud P41GM136508.

1. Preparación de muestras de moléculas pequeñas
<ol><li>Transfiera una pequeña cantidad (0.01 - 1 mg) de polvo, líquido o sólidos a un vial o tubo pequeño.</li>
	<li>Para muestras que ya están en forma de polvo, selle el tubo con la tapa hasta que se necesite la muestra. Seque las muestras líquidas en polvos antes de intentar el método 1 (paso 3) o 2 (paso 4). NOTA: Las muestras disueltas en líquido pueden utilizar el método 3 (5.X) a continuación</li>
</ol>2. Preparación de cuad...

<ol>
	<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345 (2013).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED.">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li><li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector.">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li><li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+and+processing.">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP.">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109 (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size.">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking.">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel.">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li><li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination.">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li><li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation.">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li><li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-&#229;ngstr&#246;m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp.">Sub-&#229;ngstr&#246;m cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li><li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products.">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li><li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+with+SerialEM.">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS:+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED.">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li><li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography.">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+catalase+determined+by+MicroED.">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600 (2014).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED.">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li></ol>

La preparación de muestras suele ser un proceso iterativo, donde las optimizaciones se realizan después de sesiones de selección y recopilación de datos. Para muestras de moléculas pequeñas, a menudo es prudente intentar primero la preparación de la rejilla sin descargar las rejillas con resplandor, ya que muchos productos farmacéuticos tienden a ser hidrófobos10,11. Si las rejillas tienen muy pocos depósitos nanocristalinos, es una buena idea volver a ...

La difracción electrónica de microcristales (MicroED) es un método de criomicroscopía electrónica (crio-EM) para determinar estructuras de resolución atómica a partir de cristales de tamaño submicrométrico 1,2. Los cristales se aplican a las rejillas estándar del microscopio electrónico de transmisión (TEM) y se congelan sumergiéndolos en etano líquido o nitrógeno líquido. Luego, las rejillas se cargan en un TEM que opera a temperaturas criogénicas. Los cristales se ubican en la rejilla y se criban para la calidad de difracción inicial. Los datos MicroED de rotación continua se recopilan de un subconjunto de los cristales apantallados, donde los datos se guardan utilizando una cámara rápida como una película3. Estas películas se convierten a un formato cristalográfico estándar y se procesan casi idénticamente como un experimento de cristalografía de rayos X4.
MicroED fue desarrollado originalmente para investigar microcristales de proteínas 1,2. Un cuello de botella en la cristalografía de proteínas está creciendo cristales grandes y bien ordenados para experimentos tradicionales de difracción de rayos X de sincrotrón. Como los electrones interactúan con órdenes de magnitud de materia más fuertes que los rayos X, las limitaciones del tamaño del cristal necesario para producir difracción detectable son considerablemente menores5. Además, la relación de eventos de dispersión elástica a inelástica es más favorable para los electrones, lo que sugiere que se pueden recopilar datos más útiles con una exposición general más pequeña5. Los desarrollos constantes han permitido que los datos de MicroED se recopilen de los microcristales más desafiantes 6,7,8,9.
Recientemente, MicroED ha demostrado ser una herramienta poderosa para determinar las estructuras de productos farmacéuticos de moléculas pequeñas a partir de materiales aparentemente amorfos10,11,12,13. Estos polvos pueden provenir directamente de una botella de reactivo comprado, una columna de purificación o incluso de triturar una píldora en un polvo fino10. Estos polvos parecen amorfos a simple vista, pero pueden estar compuestos completamente de nanocristales o simplemente contener trazas de depósitos nanocristalinos en una fracción amorfa no cristalina mayor. La aplicación del material a la cuadrícula es fácil, y los pasos posteriores de identificación de cristales, cribado y recopilación de datos podrían incluso automatizarse en un futuro próximo14. Mientras que otros pueden utilizar diferentes métodos para la preparación de muestras y la recolección de datos, aquí se detallan los protocolos desarrollados y utilizados en el laboratorio de Gonen para preparar muestras de moléculas pequeñas para MicroED y para la recolección de datos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td>Any vial or tube will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid clips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid C-rings</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbamazapine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4024-1G</td>
			<td>Any amount will suffice for these experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS based detector</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>CetaD 16M</td>
			<td>We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delphi software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU-D software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Commercial software for the acquisition of MicroED data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slides</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharger</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High PrecisionTweezers</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78325-AC</td>
			<td>Any high precision tweezer will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen vessel</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-800</td>
			<td>A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM software</td>
			<td>UC Boulder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Quantifoil/EMS</td>
			<td>Q310CMA</td>
			<td>Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transmission electron microscope (TEM)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman circular filter paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>90mm or larger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microcrystal electron diffraction of small molecules

Se describe un protocolo detallado para preparar muestras de moléculas pequeñas para experimentos de difracción de electrones de microcristales (MicroED). MicroED se ha desarrollado para resolver estructuras de proteínas y moléculas pequeñas utilizando equipos de criomicroscopía electrónica estándar (crio-EM). De esta manera, moléculas pequeñas, péptidos, proteínas solubles y proteínas de membrana se han determinado recientemente a altas resoluciones. Aquí se presentan protocolos para preparar cuadrículas de productos farmacéuticos de moléculas pequeñas utilizando el medicamento carbamazepina como ejemplo. Se presentan protocolos para la selección y recopilación de datos. Los pasos adicionales en el proceso general, como la integración de datos, la determinación de la estructura y el refinamiento, se presentan en otra parte. El tiempo requerido para preparar las rejillas de moléculas pequeñas se estima en menos de 30 minutos.

MicroED es un método crioEM que aprovecha las fuertes interacciones entre electrones y materia, lo que permite la investigación de cristales muy pequeños12,13. Después de estos pasos, se espera tener una película de difracción en formato cristalográfico recolectada de microcristales (Película 1). Aquí, la técnica se demuestra utilizando carbamazepina12. Los resultados muestran un conjunto de datos MicroED de rota...

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Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Aquí, describimos los procedimientos desarrollados en nuestro laboratorio para preparar polvos de cristales de moléculas pequeñas para experimentos de difracción de electrones de microcristales (MicroED).

Difracción de electrones de microcristales de moléculas pequeñas

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

En este procedimiento, mostramos cómo proceder de un polvo de molécula pequeña a una estructura tridimensional en minutos. Esta es una técnica transformadora para la comunidad química. Muchos compuestos no crecen fácilmente en cristales grandes.Con MicroED, podemos determinar estructuras de resolución atómica a partir de cristales de tamaño nanométrico. Demostrando el procedimiento estará el Dr. Mike Martynowycz, profesor de UCLA. Para comenzar, transfiera una pequeña cantidad de polvo, líquido o sólidos a un pequeño vial o tubo.Para muestras que ya están en forma de polvo, selle el tubo con la tapa hasta que se necesite la muestra. Del mismo modo, seque las muestras líquidas en polvos. Envuelva la película de plástico alrededor de un extremo de un portaobjetos de cubierta de vidrio.Coloque las rejillas TEM en la película en la parte superior de la diapositiva de la cubierta con el lado de carbono de color marrón hacia arriba. Luego, coloque la diapositiva con rejillas en la cámara de descarga incandescente y descargue la corredera de cubierta durante aproximadamente 30 segundos utilizando el ajuste negativo a 15 picoamperios. Guarde las rejillas en el portaobjetos de la cubierta dentro de una placa de Petri de vidrio forrada con papel de filtro antes de agregar la muestra a las rejillas.Retire la rejilla TEM de descarga luminosa de la placa de Petri cubierta con pinzas y colóquela sobre un papel de filtro circular con el lado de carbono hacia arriba. Con una espátula pequeña, retire una cucharada muy pequeña de polvo y colóquela en un pequeño cubreobjetos de vidrio cuadrado justo al lado de la rejilla TEM en el papel de filtro. Coloque otro pequeño portaobjetos cuadrados de vidrio o un deslizamiento de cubierta encima del polvo.Con los dedos, frotó suavemente los dos portaobjetos de vidrio para hacer un polvo fino. Incline los cubreobjetos y colóquelos justo encima de la rejilla TEM en el papel de filtro y continúe frotando los cubreobjetos de cubierta unos pocos centímetros por encima de la rejilla TEM descargada con brillo. Observe si el polvo está cayendo hacia la rejilla.Destape el polvo finamente molido quitando uno de los dos trozos de cubierta de vidrio. Luego, cepille suavemente el polvo fino del deslizamiento de la cubierta sobre la rejilla TEM con un trozo de papel de filtro. Agarre el borde de la cuadrícula TEM con un conjunto de pinzas, asegurándose de que las puntas no perforen ninguno de los cuadrados de la cuadrícula.Levante la rejilla de uno a dos centímetros por encima del papel de filtro e incline la rejilla a 90 grados con respecto al papel de abajo. Golpee suavemente las pinzas mientras mantiene la rejilla firmemente pinzada para eliminar cualquier polvo suelto. Congele la rejilla moviendo la punta de las pinzas con la rejilla directamente a un recipiente de nitrógeno líquido a mano y espere hasta que la rejilla y las pinzas dejen de hervir.Bajo nitrógeno líquido, coloque la rejilla en el portamuestras con el lado de carbono orientado de tal manera que la muestra sea golpeada por el haz antes de la película de soporte de carbono. Cargue el portamuestras en el TEM asegurándose de que la rejilla siempre se mantenga a temperaturas de nitrógeno líquido. Para los sistemas de cargador automático, coloque las rejillas recortadas en un casete en un recipiente refrigerado por nitrógeno líquido, lo que permite que la robótica del cargador automático acepte el casete mientras mantiene las muestras seguras para el transporte entre el cargador automático y la columna.Abra las válvulas de columna TEM y ajuste el aumento con los paneles manuales al menor aumento posible. Encuentra el haz ajustando la perilla de intensidad en los paneles de mano de modo que un área redonda brillante sea visible en la pantalla fluorescente. Tome un atlas de cuadrícula a baja ampliación utilizando el software adecuado para garantizar que el microscopio esté bien alineado para imágenes de bajo y alto aumento antes de recopilar datos MicroED de alta resolución.Identifique cuadrados de cuadrícula sin carbono roto y granos negros u oscuros visibles en la película. Navegue por la cuadrícula ya sea físicamente usando el joystick en los paneles de mano o virtualmente en el atlas recopilado para buscar cuadrados de cuadrícula que no estén rotos y contengan microcristales. Agregue el centro de cada uno de estos cuadrados a una lista de ubicaciones de cuadrícula para investigación, que se puede agregar a un cuaderno en la interfaz de usuario del microscopio o en el software de automatización del microscopio.Ajuste el aumento entre 500 y 1300x. Ajuste la altura céntrica en cada ubicación de cuadrícula almacenada y actualice el valor z guardado a las posiciones anotadas. Busque en la pantalla fluorescente o en una cámara plana pequeños puntos negros o granos en la cuadrícula.Una buena muestra a menudo tendrá bordes afilados a gran aumento, lo que sugiere un cristal en orden. Mueva un cristal potencial localizado al centro de la pantalla y aumente el aumento de tal manera que el TEM entre en modo de aumento alto. Inserte una abertura de área seleccionada y cambie la apertura a un tamaño mayor o menor para asegurarse de que el área seleccionada sea más grande que el cristal.Cambie al modo de desfracción presionando el botón de desfracción en los paneles manuales TEM para asegurarse de que se inserte la pantalla fluorescente. Ajuste la longitud de la cámara con la perilla de ampliación de modo que el borde tenga al menos una resolución angstrom. Ajuste el enfoque de difracción de modo que el punto central sea lo más nítido y pequeño posible.Usando las perillas de desplazamiento de difracción, mueva el haz central hacia el centro de la pantalla fluorescente. Inserte el tope de viga asegurándose de que la viga esté detrás de ella. Levante la pantalla fluorescente y tome una exposición corta en la cámara.Inspeccione el patrón de desfracción correspondiente, asegurándose de que el patrón tenga puntos afilados que estén dispuestos regularmente en columnas y filas. Guarde las coordenadas cristalinas en la interfaz de usuario de TEM o escribiéndolas, luego repita la detección de difracción para todos los cristales potenciales de interés en el cuadrado de cuadrícula actual. Centra el cristal apantallado con un aumento superior a 1000x y ajusta la altura central del cristal usando una rutina automática o a mano.Inserte la abertura de área seleccionada que mejor se adapte al tamaño y la forma del cristal. Incline el escenario en las direcciones negativa y positiva hasta que la imagen esté ocluida por las barras de cuadrícula. Y tenga en cuenta estos ángulos para fines de recopilación de datos leyendo los datos cada segundo en una cámara moderna con un modo de lectura de obturador enrollable.Establezca la velocidad de rotación especificando el porcentaje de la velocidad de inclinación máxima y cuándo detenerse en la interfaz de usuario del microscopio o en el software dedicado. Guardar los datos en una variedad de formatos dice marcos individuales o como una pila de imágenes. Una película de desfracción en formato cristalográfico recolectada de microcristales muestra un conjunto de datos MicroED de rotación continua a partir de un microcristal de carbamazepina identificado en una cuadrícula TEM.Después de la recopilación de datos, la integración y la solución de estructura, se determina una estructura de alta resolución y su claridad depende de la calidad e integridad de los datos. La aplicación de la muestra a la cuadrícula es fundamental para adquirir buenos datos. Siguiendo este método, los datos se pueden procesar aún más utilizando un software cristalográfico estándar.Demostrar que MicroED es un método poderoso para moléculas pequeñas ha abierto su uso en todo el mundo para resolver nuevas estructuras de moléculas de importancia crítica.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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