Name: microcrystal electron diffraction of small molecules
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules at JoVE.com

Gonens laboratorium stöds av medel från Howard Hughes Medical Institute. Denna studie stöddes av National Institutes of Health P41GM136508.

1. Beredning av småmolekylära prover
<ol><li>Överför en liten mängd (0,01 - 1 mg) pulver, vätska eller fasta ämnen till en liten injektionsflaska eller slang.</li>
	<li>För prover som redan är i pulverform, försegla röret med locket tills provet behövs. Torka vätskeproverna till pulver före försök med metod 1 (steg 3) eller 2 (steg 4). OBS: Prover upplösta i vätska kan använda metod 3 (5.X) nedan</li>
</ol>2. Förbereda TEM-nät
Vissa TEM med autol...

<ol>
	<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345 (2013).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED.">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li><li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector.">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li><li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+and+processing.">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP.">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109 (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size.">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li><li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking.">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel.">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li><li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination.">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li><li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation.">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li><li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-&#229;ngstr&#246;m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp.">Sub-&#229;ngstr&#246;m cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li><li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products.">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li><li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+data+collection+with+SerialEM.">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS:+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED.">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li><li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography.">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li><li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+catalase+determined+by+MicroED.">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600 (2014).</li><li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED.">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li></ol>

Provberedning är vanligtvis en iterativ process där optimeringar görs efter sessioner med screening och datainsamling. För småmolekylära prover är det ofta klokt att först försöka förbereda galler utan att lysa ur gallren, eftersom många läkemedel tenderar att vara hydrofoba10,11. Om gallren har för få nanokristallina avlagringar är det en bra idé att försöka igen efter att näten först glödtömts. Det kan vara så att kristallerna från frys...

Mikrokristallelektrondiffraktion (MicroED) är en elektronkryomikroskopimetod (kryo-EM) för bestämning av atomupplösningsstrukturer från submikrometerstora kristaller 1,2. Kristaller appliceras på standardtransmissionselektronmikroskop (TEM) galler och fryses genom att antingen kasta sig i flytande etan eller flytande kväve. Galler laddas sedan i en TEM som arbetar vid kryogena temperaturer. Kristaller är placerade på gallret och screenade för initial diffraktionskvalitet. Kontinuerlig rotation MicroED-data samlas in från en delmängd av de skärmade kristallerna, där data sparas med hjälp av en snabb kamera som en film3. Dessa filmer konverteras till ett standardkristallografiskt format och bearbetas nästan identiskt som ett röntgenkristallografiexperiment4.
MicroED utvecklades ursprungligen för att undersöka proteinmikrokristaller 1,2. En flaskhals inom proteinkristallografi växer stora, välordnade kristaller för traditionella synkrotronröntgendiffraktionsexperiment. Eftersom elektroner interagerar med materieordningar som är starkare än röntgenstrålar är begränsningarna för kristallstorleken som behövs för att producera detekterbar diffraktion betydligt mindre5. Dessutom är förhållandet mellan elastiska och oelastiska spridningshändelser mer gynnsamt för elektroner, vilket tyder på att mer användbara data kan samlas in med en mindre total exponering5. Konstant utveckling har gjort det möjligt att samla in MicroED-data från de mest utmanande mikrokristallerna 6,7,8,9.
Nyligen har MicroED visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att bestämma strukturerna för småmolekylära läkemedel från uppenbarligen amorfa material 10,11,12,13. Dessa pulver kan komma direkt från en flaska köpt reagens, en reningskolonn eller till och med från att krossa ett piller till ett fint pulver10. Dessa pulver verkar amorfa för ögat, men kan antingen helt bestå av nanokristaller eller bara innehålla spårmängder av nanokristallina avlagringar i en större icke-kristallin, amorf fraktion. Applicering av materialet på nätet är enkelt, och de efterföljande stegen för kristallidentifiering, screening och datainsamling kan till och med automatiseras inom en snar framtid14. Medan andra kan använda olika metoder för provberedning och datainsamling, beskrivs här de protokoll som utvecklats och används i Gonen-laboratoriet för att förbereda prover av små molekyler för MicroED och för datainsamling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td>Any vial or tube will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid clips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036173</td>
			<td>Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrid C-rings</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbamazapine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4024-1G</td>
			<td>Any amount will suffice for these experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS based detector</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>CetaD 16M</td>
			<td>We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delphi software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPU-D software</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Commercial software for the acquisition of MicroED data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slides</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharger</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High PrecisionTweezers</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78325-AC</td>
			<td>Any high precision tweezer will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen vessel</td>
			<td>Spear Lab</td>
			<td>FD-800</td>
			<td>A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM software</td>
			<td>UC Boulder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Quantifoil/EMS</td>
			<td>Q310CMA</td>
			<td>Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transmission electron microscope (TEM)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman circular filter paper</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>90mm or larger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microcrystal electron diffraction of small molecules

Ett detaljerat protokoll för beredning av småmolekylära prover för mikrokristallelektrondiffraktionsexperiment (MicroED) beskrivs. MicroED har utvecklats för att lösa strukturer av proteiner och små molekyler med hjälp av standard elektronkryomikroskopi (kryo-EM) utrustning. På detta sätt har små molekyler, peptider, lösliga proteiner och membranproteiner nyligen bestämts till höga upplösningar. Protokoll presenteras här för att förbereda galler av småmolekylära läkemedel med läkemedlet karbamazepin som exempel. Protokoll för screening och insamling av data presenteras. Ytterligare steg i den övergripande processen, till exempel dataintegrering, strukturbestämning och förfining presenteras på annat håll. Den tid som krävs för att förbereda småmolekylära nät uppskattas till mindre än 30 minuter.

MicroED är en kryoEM-metod som utnyttjar de starka interaktionerna mellan elektroner och materia, vilket möjliggör undersökning av försvinnande små kristaller12,13. Efter dessa steg förväntas den ha en diffraktionsfilm i kristallografiskt format som samlats in från mikrokristaller (film 1). Här demonstreras tekniken med karbamazepin12. Resultaten visar en kontinuerlig rotation MicroED dataset från en karbamazepi...

Watch this Scientific Journal Video about Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules at JoVE.com

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Här beskriver vi de procedurer som utvecklats i vårt laboratorium för framställning av pulver av småmolekylära kristaller för mikrokristallelektrondiffraktion (MicroED) experiment.

Mikrokristallelektrondiffraktion av små molekyler

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

I denna procedur visar vi hur man går vidare från ett litet molekylpulver till en tredimensionell struktur på några minuter. Detta är en transformativ teknik för kemisamhället. Många föreningar växer inte lätt till stora kristaller.Med MicroED kan vi bestämma atomupplösningsstrukturer från kristaller i nanometerstorlek. Demonstrerar förfarandet kommer att vara Dr.Mike Martynowycz som är professor vid UCLA. Börja med att överföra en liten mängd pulver, vätska eller fasta ämnen till en liten injektionsflaska eller rör.För prover som redan är i pulverform, försegla röret med locket tills provet behövs. Torka på samma sätt vätskeproverna till pulver. Vik plastfilm runt ena änden av ett glaslock.Placera TEM-rutnäten på filmen ovanpå lockbilden med den bruna kolsidan uppåt. Placera sedan glaset med galler i glödurladdningskammaren och glöd urladdning av lockglaset i cirka 30 sekunder med negativ inställning vid 15 picoamperes. Förvara gallren på lockbilden inuti en petriskål av glas fodrad med filterpapper innan du lägger provet i gallret.Ta bort TEM-gallret för glödurladdning från den täckta petriskålen med pincett och placera det på ett cirkulärt filterpapper med kolsidan uppåt. Ta bort en mycket liten skopa pulver med en liten spatel och placera den på en liten fyrkantig glaslucka precis bredvid TEM-gallret på filterpapperet. Placera en annan liten fyrkantig glasskiva eller täckslip ovanpå pulvret.Med fingrarna gnuggade du försiktigt de två glasskivorna ihop för att göra ett fint pulver. Vinkla lockglidningarna och placera dem precis ovanför det tvärgående elektromagnetiska rutnätet på filterpapperet och fortsätt att gnugga ihop locket bara några centimeter ovanför det glödurladdade TEM-gallret. Observera om pulvret faller mot gallret.Avtäck det finmalda pulvret genom att ta bort en av de två glaslockarna. Borsta sedan försiktigt bort det fina pulvret från locket, glid på TEM-gallret med en bit filterpapper. Ta tag i kanten på TEM-rutnätet med en uppsättning pincett, se till att spetsarna inte punkterar någon av rutnätrutorna.Lyft gallret en till två centimeter ovanför filterpapperet och vinkla gallret 90 grader mot papperet nedanför. Knacka försiktigt på pincetten medan du håller gallret ordentligt pincett för att ta bort eventuellt löst pulver. Frys gallret genom att flytta pincettspetsen med gallret direkt i en flytande kvävebehållare för hand och vänta tills gallret och pincetten slutar koka.Under flytande kväve placeras gallret i provhållaren med kolsidan orienterad så att provet träffas av strålen före kolbärarfilmen. Fyll provhållaren i det tvärgående elektromagnetiska underlaget och se till att gallret alltid hålls vid flytande kvävetemperaturer. För autolastarsystem, placera de klippta gallren i en kassett i en flytande kvävekyld behållare, vilket gör att robotiken för automatisk lastare kan acceptera kassetten samtidigt som proverna hålls säkra för skytteltrafik mellan den automatiska lastaren och kolonnen.Öppna TEM-kolonnventilerna och justera förstoringen med hjälp av handpanelerna till lägsta möjliga förstoring. Hitta strålen genom att justera intensitetsknappen på handpanelerna så att ett runt ljust område syns på lysrörsskärmen. Ta en helt rutnätatlas vid låg förstoring med lämplig programvara som säkerställer att mikroskopet är väl anpassat för både låg och hög förstoringsavbildning innan du samlar in högupplösta MicroED-data.Identifiera rutnätsrutor utan brutet kol och synliga svarta eller mörka korn på filmen. Navigera runt rutnätet antingen fysiskt med joysticken på handpanelerna eller virtuellt på den insamlade atlasen för att söka efter rutnätrutor som inte är trasiga och innehåller mikrokristaller. Lägg till mitten av var och en av dessa rutor i en lista över rutnätplatser för undersökning, som kan läggas till i en anteckningsbok i mikroskopets användargränssnitt eller i mikroskopautomatiseringsprogramvaran.Ställ in förstoringen mellan 500 och 1300x. Justera mitthöjden vid varje lagrad rutnätsplats och uppdatera det sparade z-värdet till de angivna positionerna. Sök antingen på den fluorescerande skärmen eller på en platt kamera efter små svarta fläckar eller korn på rutnätet.Ett bra prov har ofta skarpa kanter vid hög förstoring, vilket tyder på kristall i ordning. Flytta en placerad potentiell kristall till mitten av skärmen och öka förstoringen så att TEM går in i högt förstoringsläge. Sätt i en markerad områdesbländare och ändra bländaren till en större eller mindre storlek för att säkerställa att det valda området är större än kristallen.Växla till defraktionsläge genom att trycka på defraktionsknappen på TEM-handpanelerna för att säkerställa att lysröret är isatt. Justera kamerans längd med förstoringsknappen så att kanten har minst en ångströmupplösning. Justera diffraktionsfokus så att den centrala punkten är så skarp och liten som möjligt.Använd diffraktionsväxelknapparna och flytta mittstrålen till mitten av den fluorescerande skärmen. Sätt i strålstoppet och se till att strålen är bakom den. Lyft den fluorescerande skärmen och ta en kort exponering på kameran.Kontrollera motsvarande defraktionsmönster och se till att mönstret har skarpa fläckar som regelbundet ordnas i kolumner och rader. Spara kristallkoordinaterna antingen i TEM-användargränssnittet eller genom att skriva ner dem, upprepa sedan diffraktionsscreening för alla potentiella kristaller av intresse på den aktuella rutnätsrutan. Centrera den skärmade kristallen med en förstoring större än 1000x och justera kristallens centrerade höjd med antingen en automatisk rutin eller för hand.Sätt in den valda områdesbländaren som bäst passar kristallens storlek och form. Luta scenen i negativ och positiv riktning tills bilden täcks av rutnätsfälten. Och notera dessa vinklar för datainsamlingsändamål genom att läsa ut data varje sekund på en modern kamera med rullande slutaravläsningsläge.Ställ in rotationshastigheten genom att ange procentandelen av den maximala lutningshastigheten och när den ska stanna i mikroskopets användargränssnitt eller dedikerad programvara. Spara data i en mängd olika format, säger antingen enskilda ramar eller som en stapel med bilder. En brytningsfilm i kristallografiskt format som samlats in från mikrokristaller visar en kontinuerlig rotation MicroED-dataset från en karbamazepin mikrokristall identifierad på ett TEM-rutnät.Efter datainsamling, integration och strukturlösning bestäms en högupplöst struktur och dess tydlighet beror på datakvaliteten och fullständigheten. Att tillämpa exemplet på tabellen är avgörande för att få bra data. Efter denna metod kan data bearbetas vidare med hjälp av standardkristallografisk programvara.Att visa att MicroED är en kraftfull metod för små molekyler har öppnat sin användning över hela världen för att lösa nya strukturer av kritiskt viktiga molekyler.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Mikrokristallografi av proteinkristaller och<em&gt; I Cellulo</em&gt; Diffraktion

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi av enda proteinmolekyler genom en Atomic Force Mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Halvautomatisk Biopanning bakteriell Display bibliotek för peptid affinitet reagens identifiering och analys av resulterande isolat

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Fånga interaktion kineticsen av en jonkanal Protein med små molekyler av Bio-lager interferometri analysen

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analys av β-Amyloid-inducerad avvikelser på Fibrin Clot struktur av spektroskopi och svepelektronmikroskopi

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molekyl tracking mikroskopi-ett verktyg för att bestämma Diffusiva stater cytosoliska molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Förbereda lameller från glaskroppsbiologiska prover med hjälp av ett dubbelstråleskanningselektronmikroskop för kryoelektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikropapper transmission elektronmikroskopinät till direkt cellpositionering inom arbetsflöden för hela cell cryo-elektrontomografi

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...