Name: real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31670845، 31870832، 32000811) وبرنامج الأستاذ المتميز في مقاطعة لياونينغ (LJH2018-35).

تمت الموافقة على الدم المحيطي من المتطوعين المطبقين في هذا البحث من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لأول مستشفى في الجامعة الطبية الصينية (#2020-2020-237-2).
1. إعداد الكواشف والثقافة المتوسطة
<ol><li>إعداد العازلة تحلل خلايا الدم الحمراء عن طريق إضافة 8.29 غرام من NH4Cl, 1 غرام من KHCO3</s...

<ol>
	<li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+bacterial+meningitis+in+infants+and+children.">Acute bacterial meningitis in infants and children.</a> Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).</li><li>Woll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+Etiology+of+Invasive+Bacterial+Infection+in+Infants+&lt;/=60+Days+Old+Treated+in+Emergency+Departments.">Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants &lt;/=60 Days Old Treated in Emergency Departments.</a> Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiology+and+Clinical+Features+of+Full-Term+Neonatal+Bacterial+Meningitis:+A+Multicenter+Retrospective+Cohort+Study.">Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).</li><li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Meningitis-Associated+Escherichia+coli.">Human Meningitis-Associated Escherichia coli.</a> EcoSal Plus. 7 (1), (2016).</li><li>Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity.">Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).</li><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+Molecules,+Functions+and+Pathophysiological+Aspects.">Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects.</a> Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).</li><li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+(ROS)+and+ROS-induced+ROS+release.">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li><li>Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+NADPH+oxidase+in+modulating+neutrophil+effector+responses.">The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses.</a> Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria.">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).</li><li>Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+roles+of+NOX2+NADPH+oxidase-derived+ROS+in+immunity.">The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity.</a> Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).</li><li>Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases:+an+overview+from+structure+to+innate+immunity-associated+pathologies.">NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).</li><li>Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+NADPH+Oxidase+and+Associated+Ion+Fluxes+During+Phagocytosis.">Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis.</a> Traffic. 14, 1118-1131 (2013).</li><li>Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Neutrophil+Oxidants:+From+Laboratory+Curiosity+to+Clinical+Reality.">Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality.</a> Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).</li><li>Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Reactive+Oxygen+Species+(ROS)+in+the+Formation+of+Extracellular+Traps+(ETs)+in+Humans.">The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans.</a> Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).</li><li>Haynes, A. P., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neutrophil+function+test.">neutrophil function test.</a> Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).</li><li>Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Neutrophil+Isolation+and+Degranulation+Responses+to+Yersinia+pestis+Infection.">Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection.</a> Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).</li><li>Siano, B., Oh, H., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Puleston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Mitochondrial+Mass,+Damage,+and+Reactive+Oxygen+Species+by+Flow+Cytometry.">Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).</li></ol>

العدلات بمثابة العنصر الأكثر وفرة من خلايا الدم البيضاء في الدورة الدموية البشرية. فهي خلايا تأثير هامة في الجهاز المناعي البشري الفطري ، الذي يبني خط الدفاع الأول ضد غزو مسببات الأمراض11. جيل ROS يمثل واحدة من آليات مبيدات الجراثيم الرئيسية من العدلات بعد البلعومة11</s...

التهاب السحايا البكتيري الوليدي هو مرض معد شائع لدى الأطفال. الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية)مع كبسولة K1 هو الممرض الأكثر شيوعا سلبية الغرام مما تسبب في التهاب السحايا البكتيري الوليدي، وهو ما يمثل حوالي 80٪ من إجمالي الإصابة1،2،3. على الرغم من التقدم في العلاج الكيميائي المضاد للميكروبات والرعاية الداعمة ، لا يزال التهاب السحايا البكتيري واحدا من أكثر الحالات تدميرا مع ارتفاع المراضة والوفيات4.
يحدث التهاب السحايا البكتيري الوليدي عادة ما يبدأ مع البكتيريا الناجمة عن دخول البكتيريا المسببة للأمراض في الدورة الدموية الطرفية من الآفات المحلية للمواليد الجدد ، تليها اختراق من خلال حاجز الدم في الدماغ (BBB) في الدماغ ، مما يؤدي إلى التهاب السحايا4. بداية البكتيريا يعتمد على التفاعل بين البكتيريا والخلايا المناعية المضيفة بما في ذلك العدلات وال الضامة، الخ. العدلات، والتي تمثل ~ 50-70٪ من خلايا الدم البيضاء، هي خط الدفاع الأول ضد العدوى البكتيرية5،6. خلال غزو البكتيريا ، يتم تجنيد العدلات المنشطة إلى المواقع المعدية وإطلاق أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) بما في ذلك أيون أكسيد فائق ، بيروكسيد الهيدروجين ، الجذور الهيدروكسيل ، والأوكسجين الفردي7. يخضع ROS لتفاعلات الأكسدة مع غشاء الخلية وجزيئات الحمض النووي وبروتينات البكتيريا ، مما يؤدي إلى إصابة ووفاة البكتيريا الغازية8. الميتوكوندريا هو الموقع الرئيسي لإنتاج ROS في الخلايا eukaryotic، ومختلف oxidases (على سبيل المثال، نيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد فوسفات (NADPH) مجمع أوكسيداز، نظام ليبوكسيجيناز، بروتين كيناز C ونظام سيكلوكسيجيناز) التوسط في إنتاج ROS9،10. يعد القياس في الوقت الفعلي لإنتاج ROS ، الذي يمثل الآلية الأساسية المضادة للميكروبات في العدلات ، طريقة مفيدة لدراسة دفاع المضيف أثناء التفاعل بين البكتيريا والمضيف.
في هذا البروتوكول، تم قياس إنتاج ROS المعتمد على الوقت في العدلات المصابة بالإشريكية القولونية السحائية كميا مع مسبار ROS الفلوري DHE، الذي تم اكتشافه من قبل قارئ اللوحة الدقيقة الفلورية في الوقت الحقيقي. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على تقييم إنتاج ROS في خلايا الثدييات الأخرى أثناء التفاعل بين العامل الممرض والمضيف.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>DINGGUO</td>
			<td>DH010-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autuomated cell counter</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>508BR03397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Carbinet</td>
			<td>Shanghai Lishen</td>
			<td>Hfsafe-1200Lcb2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>BD</td>
			<td>237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Changsha Xiangyi</td>
			<td>TDZ5-WS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>104821-25-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Cellmax</td>
			<td>SA211.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Hera Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Beyoitme</td>
			<td>S1819-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>13292-46-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 medium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E600027-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic shaker</td>
			<td>Shanghai Zhicheng</td>
			<td>ZWY-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli

الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية)هي البكتيريا الأكثر شيوعا سلبية الغرام المسببة لالتهاب السحايا الوليدي. حدوث البكتيريا والاختراق البكتيري من خلال حاجز الدم في الدماغ هي خطوات لا غنى عنها لتطوير التهاب السحايا الإشريكية القولونية. تمثل أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) آليات مبيدات الجراثيم الرئيسية للعدلات لتدمير مسببات الأمراض الغازية. في هذا البروتوكول، تم قياس إنتاج ROS داخل الخلايا المعتمد على الوقت في العدلات المصابة بالإشريكية القولونية السحائية باستخدام مسابير ROS الفلورية التي تم اكتشافها من قبل قارئ اللوحة الدقيقة الفلورية في الوقت الحقيقي. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على تقييم إنتاج ROS في خلايا الثدييات أثناء التفاعلات بين مسببات الأمراض والمضيف.

باستخدام البروتوكول المبين في هذه المقالة، تم عزل العدلات من الدم المحيطي البشري وتحميلها مع مسبار مضان DHE للكشف عن التغيرات في مستويات ROS استجابة للعدوى E44. هنا ، نقدم بيانات تمثيلية توضح إنتاج ROS الذي أثارته سلالة E44 التي يحددها قارئ microplate في الوقت الفعلي. بإضافة سلالات E44 في وزارة الداخلي?...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli at JoVE.com

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

الإشريكية القولونية هي السبب الرئيسي لالتهاب السحايا البكتيري السلبي للغرام الوليدي. خلال العدوى البكتيرية ، تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية التي تنتجها العدلات دورا كبيرا في مبيد الجراثيم. هنا نقدم طريقة للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية في العدلات استجابة لالتهاب السحايا E. coli.

التحديد الكمي في الوقت الحقيقي لأنواع الأكسجين التفاعلية في العدلات المصابة بالإشريشيا القولونية السحايا

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

الإشريكية القولونية هي البكتيريا الأكثر شيوعا سلبية الغرام المسببة لالتهاب السحايا حديثي الولادة. يحدث التهاب السحايا البكتيري الوليدي يبدأ بحتا مع البكتيريا ومن ثم البكتيريا في الدم تخترق حاجز الدم في الدماغ للتسبب في التهاب السحايا. العدلات هي خط الدفاع الأول ضد العدوى البكتيرية.أثناء الغزو البكتيري ، تطلق العدلات النشطة ROS. يمثل ROS الآليات الرئيسية للبكتيريا للخلايا المضيفة لتدمير مسببات الأمراض الغازية. قياس إنتاج ROS في العدلات هو طريقة مفيدة لبدء دفاع المضيف أثناء التفاعل بين البكتيريا والمضيف.تأخذ مستعمرة بكتيرية واحدة من لوحة مع ماصة معقمة ووضعها في خمسة ملليلتر الدماغ القلب ضخ المتوسطة التي تحتوي على ريفامبيسين في قارورة مقعرة. احتضان الثقافة البكتيرية في 37 درجة مئوية ، مع 90 دورة في الدقيقة لمدة 17 ساعة في شاكر الحضانة. طرد عينات الدم المحيطية في 2000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.بعد الطرد المركزي، تنقسم عينات الدم إلى ثلاث طبقات. من الأسفل إلى الأعلى، طبقة خلايا الدم الحمراء، طبقة خلايا الدم البيضاء، وطبقة البلازما. يستنشق طبقة خلايا الدم البيضاء إلى أنبوب جديد مع ماصة معقمة.إضافة ثلاثة أضعاف خلية الدم الحمراء تحلل العازلة. يمزج المزيج جيدا، ويوضع في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. الطرد المركزي الأنبوب في 2000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.يستنشق supernatant تماما وتجاهل. كرر إجراء التحلل لخلايا الدم الحمراء مرة أو مرتين ، حتى تتحول الرواسب إلى اللون الأبيض. غسل الخلايا عن طريق إعادة تعليق الرواسب مع اثنين من برنامج تلفزيوني ملليلتر.ثم طرد أنبوب في 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. Resuspend الرواسب مع 15 microliter precode العازلة فرز الخلايا المغناطيسية ل15 مليون خلية. إضافة 15 ميكرولتر الميكروبات المغناطيسية وتخلط جيدا.احتضان الخليط في أربع درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. في ظل الظروف العادية ، يكون لدى الإنسان البالغ حوالي 4 إلى 10000 خلية دم بيضاء لكل دم ميكرولتر. وبالتالي فإن تكلفة إجمالي خلايا الدم البيضاء في خمسة ملليلتر الدم المحيطي البشري، ما يقرب من 50 مليون.و50 حبة مغناطيسية ميكرولتر في 15 ميكرولتر المغناطيسي الفرز العازلة يكفي. النسبة الطبيعية من العدلات هي 50 إلى 70٪ من إجمالي خلايا الدم البيضاء. لذلك يمكن الحصول على حوالي 10 مليون العدلات من الدم خمسة ملليلتر.اغسل الخلايا بإضافة حاجزين للفرز المغناطيسي بالملليلتر، لكل 10 ملايين خلية إلى الأنبوب، وأجهزة الطرد المركزي عند أربع درجة مئوية، 1، 200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. تجميع العمود المغناطيسي وفصل الرف. تجاهل supernatant تماما، وإعادة إنفاق الرواسب مع 500 ميكرولتر العازلة الفرز المغناطيسي لمدة تصل إلى 100 مليون خلية.شطف العمود مع ثلاثة ملليلتر العازلة الفرز المغناطيسي. تطبيق تعليق الخلية على العمود للسماح العدلات المسمى من قبل الخرز المغناطيسي، تعلق على العمود. غسلها قبالة خلايا محددة غير محددة عن طريق إضافة ثلاثة ملليلتر العازلة لمدة ثلاث مرات، مرة واحدة خزان العمود فارغ في كل مرة.إزالة العمود من الفاصل المغناطيسي، ووضعها في أنبوب جديد. إضافة خمسة ملليلتر المخزن المؤقت الفرز المغناطيسي في العمود. دفع خارج الخلايا المسماة المغناطيسي باستخدام المكبس.الطرد المركزي الأنبوب في 1, 200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. يستنشق supernatant تماما، وإعادة إنفاق الرواسب مع وسيط واحد ثقافة ملليلتر. تحديد رقم الخلية باستخدام عداد.ضبط تركيز الخلية إلى 2 مليون لكل ملليلتر في وسط الثقافة الذي يحتوي على مسبار مضان DHE. ضع العدلات في الحاضنة لمدة 30 دقيقة لتحميل مسبار DHE. تخصيص تعليق الخلية إلى لوحة صغيرة سوداء 96 جيدا مع 200 ميكرولتر لكل بئر.قم بتشغيل قارئ اللوحة الدقيقة. تعيين درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، واختيار وضع القراءة مضان، نوع القراءة الحركية، تعيين الطول الموجي الفلوري. اختر تنسيق اللوحة.تحديد منطقة القراءة. قياس كثافة الفلورسينس كل خمس دقائق لمدة ساعة. يهز لوحة لمدة ثلاث ثوان قبل كل قراءة.أخرج اللوحة الصغيرة من الحاضنة أضف سلالات PMA أو E44 مع ثلاثة تكرارات. وضع لوحة في قارئ microplate، اضغط على زر البدء لبدء المقايسة على الفور.باستخدام مخطط البروتوكول في هذه المقالة ، تم عزل العدلات عن الدم المحيطي البشري ، وتم تحميلها بمسبار مضان DHE. من خلال إضافة PMA ، أظهرت ROS داخل الخلايا في العدلات ، زيادة كبيرة من 20 إلى 40 دقيقة ، ووصلت إلى ذروتها في 60 دقيقة. ولكن أعتقد أن سلالات E44 ، وإنتاج روس يحدث على الفور ويزيد من الوقت بشكل يعتمد عليه.التعبير عن ROS الناجمة عن سلالة E44 مماثلة لتلك التي تسببها PMA. الكشف عن إنتاج روس في العدلات قد تسهم في مزيد من الدراسة للآليات مبيد للجراثيم من العدلات. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم وسيلة أسهل للكشف عن إنتاج ROS في العدلات بطريقة في الوقت الحقيقي.يمكن أيضا استخدام الطريقة البسيطة لمراقبة إنتاج ROS في أنواع خلايا المضيفين الآخرين أثناء التفاعلات بين البكتيريا المضيفة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

المراقبة المباشرة للالبلعمة وNET تشكيل تلو العدلات في الرئتين المصابة باستخدام الميكروسكوب 2 - الفوتون

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

نموذج غير الغازية من ممرض للأعصاب<em&gt; الإشريكية القولونية</em&gt; العدوى في الأطفال حديثي الولادة الجرذ

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

التصوير العدلات وحيدات في مساريقي الأوردة التي كتبها حيوي داخلي المجهري على الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

واحد خطوة السلبية الكروماتوغرافي تنقية<em&gt; هيليكوباكتر بيلوري</em&gt; بروتين العدلات، تفعيل Overexpressed في<em&gt; كولاي</em&gt; في دفعة واسطة

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

الكشف عن استعمار الإشريكيّة القولونية Enterohemorrhagic موريني واستضافة بنظام الإضاءة الحيوية غير الغازية في فيفو

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان<em&gt; رابطة الدول المستقلة</em&gt; -prenyltransferase في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

بروتوكول سهلة لتوليد بروتينات سيتيسبيسيفيكالي أسيتيلاتيد في الإشريكيّة القولونية

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

قياس فيروس حمى الدنج الجيش الملكي النيبالي في المادة طافية الثقافة من الخلايا المصابة بسلسلة البلمرة الكمية في الوقت الحقيقي

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

في فيفو تصوير للأنواع الأكسجين التفاعلية في الفاري الجرح النموذجي

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

التصوير في الوقت الحقيقي والتحديد الكمي للتنمية بيوفيلم الفطرية باستخدام نظام تدفق دائرية ذات مرحلتين

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...