Name: real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) og Program of Distinguished Professor of Liaoning Province (LJH2018-35).

Perifert blod fra frivillige, der anvendes i denne forskning, blev godkendt af Institutional Review Board på det første Hospital of China Medical University (#2020-2020-237-2).
1. Fremstilling af reagenser og dyrkningsmedium
<ol><li>Forbered den røde blodlegemer lysis buffer ved at tilføje 8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3,37,2 mg Na2EDTA i 1 L dobbelt destilleret vand og justere pH til 7,2-7,4. Bakterierne fjernes ved filtrering med 0,22 μm filtre.</li>
	<li>Forb...

<ol>
	<li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+bacterial+meningitis+in+infants+and+children.">Acute bacterial meningitis in infants and children.</a> Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).</li><li>Woll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+Etiology+of+Invasive+Bacterial+Infection+in+Infants+&lt;/=60+Days+Old+Treated+in+Emergency+Departments.">Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants &lt;/=60 Days Old Treated in Emergency Departments.</a> Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiology+and+Clinical+Features+of+Full-Term+Neonatal+Bacterial+Meningitis:+A+Multicenter+Retrospective+Cohort+Study.">Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).</li><li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Meningitis-Associated+Escherichia+coli.">Human Meningitis-Associated Escherichia coli.</a> EcoSal Plus. 7 (1), (2016).</li><li>Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity.">Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).</li><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+Molecules,+Functions+and+Pathophysiological+Aspects.">Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects.</a> Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).</li><li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+(ROS)+and+ROS-induced+ROS+release.">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li><li>Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+NADPH+oxidase+in+modulating+neutrophil+effector+responses.">The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses.</a> Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria.">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).</li><li>Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+roles+of+NOX2+NADPH+oxidase-derived+ROS+in+immunity.">The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity.</a> Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).</li><li>Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases:+an+overview+from+structure+to+innate+immunity-associated+pathologies.">NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).</li><li>Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+NADPH+Oxidase+and+Associated+Ion+Fluxes+During+Phagocytosis.">Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis.</a> Traffic. 14, 1118-1131 (2013).</li><li>Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Neutrophil+Oxidants:+From+Laboratory+Curiosity+to+Clinical+Reality.">Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality.</a> Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).</li><li>Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Reactive+Oxygen+Species+(ROS)+in+the+Formation+of+Extracellular+Traps+(ETs)+in+Humans.">The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans.</a> Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).</li><li>Haynes, A. P., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neutrophil+function+test.">neutrophil function test.</a> Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).</li><li>Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Neutrophil+Isolation+and+Degranulation+Responses+to+Yersinia+pestis+Infection.">Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection.</a> Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).</li><li>Siano, B., Oh, H., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Puleston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Mitochondrial+Mass,+Damage,+and+Reactive+Oxygen+Species+by+Flow+Cytometry.">Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).</li></ol>

Neutrofiler fungerer som den mest rigelige del af hvide blodlegemer i menneskers blodcirkulation. De er vigtige effektorceller i det medfødte menneskelige immunsystem, som bygger den første forsvarslinje mod invasionen af patogener11. Generationen af ROS repræsenterer en af de største bakteriedræbende mekanismer hos neutrofiler efter fagocytose11. Nylige undersøgelser har vist , at en net-lignende struktur udgivet af en neutrofil kaldet neutrofil ekstracellulær fæld...

Neonatal bakteriel meningitis er en almindelig pædiatrisk smitsom sygdom. Escherichia coli (E. coli) med en K1 kapsel er den mest almindelige Gram-negative patogen forårsager neonatal bakteriel meningitis, tegner sig for omkring 80% af den samlede forekomst1,2,3. På trods af fremskridtene i antimikrobiel kemoterapi og understøttende pleje er bakteriel meningitis stadig en af de mest ødelæggende tilstande med høj sygelighed ogdødelighed 4.
Forekomsten af neonatal bakteriel meningitis begynder normalt med bakterielæmi forårsaget af indtræden af patogene bakterier i den perifere cirkulation fra de nyfødtes lokale læsioner efterfulgt af penetration gennem blod-hjerne-barrieren (BBB) i hjernen, hvilket resulterer i betændelse i meninges4. Starten af bakteriæmi afhænger af samspillet mellem bakterier og værts immunceller, herunder neutrofiler og makrofager osv. Neutrofiler, som tegner sig for ~ 50-70% af hvide blodlegemer, er den første forsvarslinje mod bakterielle infektioner5,6. Under invasionen af bakterier rekrutteres de aktiverede neutrofiler til de smitsomme steder og frigiver reaktive iltarter (ROS), herunder superoxidion, hydrogenperoxid, hydroxylradikaler og singlet ilt7. ROS gennemgår redoxreaktioner med cellemembranen, nukleinsyremolekyler og proteiner i bakterierne, hvilket resulterer i skade og død af de invaderende bakterier8. Mitokondrier er det vigtigste sted for ROS produktion i eukaryote celler, og forskellige oxidaser (f.eks nicotinamid adenin dinucleotid fosfat (NADPH) oxidase kompleks, lipoxygenase system, protein kinase C og cyclooxygenase system) mægle produktionen af ROS9,10. Realtidsmålingen af produktionen af ROS, der repræsenterer den primære antimikrobielle mekanisme i neutrofiler, er en nyttig metode til at studere værtsforsvar under bakterieværtsinteraktionen.
I denne protokol blev den tidsafhængige ROS-produktion i neutrofiler inficeret med meningitisk E. coli kvantificeret med en fluorescerende ROS-sonde DHE, opdaget af en realtids fluorescensmikropladelæser. Denne metode kan også anvendes ved vurderingen af produktionen af ros i andre pattedyrceller under interaktionen mellem patogen og vært.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>DINGGUO</td>
			<td>DH010-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autuomated cell counter</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>508BR03397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Carbinet</td>
			<td>Shanghai Lishen</td>
			<td>Hfsafe-1200Lcb2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>BD</td>
			<td>237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Changsha Xiangyi</td>
			<td>TDZ5-WS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>104821-25-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Cellmax</td>
			<td>SA211.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Hera Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Beyoitme</td>
			<td>S1819-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>13292-46-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 medium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E600027-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic shaker</td>
			<td>Shanghai Zhicheng</td>
			<td>ZWY-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) er den mest almindelige Gram-negative bakterier forårsager neonatal meningitis. Forekomsten af bakteriæmi og bakteriel penetration gennem blod-hjerne barrieren er uundværlige skridt for udviklingen af E. coli meningitis. Reaktive iltarter (ROS) repræsenterer neutrofilers store bakteriemekanismer for at ødelægge de invaderede patogener. I denne protokol blev den tidsafhængige intracellulære ROS-produktion i neutrofiler inficeret med meningitisk E. coli kvantificeret ved hjælp af fluorescerende ROS-sonder opdaget af en realtids fluorescensmikropladelæser. Denne metode kan også anvendes ved vurderingen af produktionen af ros i pattedyrceller under interaktioner mellem patogen og vært.

Ved hjælp af protokollen, der er skitseret i denne artikel, blev neutrofilerne isoleret fra humant perifert blod og fyldt med fluorescenssonde DHE for at opdage ændringerne i ROS-niveauerne som reaktion på E44-infektion. Her leverer vi repræsentative data, der demonstrerer ROS-produktionen fremkaldt af E44-stamme bestemt af en mikropladelæser i realtid. Ved at tilføje E44-stammer ved en MOI på 100 steg ROS-niveauerne øjeblikkeligt og viste en kontinuerlig opadgående tendens med en tidsafhængig måde (<strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli at JoVE.com

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli er den hyppigste årsag til neonatal Gram-negativ bakteriel meningitis. Under bakterieinfektionen spiller reaktive iltarter produceret af neutrofiler en stor bakterierolle. Her introducerer vi en metode til påvisning af de reaktive iltarter i neutrofiler som reaktion på meningitis E. coli.

Real-Time kvantificering af reaktive iltarter i neutrofiler inficeret med meningitiske Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Escherichia Coli er den mest almindelige gram-negative bakterier forårsager neonatal meningitis. Forekomsten af neonatal bakteriel meningitis begynder rent med bakterien, og derefter trænger bakterierne i blodet gennem blodhjernebarrieren for at forårsage meningitis. Neutrofiler er den første forsvarslinje mod bakterielle infektioner.Under bakterieinvasion frigiver de aktive neutrofiler ROS. ROS repræsenterer de store bakteriocidal mekanismer af værtsceller til at ødelægge de invaderende patogener. Måling af produktionen af ROS i neutrofiler er en nyttig metode til at starte værtens forsvar under bakterieværtsinteraktion.Tag en enkelt bakteriekoloni fra pladen med en steril pipette og læg den i fem milliliter Brain-Heart infusionsmedium indeholdende Rifampicin i en konkav kolbe. Inkuber bakteriekulturen ved 37 centigrade, med 90 RPM i 17 timer i inkubations shakeren. Centrifuge de perifere blodprøver ved 2000 RPM i fem minutter.Efter centrifuge er blodprøverne opdelt i tre lag. Fra bunden til toppen, de røde blodlegemer lag, de hvide blodlegemer lag, og plasma lag. Indsug det hvide blodlegemer lag til et nyt rør med en steril pipette.Tilføj tredobbelt røde blodlegemer lysis buffer. Blend blandingen grundigt, og sted ved stuetemperatur i fem minutter. Centrifuge røret ved 2000 RPM i fem minutter.Aspirér supernatanten helt og kassér. Gentag lysis-proceduren for røde blodlegemer i en eller to gange, indtil sedimenterne bliver hvide. Vask cellerne ved at suspendere sedimentet igen med to milliliter PBS.Derefter centrifuge røret ved 1000 RPM i fem minutter. Genbrug sedimentet med 15 mikroliter forudkode magnetisk cellesortering buffer for 15 millioner celler. Tilsæt 15 mikroliter magnetiske mikroperler og bland grundigt.Inkuber blandingen ved fire centigrade i 30 minutter. Under normale forhold har det voksne menneske omkring fire til 10.000 hvide blodlegemer pr. mikroliterblod. Så omkostningerne ved de samlede hvide blodlegemer i fem milliliter humant perifert blod, næsten mindre end 50 millioner.Og 50 mikroliter magnetiske perler i 15 mikroliter magnetisk sortering buffer er nok. Den normale procentdel af neutrofilerne er 50 til 70% af de samlede hvide blodlegemer. Så omkring 10 millioner neutrofiler kan fås fra fem milliliter blod.Vask cellerne ved at tilføje to milliliter magnetisk sorteringsbuffer, pr. 10 millioner celler til røret, og centrifuge ved fire celsius, 1.200 RPM i 10 minutter. Saml den magnetiske kolonne og adskillelse hylde. Kassér supernatanten fuldstændigt, og genbrug sedimenterne med 500 mikroliter magnetisk sorteringsbuffer til op til 100 millioner celler.Skyl kolonnen med tre milliliter magnetisk sorteringsbuffer. Påfør celleophænget på kolonnen for at tillade neutrofiler mærket af de magnetiske perler, der er fastgjort til kolonnen. Vaskes af de ikke-specifikke specifikke celler ved at tilføje tre milliliter buffer tre gange, når kolonnebeholderen er tom hver gang.Fjern kolonnen fra den magnetiske separator, og læg den i et nyt rør. Tilføj fem milliliter magnetisk sorteringsbuffer i kolonnen. Skub de magnetiske mærkede celler ud ved hjælp af et stempel.Centrifuge røret ved 1.200 omdrejninger i fem minutter. Aspirere supernatant helt, og genbruge sedimentet med en milliliter kultur medium. Bestem cellenummeret med en tæller.Justerede cellekoncentrationen til 2 millioner pr. milliliter i det dyrkningsmedium, der indeholder DHE-fluorescenssonde. Placer neutrofilerne i inkubatoren i 30 minutter for at indlæse DHE-sonden. Tildel celleaffjedringen til en 96-brønds sort mikroplade med 200 mikroliter pr. brønd.Tænd for mikropladelæseren. Indstil temperaturen til 37 centigrade, vælg fluorescensaflæsningstilstand, kinetisk læsetype, indstil fluorescensbølgelængden. Vælg pladeformatet.Bestem læseområdet. Mål fluorescensintensiteten hvert femte minut i en time. Ryst pladen i tre sekunder før hver aflæsning.Tag mikropladen ud af inkubatoren. Tilføj PMA- eller E44-stammer med tre gentagelser. Sæt pladen i mikropladelæseren, tryk på startknappen for at starte analysen med det samme.Ved hjælp af protokoldispositionen i denne artikel blev neutrofilerne isoleret fra det menneskelige perifere blod og fyldt med fluorescenssonde DHE. Ved at tilføje PMA, intracellulær ROS i neutrofiler, viste en betydelig stigning fra 20 til 40 minutter, og nåede toppen på 60 minutter. Men jeg tror, E44 stammer, ROS produktionen sker straks og øger tiden afhængigt.Udtrykket af ROS forårsaget af E44 stamme svarer til den, der forårsages af PMA. Påvisning af ROS-produktion i neutrofiler kan bidrage til den videre undersøgelse af neutrofilers bakteriocidmekanismer. I denne protokol giver vi en nemmere måde at opdage ROS-produktionen i neutrofiler på en realtids måde.Den enkle metode kan også bruges til at overvåge ROS-produktionen i andre værter celletyper under værtsbakterier interaktioner.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-invasive Model of Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infektion i Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging neutrofiler og monocytter i Mesenterial Veins af Intravital Mikroskopi på bedøvede mus i Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Et-trins Negativ kromatografisk oprensning af<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofilaktiverende protein overudtrykt i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; I Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Påvisning af Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonisering i Murine vært ved Non-invasiv In Vivo bioluminescens System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overekspression og oprensning af mennesket<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

En letkøbt protokol til at generere Site-Specifically acetyleret proteiner i Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Måling af Dengue Virus RNA i cellekultur Supernatant af inficerede celler ved Real-time kvantitativ Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Billeddannelse af reaktive ilt arter i en Murine sår Model

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Real-time Imaging og kvantificering af svampe Biofilm udvikling ved hjælp af en 2-faset recirkulerende Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...