Name: real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) und dem Program of Distinguished Professor of Liaoning Province (LJH2018-35) unterstützt.

Peripheres Blut von Freiwilligen, die in dieser Forschung angewendet wurden, wurde vom Institutional Review Board des ersten Krankenhauses der China Medical University (#2020-2020-237-2) genehmigt.
1. Herstellung von Reagenzien und Kulturmedium
<ol><li>Bereiten Sie den Lysepuffer der roten Blutkörperchen vor, indem Sie 8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 37,2 mg Na2EDTA in 1 L doppelt destilliertes Wasser hinzufügen und den pH-Wert auf 7,2-7,4 einstellen. Entfernen Si...

<ol>
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Neutrophile fungieren als die am häufigsten vorkommende Komponente der weißen Blutkörperchen in der menschlichen Blutzirkulation. Sie sind wichtige Effektorzellen im angeborenen menschlichen Immunsystem, das die erste Verteidigungslinie gegen die Invasion von Krankheitserregern baut11. Die Erzeugung von ROS stellt einen der wichtigsten bakteriziden Mechanismen von Neutrophilen nach Phagozytose11dar. Jüngste Studien haben gezeigt, dass eine netzähnliche Struktur, die vo...

Neonatale bakterielle Meningitis ist eine häufige pädiatrische Infektionskrankheit. Escherichia coli (E. coli) mit einer K1-Kapsel ist der häufigste gramnegative Erreger, der eine neonatale bakterielle Meningitis verursacht und etwa 80% der Gesamtinzidenz1,2,3ausmacht. Trotz der Fortschritte in der antimikrobiellen Chemotherapie und unterstützenden Pflege ist die bakterielle Meningitis immer noch eine der verheerendsten Erkrankungen mit hoher Morbidität und Mortalität4.
Das Auftreten der neonatalen bakteriellen Meningitis beginnt in der Regel mit Bakteriämie, die durch das Eindringen pathogener Bakterien in den peripheren Kreislauf aus den lokalen Läsionen der Neugeborenen verursacht wird, gefolgt von der Penetration durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB) in das Gehirn, was zu einer Entzündung der Hirnhaut4führt. Der Beginn der Bakteriämie hängt von der Interaktion zwischen Bakterien und Wirtsimmunzellen einschließlich Neutrophilen und Makrophagen usw. ab. Neutrophile, die für 50-70% der weißen Blutkörperchen ausmachen, sind die erste Verteidigungslinie gegen bakterielle Infektionen5,6. Während der Invasion von Bakterien werden die aktivierten Neutrophilen an die infektiösen Stellen rekrutiert und geben reaktive Sauerstoffspezies (ROS) frei, einschließlich des Superoxid-Anions, Wasserstoffperoxids, Hydroxylradikalen und Singlet-Sauerstoff7. Die ROS durchlaufen Redox-Reaktionen mit der Zellmembran, Nukleinsäuremolekülen und Proteinen der Bakterien, was zu Verletzungen und Zum Tod der eindringenden Bakterien8führt. Die Mitochondrien sind der Hauptstandort der ROS-Produktion in eukaryotischen Zellen, und verschiedene Oxidasen (z.B. Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH) Oxidase-Komplex, Lipoxygenase-System, Proteinkinase C und Cyclooxygenase-System) vermitteln die Produktion von ROS9,10. Die Echtzeitmessung der Produktion von ROS, die den primären antimikrobiellen Mechanismus in Neutrophilen darstellt, ist eine nützliche Methode, um die Wirtsabwehr während der Bakterien-Wirt-Interaktion zu untersuchen.
In diesem Protokoll wurde die zeitabhängige ROS-Produktion bei Neutrophilen, die mit meningitischem E. coli infiziert waren, mit einer fluoreszierenden ROS-Sonde DHE quantifiziert, die von einem Echtzeit-Fluoreszenz-Mikroplattenleser nachgewiesen wurde. Diese Methode kann auch auf die Beurteilung der ROS-Produktion in anderen Säugetierzellen während der Pathogen-Wirt-Interaktion angewendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>DINGGUO</td>
			<td>DH010-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autuomated cell counter</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>508BR03397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Carbinet</td>
			<td>Shanghai Lishen</td>
			<td>Hfsafe-1200Lcb2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>BD</td>
			<td>237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Changsha Xiangyi</td>
			<td>TDZ5-WS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>104821-25-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Cellmax</td>
			<td>SA211.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Hera Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Beyoitme</td>
			<td>S1819-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>13292-46-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 medium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E600027-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic shaker</td>
			<td>Shanghai Zhicheng</td>
			<td>ZWY-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) ist die häufigste gramnegative Bakterien verursacht neonatale Meningitis. Das Auftreten von Bakteriämie und bakterielle Penetration durch die Blut - Hirn-Schranke sind unverzichtbare Schritte für die Entwicklung von E. coli Meningitis. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) stellen die wichtigsten bakteriziden Mechanismen von Neutrophilen dar, um die eingedrungenen Krankheitserreger zu zerstören. In diesem Protokoll wurde die zeitabhängige intrazelluläre ROS-Produktion bei Neutrophilen, die mit meningitischem E. coli infiziert waren, mit fluoreszierenden ROS-Sonden quantifiziert, die von einem Echtzeit-Fluoreszenz-Mikroplattenleser nachgewiesen wurden. Diese Methode kann auch auf die Beurteilung der ROS-Produktion in Säugetierzellen während der Wechselwirkungen zwischen Krankheitserregern und Wirt angewendet werden.

Mit dem in diesem Artikel beschriebenen Protokoll wurden die Neutrophilen aus menschlichem peripherem Blut isoliert und mit der Fluoreszenzsonde DHE beladen, um die Veränderungen des ROS-Spiegels als Reaktion auf die E44-Infektion zu erkennen. Hier stellen wir repräsentative Daten zur Verfügung, die die ROS-Produktion demonstrieren, die durch den E44-Stamm evoziert wird, der von einem Mikroplattenleser in Echtzeit bestimmt wird. Durch Zugabe von E44-Stämmen bei einem MOI von 100 stiegen die ROS-Werte sofort an und ze...

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Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli ist die Hauptursache für neonatale Gram-negative bakterielle Meningitis. Während der bakteriellen Infektion spielen reaktive Sauerstoffspezies, die von Neutrophilen produziert werden, eine wichtige bakterizide Rolle. Hier führen wir eine Methode zum Nachweis der reaktiven Sauerstoffspezies in Neutrophilen als Reaktion auf Meningitis E. coliein.

Echtzeit-Quantifizierung von reaktiven Sauerstoffspezies bei Neutrophilen, die mit Meningitic Escherichia Coli infiziert sind

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Escherichia Coli ist die häufigste gramnegative Bakterien verursacht neonatale Meningitis. Das Auftreten der neonatalen bakteriellen Meningitis beginnt rein mit der Bakteriämie und dann dringen die Bakterien im Blut durch die Blut-Hirn-Schranke, um Meningitis zu verursachen. Neutrophile sind die erste Verteidigungslinie gegen die bakteriellen Infektionen.Während der bakteriellen Invasion setzen die aktiven Neutrophilen ROS frei. ROS stellt die wichtigsten bakteriziden Mechanismen von Wirtszellen dar, um die eindringenden Krankheitserreger zu zerstören. Die Messung der Produktion von ROS in Neutrophilen ist eine nützliche Methode, um die Abwehr des Wirts während der Bakterien-Wirt-Interaktion zu starten.Nehmen Sie eine einzelne Bakterienkolonie mit einer sterilen Pipette von der Platte und legen Sie sie in ein fünf Milliliter Gehirn-Herz-Infusionsmedium, das Rifampicin enthält, in einen konkaven Kolben. Inkubieren Sie die Bakterienkultur bei 37 Grad Celsius, mit 90 Umdrehungen pro Minute für 17 Stunden im Inkubationsshaker. Zentrifuge die peripheren Blutproben bei 2000 U/min für fünf Minuten.Nach der Zentrifuge werden die Blutproben in drei Schichten unterteilt. Von unten nach oben, die rote Blutkörperchen Schicht, die weiße Blutkörperchen Schicht, und die Plasmaschicht. Die weißen Blutkörperchen schichten zu einem neuen Rohr mit einer sterilen Pipette.Fügen Sie dreifachen roten Blutkörperchen-Lysepuffer hinzu. Mischen Sie die Mischung gründlich, und legen Sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 2000 U/min für fünf Minuten.Aspirieren Sie den Überstand vollständig und entsorgen. Wiederholen Sie den Lyse-Vorgang der roten Blutkörperchen ein oder zwei Mal, bis die Sedimente weiß werden. Waschen Sie die Zellen, indem Sie das Sediment mit zwei Milliliter PBS wieder aufhängen.Dann zentrifugieren Sie das Rohr bei 1000 U/min für fünf Minuten. Setzen Sie das Sediment mit 15 Mikroliter vorcodieren magnetischen Zellsortierpuffer für 15 Millionen Zellen. 15 Mikroliter magnetische Mikroperlen hinzufügen und gründlich mischen.Inkubieren Sie die Mischung bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Unter normalen Bedingungen hat der erwachsene Mensch etwa vier bis zehn 000 weiße Blutkörperchen pro Mikroliter Blut. So die Kosten für die gesamten weißen Blutkörperchen in fünf Milliliter menschliches peripheres Blut, fast weniger als 50 Millionen.Und 50 Mikroliter magnetische Perlen in 15 Mikroliter magnetischen Sortierpuffer ist genug. Der normale Prozentsatz der Neutrophilen beträgt 50 bis 70% der gesamten weißen Blutkörperchen. So können etwa 10 Millionen Neutrophile aus fünf Milliliter Blut gewonnen werden.Waschen Sie die Zellen, indem Sie zwei Milliliter magnetischen Sortierpuffer, pro 10 Millionen Zellen in die Röhre und Zentrifuge bei vier Zentigrade, 1, 200 U/min für 10 Minuten. Montieren Sie die Magnetsäule und das Trennregal. Entsorgen Sie den Überstand vollständig und setzen Sie die Sedimente mit 500 Mikroliter magnetischen Sortierpuffer für bis zu 100 Millionen Zellen wieder auf.Spülen Sie die Säule mit drei Milliliter magnetischen Sortierpuffer. Tragen Sie die Zellsuspension auf die Säule auf, damit die Neutrophilen, die durch die magnetischen Perlen gekennzeichnet sind, an der Säule befestigt sind. Wird die unspezifischen spezifischen Zellen abgewaschen, indem dreimal drei Milliliter Puffer hinzugefügt werden, sobald das Säulenreservoir jedes Mal leer ist.Entfernen Sie die Säule aus dem magnetischen Separator, und legen Sie sie in ein neues Rohr. Fügen Sie der Spalte einen magnetischen Sortierpuffer mit fünf Millilitern hinzu. Drücken Sie die magnetisch beschrifteten Zellen mit einem Kolben aus.Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1, 200 U/min für fünf Minuten. Den Überstand vollständig ansaugen und das Sediment mit einem Milliliter-Kulturmedium wieder aufsetzen. Bestimmen Sie die Zellennummer mit einem Zähler.Die Zellkonzentration im Kulturmedium, das die DHE-Fluoreszenzsonde enthält, wurde auf 2 Millionen pro Milliliter angepasst. Legen Sie die Neutrophilen 30 Minuten lang in den Inkubator, um die DHE-Sonde zu laden. Ordnen Sie die Zellsuspension einer 96-well schwarzen Mikroplatte mit 200 Mikroliter pro Brunnen zu.Schalten Sie den Mikroplattenleser ein. Stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius, wählen Sie Fluoreszenz-Lesemodus, kinetische Leseart, die Fluoreszenz-Wellenlänge. Wählen Sie das Plattenformat aus.Bestimmen Sie den Lesebereich. Messen Sie die Fluoreszenzintensität alle fünf Minuten für eine Stunde. Schütteln Sie die Platte drei Sekunden vor jeder Lesung.Nehmen Sie die Mikroplatte aus dem Inkubator. Fügen Sie PMA- oder E44-Stämme mit drei Wiederholungen hinzu. Legen Sie die Platte in den Mikroplattenleser, drücken Sie die Starttaste, um den Test sofort zu beginnen.Unter Verwendung der Protokollumriss in diesem Artikel wurden die Neutrophilen aus dem menschlichen peripheren Blut isoliert und mit der Fluoreszenzsonde DHE beladen. Durch Zugabe von PMA, intrazelluläre ROS in Neutrophilen, zeigte eine signifikante Zunahme von 20 auf 40 Minuten, und erreichte Den höchsten Stand bei 60 Minuten. Aber ich denke, E44 Stämme, die ROS-Produktion erfolgt sofort und erhöht die Zeit abhängig.Die Expression von ROS, die durch E44-Stamm verursacht wird, ähnelt der von PMA verursachten. Der Nachweis der ROS-Produktion bei Neutrophilen kann zur weiteren Untersuchung der bakteriziden Mechanismen von Neutrophilen beitragen. In diesem Protokoll bieten wir eine einfachere Möglichkeit, die ROS-Produktion in Neutrophilen in Echtzeit zu erkennen.Die einfache Methode könnte auch verwendet werden, um die ROS-Produktion in anderen Wirtszellentypen während der Wirts-Bakterien-Wechselwirkungen zu überwachen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Direkte Beobachtung der Phagozytose und NET-Bildung durch Neutrophile im infizierten Lungengewebe mittels 2-Photonen-Mikroskopie

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Nichtinvasive Modell Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infektion in der neonatalen Ratten

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Ein-Schritt-Negative chromatographischer Reinigung von<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrophil-aktivierendes Protein überexprimiert in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Im Batch-Modus

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Eine einfache Protokoll ortspezifisch generieren acetyliert Proteine in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Messung der Dengue-Virus RNA im Kultur Überstand der infizierten Zellen durch Echtzeit-Quantitative Polymerase-Kettenreaktion

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Bildgebung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Murine Wunde Modell

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Echtzeit-Bildgebung und Quantifizierung der Pilz Biofilm-Entwicklung mit einem Zweiphasensystem rezirkulierenden Flow

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...