Name: real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli at JoVE.com

이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(31670845, 31870832, 320008111)과 랴오닝성 우수교수(LJH2018-35)의 지원을 받았습니다.

이 연구에 적용 된 자원 봉사자의 말초 혈액은 중국 의과 대학 (#2020-2020-237-2)의 첫 번째 병원의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 시약 및 문화 매체의 준비
<ol><li>NH4Cl8.29g, KHCO31g, Na2EDTA 37.2 mg을 이중 증류수 1L에 첨가하여 적혈구 용해 완충제를 준비하고 pH를 7.2-7.4로 조절한다. 0.22 μm 필터를 사용하여 여과에 의해 박테리아를 제거합니다.</l...

<ol>
	<li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+bacterial+meningitis+in+infants+and+children.">Acute bacterial meningitis in infants and children.</a> Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).</li><li>Woll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+Etiology+of+Invasive+Bacterial+Infection+in+Infants+&lt;/=60+Days+Old+Treated+in+Emergency+Departments.">Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants &lt;/=60 Days Old Treated in Emergency Departments.</a> Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiology+and+Clinical+Features+of+Full-Term+Neonatal+Bacterial+Meningitis:+A+Multicenter+Retrospective+Cohort+Study.">Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).</li><li>Kim, K. 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호중구는 인간의 혈액 순환에서 백혈구의 가장 풍부한 구성 요소역할을합니다. 그(것)들은 병원체 의 침략에 대하여 방어의 첫번째 선을 구축하는 타고난 인간 면역 계통에 있는 중요한 이펙터 세포입니다(11). ROS의 생성은 phagocytosis11다음호중구의 주요 bactericidal 기계장치 중 하나를 나타낸다. 최근 연구에 따르면 호중구 세포 외 트랩(NET)이라고 불리는 호중구?...

신생아 세균성 뇌막염은 일반적인 소아 전염병입니다. K1 캡슐을 가진대장균(E. coli)은신생아 세균성 뇌막염을 유발하는 가장 흔한 그램 음성 병원균으로, 전체 발병률 1,2,3의약 80%를 차지한다. 항균 화학 요법과 지원 치료의 진보에도 불구하고 세균 성 뇌막염은 여전히 높은 이환율과 사망률4를가진 가장 파괴적인 조건 중 하나입니다.
신생아 세균성 뇌막염의 발생은 일반적으로 신생아의 국소 병변으로부터 말초 순환으로 병원성 박테리아의 진입에 의한 박테혈으로 시작하여 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통해 뇌로 침투하여 수막4의염증을 초래한다. 박테리아의 발병은 호중구와 대식세포 등을 포함한 박테리아와 숙주 면역 세포 사이의 상호 작용에 달려 있습니다. 백혈구의 ~50-70%를 차지하는 호중구는 세균 감염5,6에대한 첫 번째 방어선이다. 박테리아의 침입 동안, 활성화된 호중구는 전염하는 부위에 모집되고 슈퍼옥사이드 음염, 과산화수소, 하이드록실 라디칼 및 단일 산소7을포함하는 반응성 산소 종(ROS)을 방출한다. ROS는 세포막, 핵산 분자 및 박테리아의 단백질과 의결된 레독스 반응을 겪으며,침입하는박테리아8의 부상과 사망을 초래한다. 미토콘드리아는 진핵세포에서 ROS 생산의 주요 사이트이며, 다양한 산화제(예를 들어, 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염(NADPH) 산화체 복합체, 립산소아제 시스템, 단백질 키나아제 C 및사이클로시산소시스템)의 생산을 중화한다. 호중구의 1차 항균 메커니즘을 나타내는 ROS의 생산의 실시간 측정은 박테리아-숙주 상호 작용 중에 숙주 방어를 연구하는 유용한 방법입니다.
이 프로토콜에서, 수막 대장균에 감염된 호중구의 시간 의존적인 ROS 생산은 실시간 형광 마이크로 플레이트 판독기에 의해 검출된 형광 ROS 프로브 DHE로 정량화되었다. 이 방법은 또한 병원체 숙주 상호 작용 동안 다른 포유류 세포에서 ROS 생산의 평가에 적용될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>DINGGUO</td>
			<td>DH010-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autuomated cell counter</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>508BR03397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Carbinet</td>
			<td>Shanghai Lishen</td>
			<td>Hfsafe-1200Lcb2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>BD</td>
			<td>237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Changsha Xiangyi</td>
			<td>TDZ5-WS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>104821-25-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Cellmax</td>
			<td>SA211.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Hera Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Beyoitme</td>
			<td>S1819-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>13292-46-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 medium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E600027-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic shaker</td>
			<td>Shanghai Zhicheng</td>
			<td>ZWY-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli

대장균 (대장균)은신생아 뇌막염을 유발하는 가장 흔한 그램 음성 박테리아입니다. 혈액-뇌 장벽을 통한 세균혈및 세균성 침투의 발생은 대장균 뇌막염의 발달을 위한 필수 단계입니다. 반응성 산소 종 (ROS)은 침략 된 병원체를 파괴하는 호중구의 주요 bactericidal 메커니즘을 나타냅니다. 이 프로토콜에서, 수막 대장균에 감염된 호중구에서의 시간 의존적인 세포내 ROS 생산은 실시간 형광 마이크로 플레이트 판독기에 의해 검출된 형광 ROS 프로브를 사용하여 정량화되었다. 이 방법은 또한 병원체 호스트 상호 작용 도중 포유류 세포에 있는 ROS 생산의 평가에 적용될 수 있습니다.

이 문서에 설명된 프로토콜을 사용하여, 호중구는 인간 말초 혈액에서 격리되고 E44 감염에 응하여 ROS 수준의 변경을 검출하기 위하여 형광 프로브 DHE로 로드되었습니다. 여기서, 우리는 실시간으로 마이크로 플레이트 판독기에 의해 결정된 E44 균주에 의해 생성된 ROS 생산을 보여주는 대표적인 데이터를 제공합니다. 100의 MOI에서 E44 균주를 첨가함으로써 ROS 수치가 즉시 증가하고 시간 의존적 방식...

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Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

대장균은 신생아 그람 음성 세균성 뇌막염의 주요 원인입니다. 세균성 감염 도중, 호중구에 의해 생성된 반응성 산소 종은 중요한 bactericidal 역할을 합니다. 여기서 우리는 뇌막염 대장균에 대응하여 호중구에서 반응성 산소 종을 검출하는 방법을 소개한다.

수막 대장균에 감염된 호중구의 반응성 산소 종의 실시간 정량화

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

대장균은 신생아 뇌막염을 유발하는 가장 흔한 그램 음성 박테리아입니다. 신생아 세균성 뇌막염의 발생은 순전히 세균염으로 시작하고 혈액내 박테리아가 뇌막염을 일으키는 원인이 되기 위하여 혈액 두뇌 장벽을 통해 침투합니다. 호중구는 세균 감염에 대한 방어의 첫 번째 라인입니다.세균성 침략 도중, 활성 호중구는 ROS를 풀어 놓습니다. ROS는 침입병원균을 파괴하는 숙주 세포의 주요 박테리오시달 메커니즘을 나타낸다. 호중구에서 ROS의 생산을 측정하는 것은 박테리아 호스트 상호 작용 중에 호스트의 방어를 시작하는 데 유용한 방법입니다.멸균 파이펫으로 접시에서 하나의 세균 식민지를 가지고 오목 한 플라스크에 리팜피신을 포함하는 다섯 밀리리터 브레인 - 심장 주입 매체에 넣어. 세균 배양을 37센티미터에서 배양하고, 인큐베이션 셰이커에서 17시간 동안 90RPM을 증식합니다. 5 분 동안 2000 RPM에서 말초 혈액 샘플을 원심 분리합니다.원심분리기 후에, 혈액 견본은 3개의 층으로 나뉩니다. 아래에서 위쪽으로, 적혈구 층, 백혈구 층 및 혈장 층. 백혈구층을 멸균 파이펫으로 새로운 튜브로 흡입합니다.적혈구 리시스 버퍼를 3배 추가합니다. 혼합물을 철저히 섞고 실온에서 5분간 놓습니다. 2000 RPM에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다.슈퍼 상체를 완전히 흡인하고 폐기하십시오. 퇴적물이 하얗게 변할 때까지 적혈구의 용해 절차를 하나 또는 두 번 반복합니다. 2밀리리터 PBS로 퇴적물을 다시 중단하여 세포를 씻으라.그런 다음 튜브를 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 15 마이크로리터 프리코드 자기 세포 선별 버퍼로 퇴적물을 1,500만 개의 세포에 재부착한다. 마이크로리터 마그네틱 마이크로비드 15개에 넣고 잘 섞어줍니다.혼합물을 4센티미터에서 30분 동안 배양합니다. 정상적인 조건하에서, 성인 인간은 마이크로 리터 혈액 당 대략 4 10, 000 백혈구가 있습니다. 따라서 5밀리리터 인간의 말초 혈액에 있는 총 백혈구의 비용은 거의 5천만 미만입니다.그리고 15 마이크로 리터 자기 선별 버퍼에서 50 마이크로 리터 자기 구슬이 충분하다. 호중구의 정상 비율은 전체 백혈구의 50~70%이다. 따라서 약 1,000만 마리의 호중구가 5밀리리터 혈액에서 얻을 수 있습니다.튜브에 1,000만 개의 세포당 2밀리리터 자기 선별 버퍼를 추가하고 원심분리기를 4센티미터, 1, 200 RPM에서 10분 동안 추가하여 세포를 세척합니다. 자기 컬럼을 조립하고 선반을 분리합니다. 상체를 완전히 폐기하고 최대 1억 개의 셀에 대해 500 마이크로리터 자기 선별 버퍼로 퇴적물을 다시 중단합니다.3밀리리터 자기 선별 버퍼로 컬럼을 헹구는 다. 열에 부착된 자기 구슬에 의해 표지된 호중구를 허용하도록 셀 서스펜션을 열에 적용합니다. 매번 기둥 저장소가 비어 있으면 3밀리리터 버퍼를 세 번 추가하여 비특이적 특이적 셀을 씻어낸다.자기 분리기에서 컬럼을 제거하고 새 튜브에 넣습니다. 열에 5밀리리터 자기 선별 버퍼를 추가합니다. 플런저를 사용하여 마그네틱 표지된 세포를 밀어내보아.1, 200 RPM에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 수퍼내를 완전히 흡인시키고, 1밀리리터 배양 배지로 퇴적물을 재보편하게 한다. 카운터를 사용하여 셀 번호를 결정합니다.DHE 형광 프로브를 함유한 배양 배지에서 밀리리터당 세포 농도를 2백만 으로 조정하였다. 호중구를 인큐베이터에 30분 간 배치하여 DHE 프로브를 로드합니다. 셀 서스펜션을 96웰의 검정 마이크로플레이트에 잘 200 마이크로리터가 할당합니다.마이크로 플레이트 판독기를 켭니다. 온도를 37센티미터로 설정하고, 형광 읽기 모드, 운동 읽기 유형을 선택하고, 형광 파장을 설정합니다. 플레이트 형식을 선택합니다.판독 영역을 결정합니다. 1시간 동안 5분마다 형광 강도를 측정합니다. 각 읽기 전에 3 초 동안 접시를 흔들어.인큐베이터에서 마이크로 플레이트를 꺼내십시오. 세 번의 반복으로 PMA 또는 E44 균주를 추가합니다. 마이크로 플레이트 판독기에 접시를 넣고 시작 버튼을 눌러 즉시 분석서를 시작합니다.이 문서에서 프로토콜 개요를 사용하여 호중구는 인간의 말초 혈액으로부터 분리되고 형광 프로브 DHE로 로드되었습니다. PMA를 추가함으로써, 호중구에 있는 세포내 ROS는, 20에서 40 분으로 중요한 증가를 보여주었고, 60 분에 피크에 도달했습니다. 그러나 나는 E44 균주, ROS 생산이 즉시 발생하고 의존적으로 시간을 증가 생각합니다.E44 균주에 의한 ROS의 발현은 PMA에 의한 것과 유사합니다. 호중구에서 ROS 생산의 검출은 호중구의 박테리오시달 메커니즘의 추가 연구에 기여할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 실시간으로 호중구에서 ROS 생산을 검출하는 쉬운 방법을 제공합니다.간단한 방법은 또한 호스트 박테리아 상호 작용 도중 그밖 호스트 세포 모형에 있는 ROS 생산을 감시하기 위하여 이용될 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

연구

면역학 및 감염병학

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Neuropathogenic의 비 침습 모델<em&gt; 대장균</em&gt; 신생아 쥐에 감염

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

한 단계의 부정적인 크로마토 그래피 정제<em&gt; 헬리코박터 파이로리</em&gt; 호중구 - 활성화 단백질 과발현<em&gt; 대장균</em&gt; 배치 모드에서

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

인간의 과발현과 정제<em&gt; 시스</em&gt; - 프레 닐 트랜스퍼 라제<em&gt; 대장균</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Site-Specifically 생성 하는 손쉬운 프로토콜 Acetylated 대장균 에서 단백질

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응에 의해 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 뎅 그 열 바이러스 RNA를 측정

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

Vivo에서 영상에는 Murine 반응성 산소 종의 상처 모델

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

실시간 이미징 및 2 단계 반복 흐름 시스템을 사용 하 여 곰 팡이 Biofilm 개발의 정량화

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...