Name: real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) og program for fremragende professor i Liaoning-provinsen (LJH2018-35).

Perifert blod fra frivillige som ble anvendt i denne forskningen ble godkjent av Institutional Review Board ved det første Hospital of China Medical University (#2020-2020-237-2).
1. Utarbeidelse av reagenser og kulturmedium
<ol><li>Forbered den røde blodcellelysbufferen ved å tilsette 8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 37,2 mg Na2EDTA i 1 L dobbelt destillert vann og juster pH til 7,2-7,4. Fjern bakteriene ved filtrering ved hjelp av 0,22 μm filtre.</li>
	<li>Forb...

<ol>
	<li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+bacterial+meningitis+in+infants+and+children.">Acute bacterial meningitis in infants and children.</a> Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).</li><li>Woll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+Etiology+of+Invasive+Bacterial+Infection+in+Infants+&lt;/=60+Days+Old+Treated+in+Emergency+Departments.">Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants &lt;/=60 Days Old Treated in Emergency Departments.</a> Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiology+and+Clinical+Features+of+Full-Term+Neonatal+Bacterial+Meningitis:+A+Multicenter+Retrospective+Cohort+Study.">Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).</li><li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Meningitis-Associated+Escherichia+coli.">Human Meningitis-Associated Escherichia coli.</a> EcoSal Plus. 7 (1), (2016).</li><li>Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity.">Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).</li><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+Molecules,+Functions+and+Pathophysiological+Aspects.">Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects.</a> Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).</li><li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+(ROS)+and+ROS-induced+ROS+release.">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li><li>Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+NADPH+oxidase+in+modulating+neutrophil+effector+responses.">The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses.</a> Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria.">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).</li><li>Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+roles+of+NOX2+NADPH+oxidase-derived+ROS+in+immunity.">The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity.</a> Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).</li><li>Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases:+an+overview+from+structure+to+innate+immunity-associated+pathologies.">NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).</li><li>Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+NADPH+Oxidase+and+Associated+Ion+Fluxes+During+Phagocytosis.">Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis.</a> Traffic. 14, 1118-1131 (2013).</li><li>Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Neutrophil+Oxidants:+From+Laboratory+Curiosity+to+Clinical+Reality.">Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality.</a> Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).</li><li>Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Reactive+Oxygen+Species+(ROS)+in+the+Formation+of+Extracellular+Traps+(ETs)+in+Humans.">The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans.</a> Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).</li><li>Haynes, A. P., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neutrophil+function+test.">neutrophil function test.</a> Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).</li><li>Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Neutrophil+Isolation+and+Degranulation+Responses+to+Yersinia+pestis+Infection.">Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection.</a> Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).</li><li>Siano, B., Oh, H., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Puleston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Mitochondrial+Mass,+Damage,+and+Reactive+Oxygen+Species+by+Flow+Cytometry.">Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).</li></ol>

Nøytrofiler fungerer som den mest tallrike komponenten av hvite blodlegemer i menneskelig blodsirkulasjon. De er viktige effektorceller i det medfødte menneskelige immunsystemet, som bygger den første forsvarslinjen mot invasjonen av patogener11. Genereringen av ROS representerer en av de viktigste bakteriedrepende mekanismene for nøytrofiler etter fagocytose11. Nyere studier har vist at en nettlignende struktur utgitt av en nøytrofil kalt nøytrofil ekstracellulær fe...

Neonatal bakteriell meningitt er en vanlig pediatrisk smittsom sykdom. Escherichia coli (E. coli) med en K1 kapsel er det vanligste Gram-negative patogenet som forårsaker neonatal bakteriell meningitt, som står for ca 80% av den totale forekomsten1,2,3. Til tross for fremskrittene i antimikrobiell kjemoterapi og støttende omsorg, er bakteriell meningitt fortsatt en av de mest ødeleggende forholdene med høy sykelighet ogdødelighet 4.
Forekomsten av neonatal bakteriell meningitt begynner vanligvis med bakterieemi forårsaket av innføring av patogene bakterier i perifer sirkulasjon fra de nyfødtes lokale lesjoner, etterfulgt av penetrasjon gjennom blod-hjernebarrieren (BBB) inn i hjernen, noe som resulterer i betennelse i meningene4. Utbruddet av bakterier avhenger av samspillet mellom bakterier og vert av immunceller, inkludert nøytrofiler og makrofager, etc. Nøytrofiler, som står for ~ 50-70% av hvite blodlegemer, er den første forsvarslinjen mot bakterielle infeksjoner5,6. Under invasjonen av bakterier rekrutteres de aktiverte nøytrofiler til de smittsomme stedene og frigjør reaktive oksygenarter (ROS) inkludert superoksidanion, hydrogenperoksid, hydroksylradikaler og singlet oksygen7. ROS gjennomgår redoksreaksjoner med cellemembranen, nukleinsyremolekyler og proteiner av bakteriene, noe som resulterer i skade og død av de invaderende bakteriene8. Mitokondriene er hovedstedet for ROS-produksjon i eukaryote celler, og ulike oksider (f.eks. nikotinamid adenin dinukleotidfosfat (NADPH) oksidasekompleks, lipoksygenasesystem, proteinkinase C og cyclooxygenase system) formidler produksjonen av ROS9,10. Sanntidsmålingen av produksjonen av ROS, som representerer den primære antimikrobielle mekanismen i nøytrofiler, er en nyttig metode for å studere vertsforsvar under bakterievertens interaksjon.
I denne protokollen ble den tidsavhengige ROS-produksjonen i nøytrofiler infisert med meningittisk E. coli kvantifisert med en fluorescerende ROS-sonde DHE, oppdaget av en sanntids fluorescensmikroplateleser. Denne metoden kan også brukes på vurdering av ROS-produksjon i andre pattedyrceller under patogenvertsinteraksjonen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>DINGGUO</td>
			<td>DH010-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autuomated cell counter</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>508BR03397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Carbinet</td>
			<td>Shanghai Lishen</td>
			<td>Hfsafe-1200Lcb2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>BD</td>
			<td>237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Changsha Xiangyi</td>
			<td>TDZ5-WS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>104821-25-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Cellmax</td>
			<td>SA211.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Hera Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Beyoitme</td>
			<td>S1819-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>13292-46-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 medium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E600027-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic shaker</td>
			<td>Shanghai Zhicheng</td>
			<td>ZWY-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) er de vanligste Gram-negative bakteriene som forårsaker neonatal meningitt. Forekomsten av bakterieemi og bakteriell penetrasjon gjennom blod-hjernebarrieren er uunnværlige trinn for utvikling av E. coli meningitt. Reaktive oksygenarter (ROS) representerer de viktigste bakteriedrepende mekanismene til nøytrofiler for å ødelegge de invaderte patogenene. I denne protokollen ble den tidsavhengige intracellulære ROS-produksjonen i nøytrofiler infisert med meningittisk E. coli kvantifisert ved hjelp av fluorescerende ROS-sonder oppdaget av en sanntids fluorescensmikroplateleser. Denne metoden kan også brukes på vurdering av ROS-produksjon i pattedyrceller under patogen-vert interaksjoner.

Ved hjelp av protokollen som er skissert i denne artikkelen, ble nøytrofiler isolert fra humant perifert blod og lastet med fluorescenssonde DHE for å oppdage endringene i ROS-nivåer som svar på E44-infeksjon. Her gir vi representative data som demonstrerer ROS-produksjonen fremkalt av E44-stammen bestemt av en mikroplateleser i sanntid. Ved å legge til E44-stammer ved en MOI på 100 økte ROS-nivåene umiddelbart og viste en kontinuerlig oppadgående trend med en tidsavhengig måte (figur 1</st...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli at JoVE.com

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli er den ledende årsaken til neonatal Gram-negativ bakteriell meningitt. Under bakterieinfeksjonen spiller reaktive oksygenarter produsert av nøytrofiler en stor bakteriedrepende rolle. Her introduserer vi en metode for å oppdage de reaktive oksygenarter i nøytrofiler som svar på meningitt E. coli.

Sanntids kvantifisering av reaktive oksygenarter i nøytrofiler smittet med meningittisk escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Escherichia Coli er de vanligste gram-negative bakteriene som forårsaker neonatal meningitt. Forekomsten av neonatal bakteriell meningitt begynner rent med bakterien og deretter trenger bakteriene i blodet gjennom blodhjernebarrieren for å forårsake meningitt. Nøytrofiler er den første forsvarslinjen mot bakterielle infeksjoner.Under bakterieinvasjon frigjør de aktive nøytrofiler ROS. ROS representerer de viktigste bakteriocidale mekanismene til vertsceller for å ødelegge de invaderende patogenene. Måling av produksjon av ROS i nøytrofiler er en nyttig metode for å starte vertens forsvar under bakterievertinteraksjon.Ta en enkelt bakteriell koloni fra platen med en steril pipette og legg den i fem milliliter Brain-Heart infusjonsmedium som inneholder Rifampicin i en konkav kolbe. Inkuber bakteriekulturen ved 37 centigrad, med 90 RPM i 17 timer i inkubasjons shaker. Sentrifuger de perifere blodprøvene ved 2000 RPM i fem minutter.Etter sentrifugering er blodprøvene delt inn i tre lag. Fra bunnen til toppen, det røde blodlegemerlaget, det hvite blodlegemerlaget og plasmalaget. Aspirer det hvite blodlegemerlaget til et nytt rør med en steril pipette.Tilsett tredelt rødblodscelle lysisbuffer. Bland blandingen grundig, og plasser ved romtemperatur i fem minutter. Sentrifuger røret ved 2000 RPM i fem minutter.Aspirer supernatanten helt og kast den. Gjenta lysisprosedyren for røde blodlegemer i en eller to ganger, til sedimentene blir hvite. Vask cellene ved å suspendere sedimentet på nytt med to milliliter PBS.Sentrifuger deretter røret ved 1000 RPM i fem minutter. Resuspend sedimentet med 15 mikroliter precode magnetisk celle sortering buffer for 15 millioner celler. Tilsett 15 mikroliter magnetiske mikrober og bland grundig.Inkuber blandingen ved fire centigrad i 30 minutter. Under normale forhold har det voksne mennesket omtrent fire til 10.000 hvite blodlegemer per mikroliterblod. Så kostnaden for totale hvite blodlegemer i fem milliliter menneskelig perifert blod, nesten mindre enn 50 millioner.Og 50 mikroliter magnetiske perler i 15 mikroliter magnetisk sorteringsbuffer er nok. Den normale prosentandelen av nøytrofiler er 50 til 70% av de totale hvite blodcellene. Så ca 10 millioner nøytrofiler kan fås fra fem milliliter blod.Vask cellene ved å legge til to milliliter magnetisk sorteringsbuffer, per 10 millioner celler til røret, og sentrifuger ved fire centigrade, 1, 200 RPM i 10 minutter. Monter den magnetiske kolonnen og skillehyllen. Kast supernatanten helt, og resuspender sedimentene med 500 mikroliter magnetisk sorteringsbuffer for opptil 100 millioner celler.Skyll kolonnen med tre milliliter magnetisk sorteringsbuffer. Påfør celleopphenget på kolonnen for å tillate nøytrofiler merket av de magnetiske perlene, festet til kolonnen. Vasket av de ikke-spesifikke spesifikke cellene ved å legge til tre milliliterbuffer i tre ganger, når kolonnereservoaret er tomt hver gang.Fjern kolonnen fra magnetseparatoren, og legg den i et nytt rør. Legg til fem milliliter magnetisk sorteringsbuffer i kolonnen. Skyv ut de magnetiske merkede cellene ved hjelp av et stempel.Sentrifuger røret ved 1200 o/min i fem minutter. Aspirer supernatanten helt, og resuspender sedimentet med ett milliliter kulturmedium. Bestem cellenummeret med en teller.Justerte cellekonsentrasjonen til 2 millioner per milliliter i kulturmediet som inneholder DHE fluorescenssonde. Plasser nøytrofiler i inkubatoren i 30 minutter for å laste DHE-sonden. Tildel cellefjæringen til en 96-brønns svart mikroplate med 200 mikroliter per brønn.Slå på mikroplateleseren. Sett temperaturen til 37 centigrade, velg fluorescens lesemodus, kinetisk lesetype, sett fluorescensbølgelengden. Velg plateformat.Bestem leseområdet. Mål fluorescensintensiteten hvert femte minutt i en time. Rist platen i tre sekunder før hver avlesning.Ta ut mikroplaten fra inkubatoren. Tilsett PMA- eller E44-stammer med tre repetisjoner. Sett platen i mikroplateleseren, trykk på startknappen for å starte analysen umiddelbart.Ved hjelp av protokollomrisset i denne artikkelen ble nøytrofiler isolert fra det menneskelige perifere blodet, og lastet med fluorescenssonde DHE. Ved å legge til PMA, intracellulær ROS i nøytrofiler, viste en betydelig økning fra 20 til 40 minutter, og nådde toppen på 60 minutter. Men jeg tror E44 stammer, ROS-produksjonen skjer umiddelbart og øker tiden avhengig.Uttrykket av ROS forårsaket av E44-stammen ligner det som er forårsaket av PMA. Påvisning av ROS-produksjon i nøytrofiler kan bidra til videre studie av de bakteriocidale mekanismene til nøytrofiler. I denne protokollen gir vi en enklere måte å oppdage ROS-produksjonen i nøytrofiler på en sanntids måte.Den enkle metoden kan også brukes til å overvåke ROS-produksjonen i andre vertscelletyper under vertsbakterieinteraksjoner.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-invasiv Model of Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infeksjon i Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrofiler og monocytter i mesenterisk Veins av intraMikros på bedøvet Mus i sanntid

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Ett-trinns Negativ kromatografiske rensing i<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofilaktiverende Protein overuttrykkes i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; I batch-modus

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Påvisning av enterohemorrhagiske Escherichia Coli kolonisering i Murine vert av ikke-invasiv i Vivo bioluminescens System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overekspresjon og rensing av menneske<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

En lettvinte protokoll for å generere Site-Specifically Acetylated proteiner i Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Måle Dengue Virus RNA i kultur nedbryting av infiserte celler av sanntids kvantitative polymerasekjedereaksjons

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

I Vivo Avbildning av reaktive oksygen arter i et murint sår modell

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Sanntid bildebehandling og kvantifisering av sopp Biofilm utvikling bruker en tofaset resirkulerende med System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...