Name: real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31670845, 31870832, 32000811) e pelo Programa de Distinto Professor da Província de Liaoning (LJH2018-35).

O sangue periférico dos voluntários aplicado nesta pesquisa foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do primeiro Hospital da Universidade Médica da China (#2020-2020-237-2).
1. Preparação de reagentes e meio de cultura
<ol><li>Prepare o tampão de lise de glóbulos vermelhos adicionando 8,29 g de NH4Cl, 1 g de KHCO3, 37,2 mgs de Na2EDTA em 1 L de água dupla destilada e ajuste o pH para 7,2-7.4. Remova as bactérias por filtragem usando filtr...

<ol>
	<li>Kim, K. 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Os neutrófilos agem como o componente mais abundante dos glóbulos brancos na circulação sanguínea humana. São importantes células efeitos no sistema imunológico humano inato, que constrói a primeira linha de defesa contra a invasão de patógenos11. A geração de ROS representa um dos principais mecanismos bactericidas de neutrófilos após a fagocitose11. Estudos recentes mostraram que uma estrutura semelhante a uma rede liberada por um neutrófilo chamado armadi...

Meningite bacteriana neonatal é uma doença infecciosa pediátrica comum. Escherichia coli (E. coli) com uma cápsula K1 é o patógeno Gram-negativo mais comum que causa meningite bacteriana neonatal, representando cerca de 80% da incidência total1,2,3. Apesar dos avanços na quimioterapia antimicrobiana e no cuidado de apoio, a meningite bacteriana ainda é uma das condições mais devastadoras com alta morbidade e mortalidade4.
A ocorrência de meningite bacteriana neonatal geralmente começa com a bacteremia causada pela entrada de bactérias patogênicas na circulação periférica das lesões locais dos recém-nascidos, seguida pela penetração através da barreira hemoencefálica (BBB) no cérebro, resultando na inflamação das meninges4. O surgimento da bacteremia depende da interação entre bactérias e células imunes hospedeiras, incluindo neutrófilos e macrófagos, etc. Os neutrófilos, que respondem por ~50-70% dos glóbulos brancos, são a primeira linha de defesa contra infecções bacterianas5,6. Durante a invasão de bactérias, os neutrófilos ativados são recrutados para os locais infecciosos e liberam espécies reativas de oxigênio (ROS), incluindo o ânion de superóxido, peróxido de hidrogênio, radicais hidróxil e oxigênio singlet7. O ROS sofre reações redox com a membrana celular, moléculas de ácido nucleico e proteínas da bactéria, resultando na lesão e morte da bactéria invasora8. A mitocôndria é o principal local da produção de ROS em células eucarióticas, e várias oxidases (por exemplo, nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) complexo oxidase, sistema lipoxygenase, proteína quinase C e sistema ciclooxygenase) mediam a produção de ROS9,10. A medição em tempo real da produção de ROS, representando o principal mecanismo antimicrobiano em neutrófilos, é um método útil para estudar a defesa hospedeira durante a interação bactérias-hospedeiras.
Neste protocolo, a produção de ROS dependente do tempo em neutrófilos infectados com meningite E. coli foi quantificada com uma sonda ROS fluorescente DHE, detectada por um leitor de microplaca de fluorescência em tempo real. Este método também pode ser aplicado à avaliação da produção de ROS em outras células mamíferas durante a interação patógeno-hospedeiro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>DINGGUO</td>
			<td>DH010-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autuomated cell counter</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>508BR03397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Carbinet</td>
			<td>Shanghai Lishen</td>
			<td>Hfsafe-1200Lcb2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>BD</td>
			<td>237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Changsha Xiangyi</td>
			<td>TDZ5-WS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>104821-25-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Cellmax</td>
			<td>SA211.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Hera Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Beyoitme</td>
			<td>S1819-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>13292-46-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 medium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E600027-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic shaker</td>
			<td>Shanghai Zhicheng</td>
			<td>ZWY-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) é a bactéria gram-negativa mais comum que causa meningite neonatal. A ocorrência de bacteremia e penetração bacteriana através da barreira hemencefálica são passos indispensáveis para o desenvolvimento da meningite E. coli. As espécies reativas de oxigênio (ROS) representam os principais mecanismos bactericidas dos neutrófilos para destruir os patógenos invadidos. Neste protocolo, a produção de ROS intracelular dependente do tempo em neutrófilos infectados com meningite E. coli foi quantificada por sondas ROS fluorescentes detectadas por um leitor de microplaca de fluorescência em tempo real. Este método também pode ser aplicado à avaliação da produção de ROS em células de mamíferos durante interações patógenos-hospedeiros.

Utilizando o protocolo descrito neste artigo, os neutrófilos foram isolados do sangue periférico humano e carregados com sonda de fluorescência DHE para detectar as alterações dos níveis de ROS em resposta à infecção pelo E44. Aqui, fornecemos dados representativos que demonstram a produção ROS evocada pela cepa E44 determinada por um leitor de microplapes em tempo real. Adicionando cepas E44 a um MOI de 100, os níveis de ROS aumentaram imediatamente e mostraram uma tendência contínua de alta com uma maneir...

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Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli é a principal causa de meningite bacteriana gram-negativa neonatal. Durante a infecção bacteriana, espécies reativas de oxigênio produzidas por neutrófilos desempenham um papel bactericida importante. Aqui introduzimos um método para detectar as espécies reativas de oxigênio em neutrófilos em resposta à meningite E. coli.

Quantificação em tempo real de espécies de oxigênio reativo em neutrófilos infectados com meningite escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Escherichia Coli é a bactéria gram-negativa mais comum que causa meningite neonatal. A ocorrência de meningite bacteriana neonatal começa puramente com a bacteremia e, em seguida, as bactérias no sangue penetram através da barreira cerebral sanguínea para causar meningite. Neutrófilos são a primeira linha de defesa contra as infecções bacterianas.Durante a invasão bacteriana, os neutrófilos ativos liberam ROS. A ROS representa os principais mecanismos bactericidais das células hospedeiras para destruir os patógenos invasores. Medir a produção de ROS em neutrófilos é um método útil para iniciar a defesa do hospedeiro durante a interação bactérias-hospedeiros.Pegue uma única colônia bacteriana da placa com uma pipeta estéril e coloque-a em um meio de infusão cérebro-coração de cinco mililitros contendo Rifampicina em um frasco côncavo. Incubar a cultura bacteriana em 37 centígrados, com 90 RPM por 17 horas no shaker de incubação. Centrifugar as amostras de sangue periférico a 2000 RPM por cinco minutos.Após centrífuga, as amostras de sangue são divididas em três camadas. De baixo para cima, a camada de glóbulos vermelhos, a camada de glóbulos brancos e a camada de plasma. Aspire a camada de glóbulos brancos em um novo tubo com uma pipeta estéril.Adicione três vezes o tampão de lise de glóbulos vermelhos. Misture bem a mistura e coloque em temperatura ambiente por cinco minutos. Centrifugar o tubo a 2000 RPM por cinco minutos.Aspire completamente o supernatante e descarte. Repita o procedimento de lise de glóbulos vermelhos por uma ou duas vezes, até que os sedimentos se adoeçam. Lave as células suspendendo o sedimento com dois mililitros pbs.Em seguida, centrifugar o tubo a 1000 RPM por cinco minutos. Resuspense o sedimento com 15 microliter precode-cell sorting buffer para 15 milhões de células. Adicione 15 microesferas magnéticas microfeitiças e misture bem.Incubar a mistura a quatro centígrados por 30 minutos. Em condições normais, o ser humano adulto tem cerca de 4 a 10.000 glóbulos brancos por sangue microliter. Assim, o custo total de glóbulos brancos em cinco mililitros de sangue periférico humano, quase menos de 50 milhões.E 50 contas magnéticas de microliter em 15 tampão magnético microliter é suficiente. A porcentagem normal dos neutrófilos é de 50 a 70% do total de glóbulos brancos. Assim, cerca de 10 milhões de neutrófilos podem ser obtidos a partir de cinco mililitros de sangue.Lave as células adicionando dois amortecedores magnéticos mililitros, por 10 milhões de células ao tubo, e centrífuga a quatro centícaros, 1.200 RPM por 10 minutos. Monte a coluna magnética e a prateleira de separação. Descarte o supernascer completamente, e resuspenque os sedimentos com 500 tampão de triagem magnética microliter para até 100 milhões de células.Enxágüe a coluna com três mililitros de tampão magnético. Aplique a suspensão celular na coluna para permitir que os neutrófilos rotulados pelas contas magnéticas, anexadas à coluna. Lavei as células específicas não específicas adicionando três mililitros tampão por três vezes, uma vez que o reservatório da coluna está vazio cada vez.Remova a coluna do separador magnético e coloque-a em um novo tubo. Adicione um tampão magnético de cinco mililitros na coluna. Empurre as células magnéticas rotuladas usando um êmbolo.Centrifugar o tubo a 1.200 RPM por cinco minutos. Aspire completamente o supernaente, e resuspense o sedimento com um meio de cultura mililitro. Determine o número do celular com um contador.Ajustou a concentração celular para 2 milhões por mililitro no meio de cultura contendo sonda de fluorescência DHE. Coloque os neutrófilos na incubadora por 30 minutos para carregar a sonda DHE. Aloque a suspensão celular para uma microplacão preta de 96 poços com 200 microliter por poço.Ligue o leitor de microplacões. Defina a temperatura para 37 centígrados, escolha o modo de leitura da fluorescência, o tipo de leitura cinética, defina o comprimento de onda da fluorescência. Escolha o formato da placa.Determine a área de leitura. Meça a intensidade da fluorescência a cada cinco minutos por uma hora. Agite a placa por três segundos antes de cada leitura.Retire a microplaca da incubadora. Adicione cepas PMA ou E44 com três repetições. Coloque a placa no leitor de microplacões, pressione o botão iniciar para iniciar o ensaio imediatamente.Usando o esboço do protocolo neste artigo, os neutrófilos foram isolados do sangue periférico humano, e carregados com sonda de fluorescência DHE. Adicionando PMA, ROS intracelular em neutrófilos, mostrou um aumento significativo de 20 para 40 minutos, e atingiu o pico em 60 minutos. Mas eu acho que a produção de E44 ocorre imediatamente e aumenta o tempo dependente.A expressão de ROS causada pela cepa E44 é semelhante à causada pelo PMA. A detecção da produção de ROS em neutrófilos pode contribuir para o estudo mais aprofundado dos mecanismos bacteriocidas dos neutrófilos. Neste protocolo, fornecemos uma maneira mais fácil de detectar a produção de ROS em neutrófilos de forma em tempo real.O método simples também poderia ser usado para monitorar a produção de ROS em outros tipos de células hospedeiras durante as interações hospedeira-bactérias.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

A observação direta de Fagocitose e NET-formação por neutrófilos em pulmões infectados usando dois fótons Microscopia

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Imunologia e Infecção

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Modelo não-invasiva da neuropatogênicos<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infecção no Rato Neonatal

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Um passo de purificação cromatográfica de Negativo<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrófilos-proteína de activação sobre-expresso em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Em Modo Batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Um protocolo Facile para gerar proteínas Site-Specifically acetiladas em Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Dengue vírus RNA no sobrenadante de cultura de células infectadas por reação em cadeia da polimerase em tempo real de quantitativos de medição

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Imagem em tempo real e quantificação de fungos biofilme desenvolvimento usando um sistema bifásico de fluxo de recirculação

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...